毛细管电泳测定血浆中的谷氨酸
作者：郭文茹 黄繁嫱
单位：天津市第一中心医院检验学部
关键词：毛细管电泳；谷氨酸
临床检验杂志990505 摘要 建立毛细管电泳法测定血浆中谷氨酸的方法。采用胶束电动力学毛细管色谱法，用贝克曼公司P/ACE System 5000毛细管电泳仪进行血浆中谷氨酸的测定。电场电压15 kV，毛细管工作温度20°C，压力进样5秒，毛细管规格为75 μm ID×37 cm，紫外检测波长为214 nm，缓冲液为20 mmol/L，硼酸盐缓冲液(pH 9.0)，含102.5 mmol/L SDS，3%甲醇。结果表明，谷氨酸在6.8～340.0 (μmol/L)范围内，有良好的线性。r2＝0.9995，批内变异系数CV＝3.28%，批间变异系数CV＝5.29%，样品回收率在84.3%～110.9%之间，样品衍生后应在两天内测定。该方法具有自动化、分析速度快、分离效果好、所用试剂和样品少，成本低等优点，有一定的临床应用价值。
, 百拇医药
目前普遍使用的氨基酸分析方法为离子交换色谱法和反相高效液相色谱法，这两种方法各有其优点，但也存在共同的弊病即分析时间长、试剂成本太高。我们建立了毛细管电泳法测定血浆中谷氨酸的方法，克服了上述两种方法的缺点。
1 材料
1.1 仪器 Beckman P/ACE System 5000电泳仪。IBM PC电脑(PACE工作站)。未涂层熔融石英毛细管：75 μm ID×37 cm(永年光导纤维厂)。紫外检测器(包括214 nm、254 nm、280 nm、200 nm四个滤光片)。毛细管卡盒(Beckman公司)。pH计(Beckman公司)。
1.2 试剂 L-谷氨酸(Sigma公司，G5638)。丹酰氯(dansyl chloride，缩写DNS-Cl,Sigma公司，D2625)。本实验用试剂均为分析纯，实验用水为亚沸重蒸水。
, 百拇医药
2 方法
2.1 工作条件 配置20 mmol/L硼酸盐缓冲液(pH 9.0)，加入102.5 mmol/L SDS及3%甲醇，用0.45 μm微孔滤膜过滤，作为分离缓冲液。工作电压15 kV，温度20°C，进样时间5秒，毛细管规格为未涂层75 μm ID×37 cm，紫外检测波长为214 nm。
2.2 毛细管的冲洗方法 每天开机后，依次用0.1 mol/L盐酸、0.1 mol/L氢氧化钠、重蒸水、分离缓冲液高压正向冲洗毛细管各2分钟；每次测定之间依次用0.1 mmol/L氢氧化钠、重蒸水、分离缓冲液高压正向冲洗毛细管各1分钟；每天关机前依次用0.1 mol/L盐酸、0.1 mol/L氢氧化钠、重蒸水高压正向冲洗毛细管各2分钟。
2.3 标准曲线的制备 用重蒸水配制谷氨酸标准液，使得终浓度分别为6.8，34.0，68.0，204.0，340.0 μmol/L，分别取每一种浓度谷氨酸标准40 μl，加22.25 mol/L DNS-C1 40 μl，混匀，60°C水浴20分钟，加30 μl饱和碳酸锂终止反应，以重蒸水40 μl与标准液同样条件下衍生作为空白，压力进样进行电泳。
, 百拇医药
2.4 样品处理 200 μl血浆与600 μl无水乙醇充分混匀，12 000 r/min离心30分钟，取上清液放置37°C温箱中至干；用100 μl重蒸水复溶；取40 μl上步样品加DNS-C1(22.25 mmol/L)40 μl，混匀，60°C水浴20分钟，加30 μl饱和碳酸锂，混匀，12 000 r/min离心10分钟，取上清至样品杯中，压力进样进行电泳。
2.5 结果计算 将样品中谷氨酸的峰积分面积带入标准曲线回归方程中，计算出的浓度值乘以2即为样品谷氨酸的含量。
3 实验与结果
3.1 谷氨酸标准曲线的线性 将谷氨酸标准液稀释成6.8，34.0，68.0，204.0，340.0 μmol/L五个不同浓度，依次测定后，PACE工作站自动进行线性回归，并计算相关系数r的平方。回归方程为Y＝163.52X+95.63，其中Y为峰积分面积，X为谷氨酸含量，γ＝0.999526。结果表明，谷氨酸在6.8～340.0 μmol/L范围内线性良好。
, 百拇医药
3.2 计算基线噪音相应于信噪比为2(S/N＝2)时的浓度即为最低的检测限，本实验为3.4 μmol/L。
3.3 精密度 批内误差：取一份血浆，当日衍生后，连续测定10次
＝70.27 μmol/L，s＝2.31，CV＝3.28%。批间误差：连续10天取同一样品血浆200 μl，以同样的条件进行处理和衍生后进行测定。＝71.23 μmol/L,s＝3.77，CV＝5.29%。
3.4 准确度 取同份已知谷氨酸浓度的血浆，分置三管，每管200 μl,按上述去蛋白步骤处理、干燥后，分别用200 μl，100 μl，50 μl重蒸水复溶，使其变为未浓缩、2倍浓缩、4倍浓缩三个浓度水平的样品，各取出40 μl分置三管中，依次分别加入67.99，135.98，271.96 μmol/L标准液40 μl，混匀，按上述衍生方法衍生后上机测定。同样方法做另外两个已知谷氨酸浓度的血浆，计算回收率，结果见附表，回收率在84.3%～110.9%之间。
, 百拇医药
附表 血浆中谷氨酸的回收率 原血浆中谷氨酸
浓度(μmol/L)
加标量
(μmol/L)
预计值
(μmol/L)
实测值
(μmol/L)
回收率
(%)
70.25
60.38
, 百拇医药
85.49
140.50
120.76
170.98
281.00
241.52
341.96
67.99
67.99
67.99
135.98
135.98
, 百拇医药 135.98
271.96
271.96
271.96
69.12
64.19
76.74
138.24
128.37
153.48
276.48
256.74
306.96
, 百拇医药
65.87
54.11
68.38
153.31
112.32
157.16
302.47
220.54
338.88
95.3
84.3
89.1
110.9
, 百拇医药
87.5
102.4
109.4
85.9
110.4
4 讨论
血浆及脑脊液中谷氨酸的含量越来越引起临床医生的重视。早在1969年Olney就研究证实谷氨酸可致视网膜细胞坏死，随浓度增加可扩展到脑组织。近年发现，脑缺血时，神经元释放大量的兴奋性氨基酸，特别是谷氨酸大量释放后，激活谷氨酸受体，引起兴奋性神经元持续去极化，干扰神经元的调节机制，导致离子渗透压与电化学的改变。程方敏等人的实验表明，脑梗塞后12小时，脑脊液中谷氨酸升高，而CT在梗塞后48～72小时后方可显示病灶，因此，测定脑脊液中谷氨酸可早期预测脑梗塞的发生[2]。然而，脑脊液的采集困难，且病人难以接受。Castillo等人的实验表明脑脊液和血浆中谷氨酸浓度呈显著正相关(r＝0.79，P<0.0001)，血浆谷氨酸浓度超过200 μmol/L时，对进展性卒中预测的灵敏性、特异性、准确性分别是79%、99%和97%，因此测定血浆中谷氨酸浓度亦可独立早期预测脑梗塞急性期的病情，指导临床医生使用谷氨酸拮抗剂[3]。
, 百拇医药
本文采用的胶束电动力学毛细管色谱法(micellar electrokinetic capillary chromatography,MECC)，是在毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis,CZE)的基础上，在缓冲液中加入一种表面活性剂(本文使用SDS)，当这种表面活性剂浓度达到一定程度时，可形成胶束，根据不同物质在胶束(准固定相)与水相之间的分配系数不同，以及荷质比不同，共同导致物质以不同的迁移时间通过检测器[1]。
在缓冲液中适当加入甲醇，可以增加溶解度，减少电渗流，提高分辨率。(参见“高效毛细管电泳仪的基础理论”，Beckman公司提供资料)。
缓冲液中SDS含量对电流影响很大，电流过大，容易产生焦耳热；电流过小，分离效果不好，故应严格控制SDS含量，实验证明SDS含量为102.5 mmol/L时，分离效果较好。如图1血浆中谷氨酸分离图谱所示。
, http://www.100md.com
图1 血浆中谷氨酸分离图谱
样品衍生后，放入4°C冰箱保存，每天测定一次，第一天测得该样品中谷氨酸浓度为76.45 μmol/L，第二天为70.26 μmol/L，第三天下降至32.98 μmol/L，这可能与衍生后样品的稳定性有关，故样品衍生后应尽快测定，放置冰箱中不得超过两天。
参考文献
1 Landers J P.Clinical capillary electrophoresis.Clin Chem 1954,41(4):495
2 程方敏，周凤平，王忠功，等.脑梗塞患者脑脊液兴奋性氨基酸含量的测定及其意义.脑与神经疾病杂志，1998，6(1)：36
3 Castillo J,D valos A,Noya M.Progression of ischaemic stroke and excitatory amino acid.Lancet,1997,349:79, http://www.100md.com
单位：天津市第一中心医院检验学部
关键词：毛细管电泳；谷氨酸
临床检验杂志990505 摘要 建立毛细管电泳法测定血浆中谷氨酸的方法。采用胶束电动力学毛细管色谱法，用贝克曼公司P/ACE System 5000毛细管电泳仪进行血浆中谷氨酸的测定。电场电压15 kV，毛细管工作温度20°C，压力进样5秒，毛细管规格为75 μm ID×37 cm，紫外检测波长为214 nm，缓冲液为20 mmol/L，硼酸盐缓冲液(pH 9.0)，含102.5 mmol/L SDS，3%甲醇。结果表明，谷氨酸在6.8～340.0 (μmol/L)范围内，有良好的线性。r2＝0.9995，批内变异系数CV＝3.28%，批间变异系数CV＝5.29%，样品回收率在84.3%～110.9%之间，样品衍生后应在两天内测定。该方法具有自动化、分析速度快、分离效果好、所用试剂和样品少，成本低等优点，有一定的临床应用价值。
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目前普遍使用的氨基酸分析方法为离子交换色谱法和反相高效液相色谱法，这两种方法各有其优点，但也存在共同的弊病即分析时间长、试剂成本太高。我们建立了毛细管电泳法测定血浆中谷氨酸的方法，克服了上述两种方法的缺点。
1 材料
1.1 仪器 Beckman P/ACE System 5000电泳仪。IBM PC电脑(PACE工作站)。未涂层熔融石英毛细管：75 μm ID×37 cm(永年光导纤维厂)。紫外检测器(包括214 nm、254 nm、280 nm、200 nm四个滤光片)。毛细管卡盒(Beckman公司)。pH计(Beckman公司)。
1.2 试剂 L-谷氨酸(Sigma公司，G5638)。丹酰氯(dansyl chloride，缩写DNS-Cl,Sigma公司，D2625)。本实验用试剂均为分析纯，实验用水为亚沸重蒸水。
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2 方法
2.1 工作条件 配置20 mmol/L硼酸盐缓冲液(pH 9.0)，加入102.5 mmol/L SDS及3%甲醇，用0.45 μm微孔滤膜过滤，作为分离缓冲液。工作电压15 kV，温度20°C，进样时间5秒，毛细管规格为未涂层75 μm ID×37 cm，紫外检测波长为214 nm。
2.2 毛细管的冲洗方法 每天开机后，依次用0.1 mol/L盐酸、0.1 mol/L氢氧化钠、重蒸水、分离缓冲液高压正向冲洗毛细管各2分钟；每次测定之间依次用0.1 mmol/L氢氧化钠、重蒸水、分离缓冲液高压正向冲洗毛细管各1分钟；每天关机前依次用0.1 mol/L盐酸、0.1 mol/L氢氧化钠、重蒸水高压正向冲洗毛细管各2分钟。
2.3 标准曲线的制备 用重蒸水配制谷氨酸标准液，使得终浓度分别为6.8，34.0，68.0，204.0，340.0 μmol/L，分别取每一种浓度谷氨酸标准40 μl，加22.25 mol/L DNS-C1 40 μl，混匀，60°C水浴20分钟，加30 μl饱和碳酸锂终止反应，以重蒸水40 μl与标准液同样条件下衍生作为空白，压力进样进行电泳。
, 百拇医药
2.4 样品处理 200 μl血浆与600 μl无水乙醇充分混匀，12 000 r/min离心30分钟，取上清液放置37°C温箱中至干；用100 μl重蒸水复溶；取40 μl上步样品加DNS-C1(22.25 mmol/L)40 μl，混匀，60°C水浴20分钟，加30 μl饱和碳酸锂，混匀，12 000 r/min离心10分钟，取上清至样品杯中，压力进样进行电泳。
2.5 结果计算 将样品中谷氨酸的峰积分面积带入标准曲线回归方程中，计算出的浓度值乘以2即为样品谷氨酸的含量。
3 实验与结果
3.1 谷氨酸标准曲线的线性 将谷氨酸标准液稀释成6.8，34.0，68.0，204.0，340.0 μmol/L五个不同浓度，依次测定后，PACE工作站自动进行线性回归，并计算相关系数r的平方。回归方程为Y＝163.52X+95.63，其中Y为峰积分面积，X为谷氨酸含量，γ＝0.999526。结果表明，谷氨酸在6.8～340.0 μmol/L范围内线性良好。
, 百拇医药
3.2 计算基线噪音相应于信噪比为2(S/N＝2)时的浓度即为最低的检测限，本实验为3.4 μmol/L。
3.3 精密度 批内误差：取一份血浆，当日衍生后，连续测定10次
＝70.27 μmol/L，s＝2.31，CV＝3.28%。批间误差：连续10天取同一样品血浆200 μl，以同样的条件进行处理和衍生后进行测定。＝71.23 μmol/L,s＝3.77，CV＝5.29%。3.4 准确度 取同份已知谷氨酸浓度的血浆，分置三管，每管200 μl,按上述去蛋白步骤处理、干燥后，分别用200 μl，100 μl，50 μl重蒸水复溶，使其变为未浓缩、2倍浓缩、4倍浓缩三个浓度水平的样品，各取出40 μl分置三管中，依次分别加入67.99，135.98，271.96 μmol/L标准液40 μl，混匀，按上述衍生方法衍生后上机测定。同样方法做另外两个已知谷氨酸浓度的血浆，计算回收率，结果见附表，回收率在84.3%～110.9%之间。
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附表 血浆中谷氨酸的回收率 原血浆中谷氨酸
浓度(μmol/L)
加标量
(μmol/L)
预计值
(μmol/L)
实测值
(μmol/L)
回收率
(%)
70.25
60.38
, 百拇医药
85.49
140.50
120.76
170.98
281.00
241.52
341.96
67.99
67.99
67.99
135.98
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271.96
271.96
271.96
69.12
64.19
76.74
138.24
128.37
153.48
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110.9
, 百拇医药
87.5
102.4
109.4
85.9
110.4
4 讨论
血浆及脑脊液中谷氨酸的含量越来越引起临床医生的重视。早在1969年Olney就研究证实谷氨酸可致视网膜细胞坏死，随浓度增加可扩展到脑组织。近年发现，脑缺血时，神经元释放大量的兴奋性氨基酸，特别是谷氨酸大量释放后，激活谷氨酸受体，引起兴奋性神经元持续去极化，干扰神经元的调节机制，导致离子渗透压与电化学的改变。程方敏等人的实验表明，脑梗塞后12小时，脑脊液中谷氨酸升高，而CT在梗塞后48～72小时后方可显示病灶，因此，测定脑脊液中谷氨酸可早期预测脑梗塞的发生[2]。然而，脑脊液的采集困难，且病人难以接受。Castillo等人的实验表明脑脊液和血浆中谷氨酸浓度呈显著正相关(r＝0.79，P<0.0001)，血浆谷氨酸浓度超过200 μmol/L时，对进展性卒中预测的灵敏性、特异性、准确性分别是79%、99%和97%，因此测定血浆中谷氨酸浓度亦可独立早期预测脑梗塞急性期的病情，指导临床医生使用谷氨酸拮抗剂[3]。
, 百拇医药
本文采用的胶束电动力学毛细管色谱法(micellar electrokinetic capillary chromatography,MECC)，是在毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis,CZE)的基础上，在缓冲液中加入一种表面活性剂(本文使用SDS)，当这种表面活性剂浓度达到一定程度时，可形成胶束，根据不同物质在胶束(准固定相)与水相之间的分配系数不同，以及荷质比不同，共同导致物质以不同的迁移时间通过检测器[1]。
在缓冲液中适当加入甲醇，可以增加溶解度，减少电渗流，提高分辨率。(参见“高效毛细管电泳仪的基础理论”，Beckman公司提供资料)。
缓冲液中SDS含量对电流影响很大，电流过大，容易产生焦耳热；电流过小，分离效果不好，故应严格控制SDS含量，实验证明SDS含量为102.5 mmol/L时，分离效果较好。如图1血浆中谷氨酸分离图谱所示。
, http://www.100md.com
图1 血浆中谷氨酸分离图谱
样品衍生后，放入4°C冰箱保存，每天测定一次，第一天测得该样品中谷氨酸浓度为76.45 μmol/L，第二天为70.26 μmol/L，第三天下降至32.98 μmol/L，这可能与衍生后样品的稳定性有关，故样品衍生后应尽快测定，放置冰箱中不得超过两天。
参考文献
1 Landers J P.Clinical capillary electrophoresis.Clin Chem 1954,41(4):495
2 程方敏，周凤平，王忠功，等.脑梗塞患者脑脊液兴奋性氨基酸含量的测定及其意义.脑与神经疾病杂志，1998，6(1)：36
3 Castillo J,D valos A,Noya M.Progression of ischaemic stroke and excitatory amino acid.Lancet,1997,349:79, http://www.100md.com