3-磷酸甘油醛脱氢酶偶联法测定血清醛缩酶活性
作者：陈江华 王毓三
单位：江苏省临床检验中心
关键词：醛缩酶；酶偶联法；3-磷酸甘油醛脱氢酶
临床检验杂志990504 摘要 建立血清醛缩酶活性的3-磷酸甘油醛脱氢酶偶联测定法。用底物1，6-二磷酸果糖启动酶促反应，连续监测NADH生成速率。反应条件：温度37°C，pH 8.3，各反应物的终末浓度：三乙醇胺50 mmol/L，1，6-二磷酸果糖 4.5 mmol/L，砷酸钠10 mmol/L，氧化型辅酶Ⅰ6 mmol/L，3-磷酸甘油醛脱氢酶2500 U/L，磷酸丙糖异构酶500 U/L，乳酸脱氢酶1500 U/L，血清与试剂容积比0.043。参考值x=6.76 U/L，s=1.03 U/L，本法(Y)与3-磷酸甘油脱氢酶偶联法(X)相关性：Y=0.8X+3.6，r=0.9931。
醛缩酶(aldolase,Ald)催化1，6-二磷酸果糖(fructose-1，6-disphosphate,FDP)裂解成一分子磷酸二羟丙酮和一分子3-磷酸甘油醛。血清醛缩酶活性的连续监测法可有两条途径：一是3-磷酸甘油脱氢酶偶联法，在NADH存在下磷酸二羟丙酮还原成3-磷酸甘油，于波长340 nm监测吸光度下降速率[1，2](NADH消耗速率)；另一是3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GLAPD)偶联法，在NAD存在下3-磷酸甘油醛氧化成3-磷酸甘油酸，于波长340 nm监测吸光度上升速率[3，4](NADH生成速率)。应用最多的是根据前一反应途径建立的测定方法。根据后一反应途径建立的Ald活性测定方法，有文献认为该法所受的干扰因素较多而很少应用[3]，然而未查到具体测定方法及评价的有关资料。分析两法测定的主要干扰因素，前者受血液中丙酮酸的干扰；后者受血液中乳酸的干扰。一般情况下，以毫摩尔浓度相比，乳酸的含量要比丙酮酸的含量高十几倍。所以，后者所受干扰较大。本文在GALPD偶联反应前，加入乳酸脱氢酶以消除乳酸的干扰，然后加入底物，启动偶联反应，保证了测定结果的准确性。本法的优点是应用NAD，价格比NADH便宜，且试剂溶液稳定性较好，属于吸光度上升型测定方法。
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1 试剂
1.1 三乙醇胺(TEA)缓冲液(60 mmol/L TEA,12 mmol/L砷酸钠(Na3AsO4)，7.2 mmol/L NAD,pH 8.3)取TEA(FW 149.19，比重1.120～1.125，含量80%)1.0 ml，Na3AsO4(FW 424.06)508.8 mg，NAD(FW 663.4)477.6 mg，蒸馏水80 ml，在pH计下，用1 mol/L HCl调节至pH 8.3，再加蒸馏水至100 ml，置冰箱保存。
1.2 工具酶〔60 kU/L 3-磷酸甘油醛脱氢酶(GLAPD)，12 kU/L TPI,36 kU/L LD〕取1.6 mol/L(NH4)2SO4(对酶起稳定作用)1 000 μl，GLAPD原液15 μl(61 U)，乳酸脱氢酶(LD)原液7 μl(37 U)、磷酸丙糖异构酶(TPI)原液1 μl(12.5 U)，混合后，置冰箱保存。
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〔注〕(1)GLAPD，Sigma公司，批号55H9544，比活120 U/mg蛋白
(2)TPI，Sigma公司，批号94H9546，比活5600 U/mg蛋白
(3)LD，Boehringer Mannheim公司，批号11305627，比活1000 U/mg蛋白
1.3 54.5 mmol/L FDP溶液(酶底物) 称取1.6-二磷酸果糖(FDPNa3.8H2O，FW 550.2)300 mg溶于10 ml TEA缓冲液(pH 8.3)中，置冰箱保存。临用前取出适量，使温度平衡至37°C。
2 方法
2.1 反应条件 pH 8.3，温度37°C，TEA 50 mmol/L，FDP 4.5 mmol/L，Na3AsO4 10 mmol/L，NAD 6 mmol/L，GLAPD 2 500 U/L,TPI 500 U/L,LD 1 500 U/L。
, http://www.100md.com
2.2 血清0.05 ml，TEA缓冲液1 ml，工具酶0.05 ml，混匀，置37°C水浴中5分钟，再加入54.5 mmol/L FDP溶液0.1 ml，混匀，立即吸入恒温流动池(光径10 mm)中，波长340 nm，延迟时间30秒，监测时间180秒，每60秒读一次吸光度，计算平均每分钟吸光度上升速率(ΔA/min)，求出Ald活性单位。
Ald U/L=ΔA/min×(106/6220)×(1.20/0.05)×(1/2)
=ΔA/min×1929
式中1/2为一分子1，6-二磷酸果糖分解成二分子磷酸丙糖的系数。
3 结果与讨论
3.1 缓冲液的选择
, http://www.100md.com 3.1.1 缓冲液的pH 50 mmol/L TEA-HCl，50 mmol/L Tris-HCl和100 mmol/L甲基葡胺-HCl三种缓冲液，pH分别为7.5、8.0、8.5、9.0和9.5，用同一份病理血清测定Ald活性见表1。
表1 缓冲液pH对Ald活性的影响 pH
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
50 mmol/L TEA-HCl(Ald U/L)
50 mmol/L Tris-HCl(Ald U/L)
, 百拇医药
100 mmol/L 甲基葡胺-HCl(Ald U/L)
22
18
16
32
25
26
33
26
29
25
20
23
, 百拇医药
21
14
16
从表1结果可见，三种缓冲液的最适pH范围基本相似，在pH 8.5左右。对50 mmol/L TEA-HCl缓冲液，增加一个pH 8.3的测试点，测得Ald活性为35，显示该缓冲液的最佳pH为8.3。
3.1.2 缓冲液的浓度 TEA-HCl、Tris-HCl和甲基葡胺-HCl三种缓冲液分别配制成25、50、100和150 mmol/L四种浓度，pH均为8.3，用同一份病理血清测定，Ald活性见表2。表2 缓冲液浓度对Ald活性的影响 缓冲液浓度(mmol/L)
25
50
100
, 百拇医药
150
TEA-HCl(Ald U/L)
Tris-HCl(Ald U/L)
甲基葡胺-HCl(Ald U/L)
28
22
20
28
21
24
26
19
, 百拇医药 21
26
18
20
表2结果显示25～50 (mmol/L) TEA-HCl缓冲液的测定结果最佳。
3.1.3 缓冲液的种类 50 mmol/L TEA-HCl、25 mmol/L Tris-HCl和50 mmol/L甲基葡胺-HCl三种缓冲液，pH均为8.3，测定三份病理血清，Ald活性见表3。表3 不同缓冲液对Ald活性的影响 缓冲液
50 mmol/L
TEA-HCl
25 mmol/L
, 百拇医药
Tris-HCl
50 mmol/L
甲基葡胺-HCl
血清(1)
血清(2)
血清(3)
37.6
31.1
31.4
29.6
23.4
24.4
30.1
, 百拇医药
22.3
22.1
表3结果显示50 mmol/L TEA-HCl的测定结果最佳。
3.2 底物浓度的选择 酶底物1，6-二磷酸果糖在反应混合液中的浓度分别为3、4和5 mmol/L，测定3份病理血清，Ald活性分别为：血清(1)为22.5、24.9和25.4 U/L；血清(2)为19.4、20.2和20 U/L；血清(3)为15、16和15 U/L。从3份病理血清的测定结果来看，底物终末浓度达4 mmol/L时已能满足临床测定Ald活性的需要。
3.3 工具酶 反应混合液中，TPI浓度为500 U/L时，GLAPD的浓度从500 U/L到4 000 U/L，每增加500 U/L为一个测试点。取同一份血清，测定Ald活性。结果表明，开始时随着GLAPD浓度增高，酶促反应速率逐步加大，当GLAPD浓度超过2 500 U/L后反应速率增加不显著。另外，随着GLAPD浓度的加大，试剂空白管的反应速率亦相应增高。本实验选用2 500 U/L GLAPD，此时试剂空白管的测定值在1 U/L左右。
, http://www.100md.com
在文献[3，5]中对3-磷酸甘油醛脱氢酶偶联法反应均提到加入磷酸丙糖异构酶(TPI)但无具体浓度和操作方法。文献[4]脑脊液醛缩酶同工酶琼脂糖电泳中，应用3-磷酸甘油醛脱氢酶偶联法，在该反应体系中没有加入TPI。在我们的实验过程中发现随着TPI浓度的增大，反应速率逐步下降，其原因不明。虽然文献[5]中亦曾提到TPI对本法测定的干扰作用，但未解释TPI的干扰机理。关于这个问题，有待于进一步探讨。
3.4 乳酸的影响 在混合血清中加入乳酸锂，使血清中乳酸浓度达25 mmol/L，用此血清，按上述方法，观察5 min孵育期内的反应曲线，反应达3 min时反应曲线已平坦，表明反应体系中所加入的LD浓度在5 min的孵育时间内足以消除血清中病理性高浓度乳酸的干扰。
3.5 测定精度 批内变异，测定2份血清，分别为n=10,x=8.97 U/L，s=0.41 U/L，CV=4.5%；n=10，x=13.65 U/L，s=0.46 U/L，CV=3.4%。批间变异，n=10，x=11 U/L，s=0.86 U/L，CV=7.8%。
, 百拇医药
3.6 与3-磷酸甘油脱氢酶偶联法的相关性 选择醛缩酶活性正常和增高的血清标本31份，经测定醛缩酶活性在5～40 (U/L)，分别用本文3-磷酸甘油醛脱氢酶偶联法(Y)和3-磷酸甘油脱氢酶偶联法[2](X)(改用底物启动的双试剂法)平行测定，前者X=14.2 U/L；后者X=13.2 U/L，两法回归方程Y=0.8 X+3.6，γ=0.9931，表示两法测定结果一致。
3.7 参考值 36名健康体检者，年龄20～60(岁)，男女各半，均值6.76 U/L，s=1.03 U/L，全组测定值范围4.3～8.6 (U/L)。
3.8 结论 醛缩酶活性的两种酶偶联法测定，都存在若干干扰因素，若改用底物启动的双试剂方法，又设有足够的预孵育时间，基本上可以排除干扰反应，得到较为准确的测定结果。
参考文献
, http://www.100md.com 1 Bargmever H U Ed.Methods of Enzymatic Analysis.3rd ed.Vol Ⅳ.Verlog Chemie GmbH.1984.346—352
2 陈江华，王毓三.3-磷酸甘油脱氢酶偶联法测定血清醛缩酶活性.临床检验杂志，1997,14:287
3 Burtis C A,Ashwood E R.Titz Textbook of Clinical Chemistry.2rd ed.Philadelphia:WB Saunders Company.1994.810—812
4 Farina F A,Shiesh S C,Elevitch F R，et al.Agarose-gel electrophoresis of aldolase isoenzymes in cerebrospinal fluid.Clin Chem,1980,20:1048
5 林其燧，文庆成主译校.临床化学诊断方法大全.北京：北京大学出版社.1990,735—738
(1999-02-03收稿，1999-06-15修回), http://www.100md.com
单位：江苏省临床检验中心
关键词：醛缩酶；酶偶联法；3-磷酸甘油醛脱氢酶
临床检验杂志990504 摘要 建立血清醛缩酶活性的3-磷酸甘油醛脱氢酶偶联测定法。用底物1，6-二磷酸果糖启动酶促反应，连续监测NADH生成速率。反应条件：温度37°C，pH 8.3，各反应物的终末浓度：三乙醇胺50 mmol/L，1，6-二磷酸果糖 4.5 mmol/L，砷酸钠10 mmol/L，氧化型辅酶Ⅰ6 mmol/L，3-磷酸甘油醛脱氢酶2500 U/L，磷酸丙糖异构酶500 U/L，乳酸脱氢酶1500 U/L，血清与试剂容积比0.043。参考值x=6.76 U/L，s=1.03 U/L，本法(Y)与3-磷酸甘油脱氢酶偶联法(X)相关性：Y=0.8X+3.6，r=0.9931。
醛缩酶(aldolase,Ald)催化1，6-二磷酸果糖(fructose-1，6-disphosphate,FDP)裂解成一分子磷酸二羟丙酮和一分子3-磷酸甘油醛。血清醛缩酶活性的连续监测法可有两条途径：一是3-磷酸甘油脱氢酶偶联法，在NADH存在下磷酸二羟丙酮还原成3-磷酸甘油，于波长340 nm监测吸光度下降速率[1，2](NADH消耗速率)；另一是3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GLAPD)偶联法，在NAD存在下3-磷酸甘油醛氧化成3-磷酸甘油酸，于波长340 nm监测吸光度上升速率[3，4](NADH生成速率)。应用最多的是根据前一反应途径建立的测定方法。根据后一反应途径建立的Ald活性测定方法，有文献认为该法所受的干扰因素较多而很少应用[3]，然而未查到具体测定方法及评价的有关资料。分析两法测定的主要干扰因素，前者受血液中丙酮酸的干扰；后者受血液中乳酸的干扰。一般情况下，以毫摩尔浓度相比，乳酸的含量要比丙酮酸的含量高十几倍。所以，后者所受干扰较大。本文在GALPD偶联反应前，加入乳酸脱氢酶以消除乳酸的干扰，然后加入底物，启动偶联反应，保证了测定结果的准确性。本法的优点是应用NAD，价格比NADH便宜，且试剂溶液稳定性较好，属于吸光度上升型测定方法。
, http://www.100md.com
1 试剂
1.1 三乙醇胺(TEA)缓冲液(60 mmol/L TEA,12 mmol/L砷酸钠(Na3AsO4)，7.2 mmol/L NAD,pH 8.3)取TEA(FW 149.19，比重1.120～1.125，含量80%)1.0 ml，Na3AsO4(FW 424.06)508.8 mg，NAD(FW 663.4)477.6 mg，蒸馏水80 ml，在pH计下，用1 mol/L HCl调节至pH 8.3，再加蒸馏水至100 ml，置冰箱保存。
1.2 工具酶〔60 kU/L 3-磷酸甘油醛脱氢酶(GLAPD)，12 kU/L TPI,36 kU/L LD〕取1.6 mol/L(NH4)2SO4(对酶起稳定作用)1 000 μl，GLAPD原液15 μl(61 U)，乳酸脱氢酶(LD)原液7 μl(37 U)、磷酸丙糖异构酶(TPI)原液1 μl(12.5 U)，混合后，置冰箱保存。
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〔注〕(1)GLAPD，Sigma公司，批号55H9544，比活120 U/mg蛋白
(2)TPI，Sigma公司，批号94H9546，比活5600 U/mg蛋白
(3)LD，Boehringer Mannheim公司，批号11305627，比活1000 U/mg蛋白
1.3 54.5 mmol/L FDP溶液(酶底物) 称取1.6-二磷酸果糖(FDPNa3.8H2O，FW 550.2)300 mg溶于10 ml TEA缓冲液(pH 8.3)中，置冰箱保存。临用前取出适量，使温度平衡至37°C。
2 方法
2.1 反应条件 pH 8.3，温度37°C，TEA 50 mmol/L，FDP 4.5 mmol/L，Na3AsO4 10 mmol/L，NAD 6 mmol/L，GLAPD 2 500 U/L,TPI 500 U/L,LD 1 500 U/L。
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2.2 血清0.05 ml，TEA缓冲液1 ml，工具酶0.05 ml，混匀，置37°C水浴中5分钟，再加入54.5 mmol/L FDP溶液0.1 ml，混匀，立即吸入恒温流动池(光径10 mm)中，波长340 nm，延迟时间30秒，监测时间180秒，每60秒读一次吸光度，计算平均每分钟吸光度上升速率(ΔA/min)，求出Ald活性单位。
Ald U/L=ΔA/min×(106/6220)×(1.20/0.05)×(1/2)
=ΔA/min×1929
式中1/2为一分子1，6-二磷酸果糖分解成二分子磷酸丙糖的系数。
3 结果与讨论
3.1 缓冲液的选择
, http://www.100md.com 3.1.1 缓冲液的pH 50 mmol/L TEA-HCl，50 mmol/L Tris-HCl和100 mmol/L甲基葡胺-HCl三种缓冲液，pH分别为7.5、8.0、8.5、9.0和9.5，用同一份病理血清测定Ald活性见表1。
表1 缓冲液pH对Ald活性的影响 pH
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
50 mmol/L TEA-HCl(Ald U/L)
50 mmol/L Tris-HCl(Ald U/L)
, 百拇医药
100 mmol/L 甲基葡胺-HCl(Ald U/L)
22
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, 百拇医药
21
14
16
从表1结果可见，三种缓冲液的最适pH范围基本相似，在pH 8.5左右。对50 mmol/L TEA-HCl缓冲液，增加一个pH 8.3的测试点，测得Ald活性为35，显示该缓冲液的最佳pH为8.3。
3.1.2 缓冲液的浓度 TEA-HCl、Tris-HCl和甲基葡胺-HCl三种缓冲液分别配制成25、50、100和150 mmol/L四种浓度，pH均为8.3，用同一份病理血清测定，Ald活性见表2。表2 缓冲液浓度对Ald活性的影响 缓冲液浓度(mmol/L)
25
50
100
, 百拇医药
150
TEA-HCl(Ald U/L)
Tris-HCl(Ald U/L)
甲基葡胺-HCl(Ald U/L)
28
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24
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19
, 百拇医药 21
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表2结果显示25～50 (mmol/L) TEA-HCl缓冲液的测定结果最佳。
3.1.3 缓冲液的种类 50 mmol/L TEA-HCl、25 mmol/L Tris-HCl和50 mmol/L甲基葡胺-HCl三种缓冲液，pH均为8.3，测定三份病理血清，Ald活性见表3。表3 不同缓冲液对Ald活性的影响 缓冲液
50 mmol/L
TEA-HCl
25 mmol/L
, 百拇医药
Tris-HCl
50 mmol/L
甲基葡胺-HCl
血清(1)
血清(2)
血清(3)
37.6
31.1
31.4
29.6
23.4
24.4
30.1
, 百拇医药
22.3
22.1
表3结果显示50 mmol/L TEA-HCl的测定结果最佳。
3.2 底物浓度的选择 酶底物1，6-二磷酸果糖在反应混合液中的浓度分别为3、4和5 mmol/L，测定3份病理血清，Ald活性分别为：血清(1)为22.5、24.9和25.4 U/L；血清(2)为19.4、20.2和20 U/L；血清(3)为15、16和15 U/L。从3份病理血清的测定结果来看，底物终末浓度达4 mmol/L时已能满足临床测定Ald活性的需要。
3.3 工具酶 反应混合液中，TPI浓度为500 U/L时，GLAPD的浓度从500 U/L到4 000 U/L，每增加500 U/L为一个测试点。取同一份血清，测定Ald活性。结果表明，开始时随着GLAPD浓度增高，酶促反应速率逐步加大，当GLAPD浓度超过2 500 U/L后反应速率增加不显著。另外，随着GLAPD浓度的加大，试剂空白管的反应速率亦相应增高。本实验选用2 500 U/L GLAPD，此时试剂空白管的测定值在1 U/L左右。
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在文献[3，5]中对3-磷酸甘油醛脱氢酶偶联法反应均提到加入磷酸丙糖异构酶(TPI)但无具体浓度和操作方法。文献[4]脑脊液醛缩酶同工酶琼脂糖电泳中，应用3-磷酸甘油醛脱氢酶偶联法，在该反应体系中没有加入TPI。在我们的实验过程中发现随着TPI浓度的增大，反应速率逐步下降，其原因不明。虽然文献[5]中亦曾提到TPI对本法测定的干扰作用，但未解释TPI的干扰机理。关于这个问题，有待于进一步探讨。
3.4 乳酸的影响 在混合血清中加入乳酸锂，使血清中乳酸浓度达25 mmol/L，用此血清，按上述方法，观察5 min孵育期内的反应曲线，反应达3 min时反应曲线已平坦，表明反应体系中所加入的LD浓度在5 min的孵育时间内足以消除血清中病理性高浓度乳酸的干扰。
3.5 测定精度 批内变异，测定2份血清，分别为n=10,x=8.97 U/L，s=0.41 U/L，CV=4.5%；n=10，x=13.65 U/L，s=0.46 U/L，CV=3.4%。批间变异，n=10，x=11 U/L，s=0.86 U/L，CV=7.8%。
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3.6 与3-磷酸甘油脱氢酶偶联法的相关性 选择醛缩酶活性正常和增高的血清标本31份，经测定醛缩酶活性在5～40 (U/L)，分别用本文3-磷酸甘油醛脱氢酶偶联法(Y)和3-磷酸甘油脱氢酶偶联法[2](X)(改用底物启动的双试剂法)平行测定，前者X=14.2 U/L；后者X=13.2 U/L，两法回归方程Y=0.8 X+3.6，γ=0.9931，表示两法测定结果一致。
3.7 参考值 36名健康体检者，年龄20～60(岁)，男女各半，均值6.76 U/L，s=1.03 U/L，全组测定值范围4.3～8.6 (U/L)。
3.8 结论 醛缩酶活性的两种酶偶联法测定，都存在若干干扰因素，若改用底物启动的双试剂方法，又设有足够的预孵育时间，基本上可以排除干扰反应，得到较为准确的测定结果。
参考文献
, http://www.100md.com 1 Bargmever H U Ed.Methods of Enzymatic Analysis.3rd ed.Vol Ⅳ.Verlog Chemie GmbH.1984.346—352
2 陈江华，王毓三.3-磷酸甘油脱氢酶偶联法测定血清醛缩酶活性.临床检验杂志，1997,14:287
3 Burtis C A,Ashwood E R.Titz Textbook of Clinical Chemistry.2rd ed.Philadelphia:WB Saunders Company.1994.810—812
4 Farina F A,Shiesh S C,Elevitch F R，et al.Agarose-gel electrophoresis of aldolase isoenzymes in cerebrospinal fluid.Clin Chem,1980,20:1048
5 林其燧，文庆成主译校.临床化学诊断方法大全.北京：北京大学出版社.1990,735—738
(1999-02-03收稿，1999-06-15修回), http://www.100md.com