尿液卵泡刺激素β亚单位及孕二醇-3-葡糖苷酸酶免法测定及其临床意义
作者：杨小芳 邱清 赵人 王心如
单位：南京医科大学应用毒理研究所
关键词：卵泡刺激素；孕二醇-3-葡糖苷酸；酶免法；排卵
尿液卵泡刺激素β亚单位及孕二醇 摘要 探讨尿液FSH及PdG在女性正常月经周期中或产后的变化规律及其临床意义。用酶免法测定20名育龄妇女正常月经周期及20名产妇产后40天至70天连续尿样用酶免法测定尿液中卵泡刺激素β亚单位(FSH-β)及孕二醇-3-葡糖苷酸(PdG)浓度，同时测定尿肌酐，描绘激素动态变化曲线。产妇同时动态进行妇科B超检测排卵情况。正常育龄妇女月经周期中FSH峰值浓度平均为11.38±4.69(ng/mg)Cr，峰值出现时间平均为15.2±0.8(天)，由此判断排卵时间平均为15.2±0.8(天)。PdG峰值浓度平均为15.51±5.15(μg/mg)Cr,高峰出现时间平均在FSH高峰出现后5.9±1.1(天)。产后70天内尿液FSH及PdG均无特征性高峰，平均浓度分别为3.10±1.49(ng/mg)Cr和0.68±0.39(μg/mg)Cr,与正常月经期内的基础水平相比无显著性差异(P>0.05)。B超结果显示产妇均无成熟卵泡发生。结果表明尿液FSH及PdG酶免法测定有助于临床判断排卵、指导生殖生育及其它生殖内分泌疾病的辅助诊断。
, 百拇医药
Urinary FSH-β and PdG enzyme immunoassay and its application
YANG Xiaofang,QIU Qing,ZHAO Renzhen,et al.(Institute of Applied Toxicology,Nanjing Medical University,Nanjing 210029)
Abstract To study the profiles of daily urinary FSH-β and PdG in normal reproductive and postpsrtum women,and its application in the field of reproductive medicine.Daily urinary FSH and PdG were measured with enzyme immunoassay(EIA)during menstrual cycles in 20 normal reproductive age and from day 40 to 70 of postpartum period in 20 postpartum women.The postpartum women were also examined three times by B ultrasonic test to observe the development of follicles.It showed that mean peak level of FSH in normal reproductive age women were reached 11.38±4.69 ng/mg Cr at the cycle day 15.2±0.8，PdG were reached 15.51±5.15 μg/mg Cr in the mid-luteal phase.Ovulation occurred at mean cycle day 15.2±0.8.No peak levels of FSH or PdG was found in the urine of postpartum women.B ultrasonic test showed there was no matured follicle 70 days postpartum.The EIA of presented reproductive hormones or their metabolites are of great practical value in the fields of clinic laboratory,evaluation of ovulation,monitoring ovarian function and other reproductive endocrinologic studies.
, 百拇医药
Key words follicle stimulating hormone; pregnanediol glucuronide; enzyme immunoassay; ovulation
九十年代以后，国外有文献报道用尿液酶免法(enzyme immunoassay,EIA)检测尿液生殖内分泌激素或其代谢产物[1，2]，与血清放免法结果有良好的一致性。本文运用酶免法检测了正常育龄妇女月经周期及产后70天内连续尿样中卵泡刺激素β亚单位(follicle stimulating hormone β subunit,FSH-β)及孕激素代谢产物孕二醇-3-葡糖苷酸(pregnanediol glucuronide,PdG)水平，根据两种激素的动态变化曲线来判断月经周期中是否排卵、排卵时间及黄体功能等。
1 材料和方法
1.1 材料
, http://www.100md.com
1.1.1 受检对象及尿样采集 正常育龄妇女及产妇各20名，受检期间无任何疾病或服药史，年龄范围在24～32岁。正常育龄妇女从月经第一天开始自我收集晨尿约5 ml,20名共计30个月经周期。产妇于产后40天开始每天收集一次晨尿，共30天，所有样品置-20°C冰箱保存待测。
1.1.2 主要试剂 β-FSH单抗(FS-24A-G10，Scantibodies Laboratory产品)，抗FSH-β兔抗血清由本实验室制备，FSH-β标准由美国National hormone and pituitary Program(NHPP)提供，PdG抗体及所用底物等由Dr.Lasley(Institute of Toxico-
logy & Environmental Health,University of California,Davis)提供，PdG标准品为Sigma公司产品。
, 百拇医药 1.1.3 主要仪器 全自动酶标仪(CERES 900 Scanning Autoreader)、标准96孔酶标板(Nunc)、12孔连续微量加样器、全自动尿样稀释仪等。
1.2 方法
1.2.1 FSH酶免法[2]酶标板用FSH-β单克隆抗体包被过夜，移弃包被液后加牛血清白蛋白阻断液6小时(4°C可放置10天)，洗板2次后分别加标准、内控、样品，室温下放置6小时，洗板2次后加FSH-β亚单位多克隆抗体过夜，洗板后加生物素标记的羊抗兔IgG至少2小时，洗板后加链亲合素结合的碱性磷酸酶(alkline phosphate strepavidin,APS)反应约1小时，洗板后再加底物对硝基酚磷酸(p-NPP)显色，最后用全自动酶标仪测定吸光度。
1.2.2 PdG酶免法[2] Nunc板用抗体包被过夜，洗板2次，加PBS平衡30分钟后分别加标准、内控、样品，然后立即加辣根过氧化物酶结合的PdG(PdG-HRP)竞争反应至少16小时，洗板后加底物2，2-azino-bis(3-ethylbenzethiazoline-6-sulfonic acid),简称ABTS显色，最后用酶标仪测定吸光度。
, 百拇医药
1.2.3 肌酐用碱性苦味酸法测定 尿样用蒸馏水稀释50倍后加入96孔板，用酶标仪测定吸光度。
1.2.4 数据统计 所有样品的FSH和PdG均用尿肌酐校正，结果输入计算机，用Sigma stat软件t检验统计，作图用Sigma plot软件。
1.2.5 B超 受检产妇定期在本校一附院妇科进行三次B超检查，动态观察卵泡发育情况。
2 结果
2.1 正常月经周期及产后70天内尿液FSH及PdG的变化20名正常育龄妇女尿液FSH及PdG在月经周期不同时期的平均水平详见表1。20名受检产妇产后70天内尿液FSH及PdG水平无特征性高峰出现，平均分别为3.10±1.49 ng/mg Cr和0.68±0.39 μg/mg Cr,与正常月经周期内的基础水平相比无显著性差异(P>0.05)，分别低于正常月经排卵期FSH水平或黄体中期PdG的峰值浓度(P<0.01)。
, 百拇医药
表1 正常育龄妇女月经周期中不同时期尿液FSH及PdG水平(x±s)
Table 1 Urinary FSH and PdG level in different period of normal menstrual cycle by EIA
Different phase in menstrual cycle
Early follicle
Late follicle
Ovulating time
Mid-luteal phase
FSH
, 百拇医药 (ng/mg Cr)
3.10±1.49
0.87±0.41
11.38±4.69**
1.09±0.88
PdG
(μg/mg Cr)
1.19±0.47
2.34±1.93
15.51±5.15*
*P<0.01，compared with other periods
, 百拇医药
2.2 正常月经周期尿FSH及PdG的变化曲线及其意义 将每个周期的尿FSH及PdG的肌酐校正值与对应日期作图，平均周期长30.6±3.5天。20名正常育龄妇女共30个周期的曲线上FSH及PdG均有特征性高峰出现。以FSH最高峰出现时间为排卵时间，FSH高峰出现时间平均为15.2±0.8(天)，由此判断排卵时间平均为15.2±0.8(天)。PdG高峰出现时间平均在FSH高峰出现后5.9±1.1(天)(图1)。
2.3 B超结果显示，20名产妇产后70天内进行的三次B超检查中卵泡直径均未达到成熟卵泡水平，均未发现排卵。
Figure 1 The profile of urinary FSH and PdG in normal menstrual cycles.The“0”in X-axis represents the FSH-surge time in each cycle.Each value in the curve represents the mean level of FSH of PdG in different day before or after FSH surge
, 百拇医药
图1 20名正常女性共30个月经周期每天尿液FSH和PdG的变化曲线(曲线横坐标上0表示FSH峰值出现时间，曲线上每点表示每个周期内距FSH峰值出现不同时间的平均浓度及标准差。)
3 讨论
卵泡刺激素和孕激素是调节女性生殖内分泌功能的两种重要的激素。卵泡早期FSH水平是评价卵巢功能是否正常的常用指标。由于尿液中FSH极不稳定，易降解为游离的α和β亚单位，这往往导致测定结果偏低。因此，准确测定尿中FSH总量是近几年来值得研究的课题之一。Qiu等将尿液中完整的FSH全部人为解离成α和β亚单位，建立了新的尿FSH酶免法，测定尿中FSH-β来反映尿中FSH总浓度，其结果与血清放免法结果之间有良好的相关性[1]，FSH高峰出现后第9～14天时尿液FSH水平可作为评价早期妊娠或自发性流产的一个生物学标记[2]。
孕激素代谢产物PdG经肾脏排泄，尿PdG水平基本反应了体内孕激素的水平。黄体中期血清孕酮或尿PdG浓度对判断排卵及黄体功能有着重要的意义[1]。Baird等人研究了217名女性共724个周期尿样雌激素及孕激素的代谢产物，用这两种指标判断月经周期有排卵的准确率为88%，有1%的周期无排卵[3]。
, http://www.100md.com
本次研究采用FSH-β酶免法和PdG酶免法，研究了20名正常女性共30个月经周期，未发现不排卵周期，亦无黄体功能不足表现。产妇尿液测定结果表明，产后70天内尚未发生排卵，判断与B超结果一致，这与Visness等人的报道结果相符[4]。尿液FSH和PdG酶免法测定具有采样方便、灵敏度高、无同位素接触等优点。同时，晨尿经过一昼夜肾脏的浓缩和排泄，基本反映了体内激素的平均水平。因此，FSH、PdG酶免法在临床实验室诊断及生殖内分泌流行病学研究方面有着实用价值。
(致谢：本课题得到了美国加州大学戴维斯分校毒理学与环境卫生研究所的大力支持，在此表示衷心感谢!)
参考文献
1 Qiu Q,Overstreet J W,Todd H,et al.Total urinary follicle stimulating hormone as a biomarker for detection of early pregnancy and periimplantation spontaneous abortion.Environ Health Perspective,1997,105(8):862
, 百拇医药
2 Qiu Q,Kuo A,Todd H,et al.Enzyme immunoassay method for urinary follicle stimulating hormone(FSH) beta subunit and its application for measurement for total urinary FSH.Fertility and Sterility,1998,69(2):278
3 Baird D D,McConnaughey D R,Weinberg C R,et al.Application of a method for estimating day of ovulation using urinary estrogen and progesterone metabolites.Epidemiology,1995,6(5):547
4 Visness C M,Kennedy K I,Gross B A,et al.Fertility of fully breast-feeding women in the early postpartum period.Obstet Gynecol,1997,89(2):164
(1999-01-29收稿，1999-05-20修回), 百拇医药
单位：南京医科大学应用毒理研究所
关键词：卵泡刺激素；孕二醇-3-葡糖苷酸；酶免法；排卵
尿液卵泡刺激素β亚单位及孕二醇 摘要 探讨尿液FSH及PdG在女性正常月经周期中或产后的变化规律及其临床意义。用酶免法测定20名育龄妇女正常月经周期及20名产妇产后40天至70天连续尿样用酶免法测定尿液中卵泡刺激素β亚单位(FSH-β)及孕二醇-3-葡糖苷酸(PdG)浓度，同时测定尿肌酐，描绘激素动态变化曲线。产妇同时动态进行妇科B超检测排卵情况。正常育龄妇女月经周期中FSH峰值浓度平均为11.38±4.69(ng/mg)Cr，峰值出现时间平均为15.2±0.8(天)，由此判断排卵时间平均为15.2±0.8(天)。PdG峰值浓度平均为15.51±5.15(μg/mg)Cr,高峰出现时间平均在FSH高峰出现后5.9±1.1(天)。产后70天内尿液FSH及PdG均无特征性高峰，平均浓度分别为3.10±1.49(ng/mg)Cr和0.68±0.39(μg/mg)Cr,与正常月经期内的基础水平相比无显著性差异(P>0.05)。B超结果显示产妇均无成熟卵泡发生。结果表明尿液FSH及PdG酶免法测定有助于临床判断排卵、指导生殖生育及其它生殖内分泌疾病的辅助诊断。
, 百拇医药
Urinary FSH-β and PdG enzyme immunoassay and its application
YANG Xiaofang,QIU Qing,ZHAO Renzhen,et al.(Institute of Applied Toxicology,Nanjing Medical University,Nanjing 210029)
Abstract To study the profiles of daily urinary FSH-β and PdG in normal reproductive and postpsrtum women,and its application in the field of reproductive medicine.Daily urinary FSH and PdG were measured with enzyme immunoassay(EIA)during menstrual cycles in 20 normal reproductive age and from day 40 to 70 of postpartum period in 20 postpartum women.The postpartum women were also examined three times by B ultrasonic test to observe the development of follicles.It showed that mean peak level of FSH in normal reproductive age women were reached 11.38±4.69 ng/mg Cr at the cycle day 15.2±0.8，PdG were reached 15.51±5.15 μg/mg Cr in the mid-luteal phase.Ovulation occurred at mean cycle day 15.2±0.8.No peak levels of FSH or PdG was found in the urine of postpartum women.B ultrasonic test showed there was no matured follicle 70 days postpartum.The EIA of presented reproductive hormones or their metabolites are of great practical value in the fields of clinic laboratory,evaluation of ovulation,monitoring ovarian function and other reproductive endocrinologic studies.
, 百拇医药
Key words follicle stimulating hormone; pregnanediol glucuronide; enzyme immunoassay; ovulation
九十年代以后，国外有文献报道用尿液酶免法(enzyme immunoassay,EIA)检测尿液生殖内分泌激素或其代谢产物[1，2]，与血清放免法结果有良好的一致性。本文运用酶免法检测了正常育龄妇女月经周期及产后70天内连续尿样中卵泡刺激素β亚单位(follicle stimulating hormone β subunit,FSH-β)及孕激素代谢产物孕二醇-3-葡糖苷酸(pregnanediol glucuronide,PdG)水平，根据两种激素的动态变化曲线来判断月经周期中是否排卵、排卵时间及黄体功能等。
1 材料和方法
1.1 材料
, http://www.100md.com
1.1.1 受检对象及尿样采集 正常育龄妇女及产妇各20名，受检期间无任何疾病或服药史，年龄范围在24～32岁。正常育龄妇女从月经第一天开始自我收集晨尿约5 ml,20名共计30个月经周期。产妇于产后40天开始每天收集一次晨尿，共30天，所有样品置-20°C冰箱保存待测。
1.1.2 主要试剂 β-FSH单抗(FS-24A-G10，Scantibodies Laboratory产品)，抗FSH-β兔抗血清由本实验室制备，FSH-β标准由美国National hormone and pituitary Program(NHPP)提供，PdG抗体及所用底物等由Dr.Lasley(Institute of Toxico-
logy & Environmental Health,University of California,Davis)提供，PdG标准品为Sigma公司产品。
, 百拇医药 1.1.3 主要仪器 全自动酶标仪(CERES 900 Scanning Autoreader)、标准96孔酶标板(Nunc)、12孔连续微量加样器、全自动尿样稀释仪等。
1.2 方法
1.2.1 FSH酶免法[2]酶标板用FSH-β单克隆抗体包被过夜，移弃包被液后加牛血清白蛋白阻断液6小时(4°C可放置10天)，洗板2次后分别加标准、内控、样品，室温下放置6小时，洗板2次后加FSH-β亚单位多克隆抗体过夜，洗板后加生物素标记的羊抗兔IgG至少2小时，洗板后加链亲合素结合的碱性磷酸酶(alkline phosphate strepavidin,APS)反应约1小时，洗板后再加底物对硝基酚磷酸(p-NPP)显色，最后用全自动酶标仪测定吸光度。
1.2.2 PdG酶免法[2] Nunc板用抗体包被过夜，洗板2次，加PBS平衡30分钟后分别加标准、内控、样品，然后立即加辣根过氧化物酶结合的PdG(PdG-HRP)竞争反应至少16小时，洗板后加底物2，2-azino-bis(3-ethylbenzethiazoline-6-sulfonic acid),简称ABTS显色，最后用酶标仪测定吸光度。
, 百拇医药
1.2.3 肌酐用碱性苦味酸法测定 尿样用蒸馏水稀释50倍后加入96孔板，用酶标仪测定吸光度。
1.2.4 数据统计 所有样品的FSH和PdG均用尿肌酐校正，结果输入计算机，用Sigma stat软件t检验统计，作图用Sigma plot软件。
1.2.5 B超 受检产妇定期在本校一附院妇科进行三次B超检查，动态观察卵泡发育情况。
2 结果
2.1 正常月经周期及产后70天内尿液FSH及PdG的变化20名正常育龄妇女尿液FSH及PdG在月经周期不同时期的平均水平详见表1。20名受检产妇产后70天内尿液FSH及PdG水平无特征性高峰出现，平均分别为3.10±1.49 ng/mg Cr和0.68±0.39 μg/mg Cr,与正常月经周期内的基础水平相比无显著性差异(P>0.05)，分别低于正常月经排卵期FSH水平或黄体中期PdG的峰值浓度(P<0.01)。
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表1 正常育龄妇女月经周期中不同时期尿液FSH及PdG水平(x±s)
Table 1 Urinary FSH and PdG level in different period of normal menstrual cycle by EIA
Different phase in menstrual cycle
Early follicle
Late follicle
Ovulating time
Mid-luteal phase
FSH
, 百拇医药 (ng/mg Cr)
3.10±1.49
0.87±0.41
11.38±4.69**
1.09±0.88
PdG
(μg/mg Cr)
1.19±0.47
2.34±1.93
15.51±5.15*
*P<0.01，compared with other periods
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2.2 正常月经周期尿FSH及PdG的变化曲线及其意义 将每个周期的尿FSH及PdG的肌酐校正值与对应日期作图，平均周期长30.6±3.5天。20名正常育龄妇女共30个周期的曲线上FSH及PdG均有特征性高峰出现。以FSH最高峰出现时间为排卵时间，FSH高峰出现时间平均为15.2±0.8(天)，由此判断排卵时间平均为15.2±0.8(天)。PdG高峰出现时间平均在FSH高峰出现后5.9±1.1(天)(图1)。
2.3 B超结果显示，20名产妇产后70天内进行的三次B超检查中卵泡直径均未达到成熟卵泡水平，均未发现排卵。
Figure 1 The profile of urinary FSH and PdG in normal menstrual cycles.The“0”in X-axis represents the FSH-surge time in each cycle.Each value in the curve represents the mean level of FSH of PdG in different day before or after FSH surge
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图1 20名正常女性共30个月经周期每天尿液FSH和PdG的变化曲线(曲线横坐标上0表示FSH峰值出现时间，曲线上每点表示每个周期内距FSH峰值出现不同时间的平均浓度及标准差。)
3 讨论
卵泡刺激素和孕激素是调节女性生殖内分泌功能的两种重要的激素。卵泡早期FSH水平是评价卵巢功能是否正常的常用指标。由于尿液中FSH极不稳定，易降解为游离的α和β亚单位，这往往导致测定结果偏低。因此，准确测定尿中FSH总量是近几年来值得研究的课题之一。Qiu等将尿液中完整的FSH全部人为解离成α和β亚单位，建立了新的尿FSH酶免法，测定尿中FSH-β来反映尿中FSH总浓度，其结果与血清放免法结果之间有良好的相关性[1]，FSH高峰出现后第9～14天时尿液FSH水平可作为评价早期妊娠或自发性流产的一个生物学标记[2]。
孕激素代谢产物PdG经肾脏排泄，尿PdG水平基本反应了体内孕激素的水平。黄体中期血清孕酮或尿PdG浓度对判断排卵及黄体功能有着重要的意义[1]。Baird等人研究了217名女性共724个周期尿样雌激素及孕激素的代谢产物，用这两种指标判断月经周期有排卵的准确率为88%，有1%的周期无排卵[3]。
, http://www.100md.com
本次研究采用FSH-β酶免法和PdG酶免法，研究了20名正常女性共30个月经周期，未发现不排卵周期，亦无黄体功能不足表现。产妇尿液测定结果表明，产后70天内尚未发生排卵，判断与B超结果一致，这与Visness等人的报道结果相符[4]。尿液FSH和PdG酶免法测定具有采样方便、灵敏度高、无同位素接触等优点。同时，晨尿经过一昼夜肾脏的浓缩和排泄，基本反映了体内激素的平均水平。因此，FSH、PdG酶免法在临床实验室诊断及生殖内分泌流行病学研究方面有着实用价值。
(致谢：本课题得到了美国加州大学戴维斯分校毒理学与环境卫生研究所的大力支持，在此表示衷心感谢!)
参考文献
1 Qiu Q,Overstreet J W,Todd H,et al.Total urinary follicle stimulating hormone as a biomarker for detection of early pregnancy and periimplantation spontaneous abortion.Environ Health Perspective,1997,105(8):862
, 百拇医药
2 Qiu Q,Kuo A,Todd H,et al.Enzyme immunoassay method for urinary follicle stimulating hormone(FSH) beta subunit and its application for measurement for total urinary FSH.Fertility and Sterility,1998,69(2):278
3 Baird D D,McConnaughey D R,Weinberg C R,et al.Application of a method for estimating day of ovulation using urinary estrogen and progesterone metabolites.Epidemiology,1995,6(5):547
4 Visness C M,Kennedy K I,Gross B A,et al.Fertility of fully breast-feeding women in the early postpartum period.Obstet Gynecol,1997,89(2):164
(1999-01-29收稿，1999-05-20修回), 百拇医药