庚型肝炎病毒不同基因区的聚合酶链反应扩增
作者：潘修成 魏来 吴文漪
单位：徐州医学院附属医院传染科
关键词：庚型肝炎病毒；基因；聚合酶链反应
临床检验杂志990511 摘要 分别在庚型肝炎病毒(HGV)基因5′端非编码区(5′-UTR)、非结构(NS)3区及非结构(NS)5区设计套式引物，建立逆转录套式聚合酶链反应(RT-nested PCR)检测血清HGV RNA。在299份不同血清标本中HGV RNA阳性者41例，基于5′-UTR、NS 3区及NS 5区引物PCR的阳性率分别为87.8%、80.5%和97.6%。本研究结果表明根据中国株HGV基因NS 5区部分序列设计引物建立的RT-nested PCR更灵敏、实用。可用于对HGV感染流行病学及临床的研究。
Detection of hepatitis G Virus by polymerase chain reaction with primers deduced from different gene region
, 百拇医药
PAN Xiucheng,WEI Lai,WU Wenyi(Department of Infectious Disease,Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College,221002)
Abstract A reverse transcription polymerase chain reaction assay with nested primers(RT-nested PCR)deduced from either the untranslated region(5′-UTR)，nonstructural region 3(NS3)or nonstructural region 5(NS5)of the hepatitis G Virus genome was established to detect serum HGV RNA.Serum HGV RNA was tested in 299 at risk individuals.Of 299 serum specimen,41(13.7%)were positive for HGV RNA,the positive rate of detection with primer deduced from 5′-UTR、NS3 and NS5 were 87.8%、80.5% and 97.6% respectively.The results of this study suggest that PCR assays to detect HGV RNA with primers deduced from the sequece of partial NS 5 gene of HGV in chinese patients was more sensitive and practical,and could be used to study the HGV infection in China.
, 百拇医药
Key words Hepatitis G virus; Gene; Polymerase chain reaction
自1996年庚型肝炎病毒(HGV)及其序列被报道以来，血清HGV RNA的聚合酶链反应(PCR)检测方法也随之建立[1、2]。但由于基因的变异，PCR检测HGV RNA敏感性因引物的不同而存在较大差异。为比较HGV基因不同区PCR扩增的效率，本文运用HGV基因5′端非编码区(5′-UTR)、非结构(NS)3区及非结构(NS)5区引物，分别对299份不同血清标本进行PCR扩增。
1 材料和方法
1.1 血清标本 1996年10月～1997年12月收集不同人群血清标本299份，其中职业献血员40例；血液透析患者31例，为本院血透中心收治的慢性肾功能衰竭患者；各型病毒性肝炎228例，为本院肝炎门诊及住院病人。所有血清均一次分装，-20°C保存。
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1.2 试剂 异硫氰酸胍为Sigma产品，dTTP、dATP、dCTP、dGTP为华美公司产品，AMV逆转录酶及Taq-酶为promega产品。
1.3 引物合成 参照Leary[2]和Linnen[1]报道的序列，分别在HGV 5′-UTR及NS 3区设计一对套式引物。NS 5区引物根据报道的中国人HGV基因NS 5区保守核苷酸序列设计[3、4]，由赛百盛生物工程公司合成引物。引物序列如表1。
1.4 逆转录套式PCR扩增HGV RNA 按文献[4]的程序提取HGV RNA并逆转录。两次PCR各扩增30个循环。扩增终产物经6 g/dl聚丙烯酰胺凝胶电泳后观察结果。目的产物长度在5′-UTR及NS 5区为210 bp,NS 3区为157 bp。
2 结果
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2.1 HGV基因不同区PCR的电泳结果 阳性标本5′-UTR及NS 5区扩增产物210 bp,NS 3区157 bp,与预期大小一致。其中标本3、5、7为同一份血清样本，但该标本HGV PCR扩增结果在5′-UTR及NS 5区为阳性，而NS 3区为阴性(图1)。
Positive sample:1、3、4(5′-UTR)，6(NS3 Region),7、9(NS5 region)
Negative sample:2(5′-UTR)，5(NS3 region),8(NS5 region)
M:DNA marker.
Figure 1 Electrophoresis of PCR for HGV RNA by primers from different region of HGV genome
, 百拇医药
图1 HGV基因不同区的PCR电泳结果
表1 HGV基因不同区引物序列
Table 1 Oligonucleotide primers from different
regions of HGV genome Primer
Sequence(5′→3′)
Position*
NS 5区
11R
GC(AG)TCCACACAGATGGCACA
7994～8013
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2F
GTTACACTTATGAGGA(AG)GC
7614～7632
3R
CTGGTTGGGGGTGTACTGG
7930～7948
4F
GAGATACTTGAAGGGACTCC
7739～7758
NS 3区
31#
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GACGTGGGCGAGATTCCCTT
4257～4276
32#
CGAAGTTTCC(AT)GTGTACCC
4476～4494
33#
ATGGGCATGGAATACCCCTCGAGCG
4279～4303
34#
TC(CT)TTGATGAT(AGT)GAACTGTC
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4419～4435
5′-UTR
G1
GGCCAAAAGGTGGTGGATGG
101～120
G2
ATTGAAGGGCGACGTGGACC
331～350
G3
GTGATGACAGGGTTGGTAGG
121～140
, 百拇医药
G4
GTACGTGGGCGTCGTTTGCC
311～330
*NS5 region based on the prototype HGV genome(HGU36380),5′-UTR,NS3 region based on HGU44402
2.2 HGV基因不同区PCR扩增结果 299份血清标本中HGV RNA阳性者41例(13.7%)，其中基于NS 5区引物PCR检出率最高，为97.6%(40/41)，其次为5′-UTR，检测率为87.8%(36/41),NS 3区检测率较低，为80.5%(33/41)，见表2。
2.3 随机挑取1份5′-UTR、NS 3区及NS 5区PCR扩增HGV RNA均为阳性的血清样品，将血清按10-1～10-5系列稀释后，分别进行5′-UTR，NS 3区及NS 5区PCR扩增，结果，HGV RNA PCR扩增水平在5′-UTR及NS 5区为10-3,在NS 3区为10-2。表2 HGV基因不同区PCR扩增结果
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Table 2 Positivity of HGV RNA by primers from
different regions of viral genome PCR amplification by primers from different
regions of HGV genome
cases(%)
5′-UTR
NS5NS3
5′-UTRNS5NS3
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5′-UTRNS5NS3
5′-UTRNS5NS3
5′-UTRNS5NS3
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Total
31(75.6)
4(9.8)
1(2.4)
4(9.8)
4(2.4)
41(100.0)
3 讨论
HGV基因不同区变异程度如何，目前尚不完全了解。多数资料显示HGV基因以5′-UTR、NS 5区及NS 3区较保守，其中5′-UTR及NS 5区保守性较高，而NS 3区变异较大。如台湾地区HGV基因NS 3区部分基因序列同源性81%～94%，国外报道的相应序列同源性为70%～89%。本文结果表明，与NS 5区及5′-UTR引物相比，基于NS 3区引物PCR检测率较低，并且检测血清HGV RNA水平敏感性至少低于NS 5区或5′-UTR的10倍，提示NS 3区PCR扩增敏感性较低，同时也反映了该区核苷酸序列变异可能较大，既便引物中加入混合碱基，仍不能适应引物所在序列变异的需要。
, 百拇医药
目前普遍认为HGV不同基因区以5′-UTR最为保守，但与HCV相比，HGV基因5′-UTR保守性偏低，一般不同HCV基因型间5′-UTR同源性在95%以上，同一亚型内不同HCV株间5′-UTR同源性达99%以上。有报道来自不同地区HGV基因5′-UTR异源性可达10%以上，并且HGV 5′-UTR存在基因插入和缺失突变，因此根据HGV基因5′-UTR引物建立PCR仍可能得出假阴性结果。本文41例HGV RNA阳性者中，有5例未能检出，但5′-UTR PCR扩增对血清HGV RNA水平检测的敏感性较高，为NS 3区的10倍。因此作者以为由于HGV 5′-UTR序列与其他病毒同源性低，在此区设计引物特异性较强，若根据多株中国HGV基因5′-UTR保守序列设计引物，PCR检测率将会得到进一步提高。
国内报道[3，4]的8株中国人HGV基因NS 5区部分核苷酸序列同源性在90%以上，与国外HGV序列同源性大于87%，提示该区序列保守性较高。以该区保守序列设计引物，对血清HGV RNA进行PCR扩增，结果发现HGV RNA阳性检测率较高，达97.6%，对HGV RNA水平检测敏感性为NS 3区PCR扩增的10倍，说明根据中国人HGV基因序列的NS 5区引物PCR更灵敏、实用，国内可应用于对HGV感染的流行病学及临床研究。
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参考文献
1 Linnen J,Wages J,Zhang-Keck Z Y,et al.Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus:a transfusion-transmissible agent.Science,1996,271:505
2 Leary T P.Murhoff A F,Simons J N,et al.Sequence and genomic orgnization of GBV-C：a novel member of the flaviviride associated with human non-A～E hepatitis.J Med Virology,1996,48:60
3 魏来，常锦红，陶其敏，等.肝癌病人血清中庚型肝炎病毒非结构基因(NS)5区cDNA的序列分析.中华实验和临床病毒学杂志，1996，10(4)：301
4 Chang J H,Wei L,Tao Q M.Primary structure and variability of partial nonstructural gene 5 region of hepatitis G virus.Chinese med J,1997,110(10):764
(1998-07-25收稿，1999-03-26修回), 百拇医药
单位：徐州医学院附属医院传染科
关键词：庚型肝炎病毒；基因；聚合酶链反应
临床检验杂志990511 摘要 分别在庚型肝炎病毒(HGV)基因5′端非编码区(5′-UTR)、非结构(NS)3区及非结构(NS)5区设计套式引物，建立逆转录套式聚合酶链反应(RT-nested PCR)检测血清HGV RNA。在299份不同血清标本中HGV RNA阳性者41例，基于5′-UTR、NS 3区及NS 5区引物PCR的阳性率分别为87.8%、80.5%和97.6%。本研究结果表明根据中国株HGV基因NS 5区部分序列设计引物建立的RT-nested PCR更灵敏、实用。可用于对HGV感染流行病学及临床的研究。
Detection of hepatitis G Virus by polymerase chain reaction with primers deduced from different gene region
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PAN Xiucheng,WEI Lai,WU Wenyi(Department of Infectious Disease,Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College,221002)
Abstract A reverse transcription polymerase chain reaction assay with nested primers(RT-nested PCR)deduced from either the untranslated region(5′-UTR)，nonstructural region 3(NS3)or nonstructural region 5(NS5)of the hepatitis G Virus genome was established to detect serum HGV RNA.Serum HGV RNA was tested in 299 at risk individuals.Of 299 serum specimen,41(13.7%)were positive for HGV RNA,the positive rate of detection with primer deduced from 5′-UTR、NS3 and NS5 were 87.8%、80.5% and 97.6% respectively.The results of this study suggest that PCR assays to detect HGV RNA with primers deduced from the sequece of partial NS 5 gene of HGV in chinese patients was more sensitive and practical,and could be used to study the HGV infection in China.
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Key words Hepatitis G virus; Gene; Polymerase chain reaction
自1996年庚型肝炎病毒(HGV)及其序列被报道以来，血清HGV RNA的聚合酶链反应(PCR)检测方法也随之建立[1、2]。但由于基因的变异，PCR检测HGV RNA敏感性因引物的不同而存在较大差异。为比较HGV基因不同区PCR扩增的效率，本文运用HGV基因5′端非编码区(5′-UTR)、非结构(NS)3区及非结构(NS)5区引物，分别对299份不同血清标本进行PCR扩增。
1 材料和方法
1.1 血清标本 1996年10月～1997年12月收集不同人群血清标本299份，其中职业献血员40例；血液透析患者31例，为本院血透中心收治的慢性肾功能衰竭患者；各型病毒性肝炎228例，为本院肝炎门诊及住院病人。所有血清均一次分装，-20°C保存。
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1.2 试剂 异硫氰酸胍为Sigma产品，dTTP、dATP、dCTP、dGTP为华美公司产品，AMV逆转录酶及Taq-酶为promega产品。
1.3 引物合成 参照Leary[2]和Linnen[1]报道的序列，分别在HGV 5′-UTR及NS 3区设计一对套式引物。NS 5区引物根据报道的中国人HGV基因NS 5区保守核苷酸序列设计[3、4]，由赛百盛生物工程公司合成引物。引物序列如表1。
1.4 逆转录套式PCR扩增HGV RNA 按文献[4]的程序提取HGV RNA并逆转录。两次PCR各扩增30个循环。扩增终产物经6 g/dl聚丙烯酰胺凝胶电泳后观察结果。目的产物长度在5′-UTR及NS 5区为210 bp,NS 3区为157 bp。
2 结果
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2.1 HGV基因不同区PCR的电泳结果 阳性标本5′-UTR及NS 5区扩增产物210 bp,NS 3区157 bp,与预期大小一致。其中标本3、5、7为同一份血清样本，但该标本HGV PCR扩增结果在5′-UTR及NS 5区为阳性，而NS 3区为阴性(图1)。
Positive sample:1、3、4(5′-UTR)，6(NS3 Region),7、9(NS5 region)
Negative sample:2(5′-UTR)，5(NS3 region),8(NS5 region)
M:DNA marker.
Figure 1 Electrophoresis of PCR for HGV RNA by primers from different region of HGV genome
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图1 HGV基因不同区的PCR电泳结果
表1 HGV基因不同区引物序列
Table 1 Oligonucleotide primers from different
regions of HGV genome Primer
Sequence(5′→3′)
Position*
NS 5区
11R
GC(AG)TCCACACAGATGGCACA
7994～8013
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2F
GTTACACTTATGAGGA(AG)GC
7614～7632
3R
CTGGTTGGGGGTGTACTGG
7930～7948
4F
GAGATACTTGAAGGGACTCC
7739～7758
NS 3区
31#
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GACGTGGGCGAGATTCCCTT
4257～4276
32#
CGAAGTTTCC(AT)GTGTACCC
4476～4494
33#
ATGGGCATGGAATACCCCTCGAGCG
4279～4303
34#
TC(CT)TTGATGAT(AGT)GAACTGTC
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5′-UTR
G1
GGCCAAAAGGTGGTGGATGG
101～120
G2
ATTGAAGGGCGACGTGGACC
331～350
G3
GTGATGACAGGGTTGGTAGG
121～140
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G4
GTACGTGGGCGTCGTTTGCC
311～330
*NS5 region based on the prototype HGV genome(HGU36380),5′-UTR,NS3 region based on HGU44402
2.2 HGV基因不同区PCR扩增结果 299份血清标本中HGV RNA阳性者41例(13.7%)，其中基于NS 5区引物PCR检出率最高，为97.6%(40/41)，其次为5′-UTR，检测率为87.8%(36/41),NS 3区检测率较低，为80.5%(33/41)，见表2。
2.3 随机挑取1份5′-UTR、NS 3区及NS 5区PCR扩增HGV RNA均为阳性的血清样品，将血清按10-1～10-5系列稀释后，分别进行5′-UTR，NS 3区及NS 5区PCR扩增，结果，HGV RNA PCR扩增水平在5′-UTR及NS 5区为10-3,在NS 3区为10-2。表2 HGV基因不同区PCR扩增结果
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Table 2 Positivity of HGV RNA by primers from
different regions of viral genome PCR amplification by primers from different
regions of HGV genome
cases(%)
5′-UTR
NS5NS35′-UTR
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5′-UTR
NS5NS35′-UTR
NS5NS35′-UTR
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Total
31(75.6)
4(9.8)
1(2.4)
4(9.8)
4(2.4)
41(100.0)
3 讨论
HGV基因不同区变异程度如何，目前尚不完全了解。多数资料显示HGV基因以5′-UTR、NS 5区及NS 3区较保守，其中5′-UTR及NS 5区保守性较高，而NS 3区变异较大。如台湾地区HGV基因NS 3区部分基因序列同源性81%～94%，国外报道的相应序列同源性为70%～89%。本文结果表明，与NS 5区及5′-UTR引物相比，基于NS 3区引物PCR检测率较低，并且检测血清HGV RNA水平敏感性至少低于NS 5区或5′-UTR的10倍，提示NS 3区PCR扩增敏感性较低，同时也反映了该区核苷酸序列变异可能较大，既便引物中加入混合碱基，仍不能适应引物所在序列变异的需要。
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目前普遍认为HGV不同基因区以5′-UTR最为保守，但与HCV相比，HGV基因5′-UTR保守性偏低，一般不同HCV基因型间5′-UTR同源性在95%以上，同一亚型内不同HCV株间5′-UTR同源性达99%以上。有报道来自不同地区HGV基因5′-UTR异源性可达10%以上，并且HGV 5′-UTR存在基因插入和缺失突变，因此根据HGV基因5′-UTR引物建立PCR仍可能得出假阴性结果。本文41例HGV RNA阳性者中，有5例未能检出，但5′-UTR PCR扩增对血清HGV RNA水平检测的敏感性较高，为NS 3区的10倍。因此作者以为由于HGV 5′-UTR序列与其他病毒同源性低，在此区设计引物特异性较强，若根据多株中国HGV基因5′-UTR保守序列设计引物，PCR检测率将会得到进一步提高。
国内报道[3，4]的8株中国人HGV基因NS 5区部分核苷酸序列同源性在90%以上，与国外HGV序列同源性大于87%，提示该区序列保守性较高。以该区保守序列设计引物，对血清HGV RNA进行PCR扩增，结果发现HGV RNA阳性检测率较高，达97.6%，对HGV RNA水平检测敏感性为NS 3区PCR扩增的10倍，说明根据中国人HGV基因序列的NS 5区引物PCR更灵敏、实用，国内可应用于对HGV感染的流行病学及临床研究。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Linnen J,Wages J,Zhang-Keck Z Y,et al.Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus:a transfusion-transmissible agent.Science,1996,271:505
2 Leary T P.Murhoff A F,Simons J N,et al.Sequence and genomic orgnization of GBV-C：a novel member of the flaviviride associated with human non-A～E hepatitis.J Med Virology,1996,48:60
3 魏来，常锦红，陶其敏，等.肝癌病人血清中庚型肝炎病毒非结构基因(NS)5区cDNA的序列分析.中华实验和临床病毒学杂志，1996，10(4)：301
4 Chang J H,Wei L,Tao Q M.Primary structure and variability of partial nonstructural gene 5 region of hepatitis G virus.Chinese med J,1997,110(10):764
(1998-07-25收稿，1999-03-26修回), 百拇医药