PCR-ELISA测定端粒酶活性及其初步临床应用
作者：周祖钊 黄瑾 潘泽民 朱文雅 张玉兰 李锋 陆天才 李洪安
单位：石河子大学医学院
关键词：恶性肿瘤；端粒酶；白血病；端粒重复片断扩增法；聚合酶联反应
临床检验杂志990508 端粒酶(telomerase)定位于染色体端粒(区)的核酸-蛋白复合体中。端粒酶以复合体中的RNA为模板，在端粒DNA的3末端，以逆转录方式延伸，从而修复DNA末端因复制问题所致的缺损。避免了染色体末端间的融合。是染色体保持稳定的重要机制之一[1]。1994年，自Kim等报道了端粒重复片断扩增法(telomeric repeat amplification protocol,TRAP)[2]以来，国外报道骤增，国内近年也有多篇文献综述[3]及研究报道[4，5]。我们采用的方法是在TRAP基础上发展的PCR-ELISA法，检测了常见实体性肿瘤及白血病骨髓细胞的端粒酶活性，并探讨其在肿瘤的诊断、良性与恶性的鉴别以及白血病的疗效评价中的意义。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 标本来源 外科手术取样47例，其中包括：肺、乳腺、肝、胃、食道及结，直肠肿瘤组织；骨髓穿刺液35例，其中急性白血病23例，感染性贫血、再生障碍性贫血各1例，其他炎症反应10例，总计113例。所有标本不加任何防腐剂，尽快冻存备作病理学检查及端粒酶活性检测。
1.2 方法 PCR-ELISA，试剂由Boehringer Mannheim公司提供。
1.2.1 组织处理 冰冻切片30～50张(10～25 μm)加去垢剂200 μl；内窥镜标本(粟粒大)加去垢剂50 μl；骨髓液100 μl，先用PBS于0.5 ml试管中离心洗去髓浆后，吸取界面的有核细胞层3 μl，加去垢剂100 μl冰冻裂解30分钟。4°C，16 000 r/min离心15分钟，取上层液备检。
1.2.2 操作原理[6] 组织经裂解提取的端粒酶-RNA在25°C条件下逆转录生成端粒酶特征的TTAGGG重复片段，并连接到生物素标记的引物上，PCR扩增。PCR产物与地高辛(Dig)标记的探针杂交；杂交双链的生物素基团与固相包被的链霉亲和素结合，Dig基团则与随后加入的POD-抗Dig结合，POD作用底物TMB呈色，酶标仪检测，以A≥0.05为阳性。
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2 结果
2.1 经病理诊断确诊的恶性实体瘤和确诊的未缓解的白血病共计79例，检出端粒酶活性68例，敏感度为86.1%；良性肿瘤、非肿瘤性贫血及各类炎症反应共26例，端粒酶阴性23例，特异性为88.5%。
2.2 64例恶性实体瘤检出端粒酶活性56例，检出率显著高于良性肿瘤(2/14)和非肿瘤性贫血及炎症反应(1/12)。经卡方检验(已校正)，P分别<0.01和<0.005；15例急性白血病(未缓解)检出12例，而已缓解的8例白血病，检出仅2例。
2.3 各类恶性实体瘤之间的阳性检出率比较 阳性检出率为：胃癌17/20，食道癌10/14，结(直)肠癌7/8，肝癌10/11，乳癌4/5，肺癌2/2，其他(软组织瘤、甲状腺癌、膀胱癌、颗粒性卵巢瘤各1例)3/4。结果初步显示来源不同的肿瘤端粒酶活性无显著差异。
3 讨论
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端粒酶的阳性检出率与标本贮存的温度和时间关系密切。本研究的前期，标本零星收集贮存于普通冰箱冷冻室(-15°C左右)时间较久，部分标本端粒复合体中的RNA可能被降解致假阴性，后阶段，标本贮于-80°C，检出率明显提高。形态学检查与测酶活性，虽同一检材，但仍存在取样部位差异，这可能是某些病例二者不相符合的原因。
参考文献
1 Dahse R,Fiedler w,Ernst G.Telomeres and telomerase:Biological and clinical importance.Clinical Chemistry 1997，43(5)：708
2 Kim N W,Piatyszek M A,Prowse K R,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cell and cancer.Science,1994.266：2011
3 陆敏.端粒、端粒酶与恶性肿瘤.国外医学遗传分册，1996，19(3)：125
4 吴敏，刘宗石，李晓明.原发性肝癌及慢性肝脏病端粒酶活性研究.中华病理学杂志，1998，27(2)：91
5 张莉萍，蒋纪恺，刘祥贵.骤合酶链反应检测肿瘤细胞株的端粒酶活性.中华医学检验杂志，1998，21(3)：139
6 周祖钊，张玉兰.端粒酶活性检测及其意义.农垦医学，1998，20(1)：56
(1998-09-07收稿，1999-06-01修回), 百拇医药
单位：石河子大学医学院
关键词：恶性肿瘤；端粒酶；白血病；端粒重复片断扩增法；聚合酶联反应
临床检验杂志990508 端粒酶(telomerase)定位于染色体端粒(区)的核酸-蛋白复合体中。端粒酶以复合体中的RNA为模板，在端粒DNA的3末端，以逆转录方式延伸，从而修复DNA末端因复制问题所致的缺损。避免了染色体末端间的融合。是染色体保持稳定的重要机制之一[1]。1994年，自Kim等报道了端粒重复片断扩增法(telomeric repeat amplification protocol,TRAP)[2]以来，国外报道骤增，国内近年也有多篇文献综述[3]及研究报道[4，5]。我们采用的方法是在TRAP基础上发展的PCR-ELISA法，检测了常见实体性肿瘤及白血病骨髓细胞的端粒酶活性，并探讨其在肿瘤的诊断、良性与恶性的鉴别以及白血病的疗效评价中的意义。
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1 材料与方法
1.1 标本来源 外科手术取样47例，其中包括：肺、乳腺、肝、胃、食道及结，直肠肿瘤组织；骨髓穿刺液35例，其中急性白血病23例，感染性贫血、再生障碍性贫血各1例，其他炎症反应10例，总计113例。所有标本不加任何防腐剂，尽快冻存备作病理学检查及端粒酶活性检测。
1.2 方法 PCR-ELISA，试剂由Boehringer Mannheim公司提供。
1.2.1 组织处理 冰冻切片30～50张(10～25 μm)加去垢剂200 μl；内窥镜标本(粟粒大)加去垢剂50 μl；骨髓液100 μl，先用PBS于0.5 ml试管中离心洗去髓浆后，吸取界面的有核细胞层3 μl，加去垢剂100 μl冰冻裂解30分钟。4°C，16 000 r/min离心15分钟，取上层液备检。
1.2.2 操作原理[6] 组织经裂解提取的端粒酶-RNA在25°C条件下逆转录生成端粒酶特征的TTAGGG重复片段，并连接到生物素标记的引物上，PCR扩增。PCR产物与地高辛(Dig)标记的探针杂交；杂交双链的生物素基团与固相包被的链霉亲和素结合，Dig基团则与随后加入的POD-抗Dig结合，POD作用底物TMB呈色，酶标仪检测，以A≥0.05为阳性。
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2 结果
2.1 经病理诊断确诊的恶性实体瘤和确诊的未缓解的白血病共计79例，检出端粒酶活性68例，敏感度为86.1%；良性肿瘤、非肿瘤性贫血及各类炎症反应共26例，端粒酶阴性23例，特异性为88.5%。
2.2 64例恶性实体瘤检出端粒酶活性56例，检出率显著高于良性肿瘤(2/14)和非肿瘤性贫血及炎症反应(1/12)。经卡方检验(已校正)，P分别<0.01和<0.005；15例急性白血病(未缓解)检出12例，而已缓解的8例白血病，检出仅2例。
2.3 各类恶性实体瘤之间的阳性检出率比较 阳性检出率为：胃癌17/20，食道癌10/14，结(直)肠癌7/8，肝癌10/11，乳癌4/5，肺癌2/2，其他(软组织瘤、甲状腺癌、膀胱癌、颗粒性卵巢瘤各1例)3/4。结果初步显示来源不同的肿瘤端粒酶活性无显著差异。
3 讨论
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端粒酶的阳性检出率与标本贮存的温度和时间关系密切。本研究的前期，标本零星收集贮存于普通冰箱冷冻室(-15°C左右)时间较久，部分标本端粒复合体中的RNA可能被降解致假阴性，后阶段，标本贮于-80°C，检出率明显提高。形态学检查与测酶活性，虽同一检材，但仍存在取样部位差异，这可能是某些病例二者不相符合的原因。
参考文献
1 Dahse R,Fiedler w,Ernst G.Telomeres and telomerase:Biological and clinical importance.Clinical Chemistry 1997，43(5)：708
2 Kim N W,Piatyszek M A,Prowse K R,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cell and cancer.Science,1994.266：2011
3 陆敏.端粒、端粒酶与恶性肿瘤.国外医学遗传分册，1996，19(3)：125
4 吴敏，刘宗石，李晓明.原发性肝癌及慢性肝脏病端粒酶活性研究.中华病理学杂志，1998，27(2)：91
5 张莉萍，蒋纪恺，刘祥贵.骤合酶链反应检测肿瘤细胞株的端粒酶活性.中华医学检验杂志，1998，21(3)：139
6 周祖钊，张玉兰.端粒酶活性检测及其意义.农垦医学，1998，20(1)：56
(1998-09-07收稿，1999-06-01修回), 百拇医药