脐血造血干/祖细胞研究现状及临床应用
作者：许文荣 胡嘉波 顾可梁
单位：镇江医学院检验系
关键词：
临床检验杂志990542 80年代以来，脐血作为造血干/祖细胞来源治疗血液病患者的有效方法受人们关注，由于临床血液疾病治疗的迫切需要，近年来较多的临床血液病和实验血液学工作者为此付出了各自艰巨的努力，在脐血的采集、造血干/祖细胞的分离、鉴定、体外扩增及临床应用方面均取得了显著成就，本文将这些研究成果作一概要文献学习。
1 脐血造血干/祖细胞的含量和特性
脐血中含有较丰富的更原始、能重建长期造血的干/祖细胞，具有较强的自我增殖、多向分化的能力，是造血干/祖细胞又一丰富来源。脐血中约有1%左右的有核细胞表达高水平的CD34抗原的表达。脐血CD34+细胞占有核细胞比例略低于骨髓，但CD34+细胞中CD34+CD38-亚群比例明显高于骨髓。1996年Darena[1]用流式细胞仪对脐血中的CD34+细胞作双标记定量分析发现，CD34占0.84±0.83%，大部分CD34+细胞属于初始(initial)髓系分化细胞(CD34+ CD33+)和运铁蛋白因子受体(CD71+)；近40%的细胞同时表达CD45RA和CD117，很少细胞表达CD2、CD5、CD41(<2%)；表达淋巴细胞分化标记如CD2、CD5、CD7、CD10和CD19则小于6%。约有11%的CD34+细胞其表面缺乏HLA-DR和CD38。与骨髓和外周血相比人脐血(HUCB)CD34+细胞具有高度特异性。Kogler[2]对574份脐血的研究结果显示，平均总的有核细胞数(NC)：8.5±5×108，红系祖细胞(BFU-E)：9.5±8.6×105，粒单系祖细胞(CFU-GM)：5.7±6.3×105，粒、红、单、巨核混合祖细胞(CFU-GEMM)：1.6±1.9×105。本室研究结果显示[10]，CD34+细胞较文献报道要高，而造血干/祖细胞存在形态学上的不均一性。
, 百拇医药
2 脐血造血干/祖细胞的分离和纯化
脐血造血干/祖细胞的分离和纯化是研究脐血造血干/祖细胞和临床应用的关键因素之一，迄今有以下几种方法用于脐血造血干/祖细胞的分离和纯化：①单纯离心分离法，该方法分离的干/祖细胞损失率达40～80%；②不连续密度梯度离心法，脐血干/祖细胞主要集中于低密度(近1.063 g/ml)组分中，该方法增加了体外操作的过程，易污染；③三联袋(tripleblood bagsystem)分步离心浓集法，该法可除去59%RBC，体积减少56%，CD34+细胞回收率为87%[3]；④Ficoll、peroll、甲基纤维素、明胶、淀粉等方法，有结果表明明胶法干/祖细胞损失率较低，集落形成细胞(CFC)、CD34+细胞的回收率分别为92%和86%；⑤免疫磁珠吸附法(MACS)，生物素-抗生素亲和柱法，这些方法具有快速、纯度好、产量高等优点，现已趋于商品化，并有应用于临床的报道；⑥流式细胞技术分选法(FCM)，该方法以流式细胞仪分选CD34+及其亚群细胞纯度可高达95%～99%，是目前分选CD34+细胞纯度最高的方法，但耗时费资，产率并不高，也难保持无菌，目前主要应用于科研。因此选择较好的脐血干/祖细胞分离纯化的方法既要考虑纯度、产率、又要顾及生物学活性及临床应用的可行性。
, 百拇医药
3 脐血造血细胞的体外扩增
虽然脐血造血干/祖细胞有极强的增殖能力，但单份脐血中造血干/祖细胞含量少，难以满足成人受者造血重建的需要，因而很大程度上限制了脐血造血干/祖细胞的临床应用。为此国内外学者做了大量的工作。1992年Broxmeyer[4]率先采用干细胞因子(SCF)联合GM-CSF，EPO，IL-3扩增脐血MNC，但扩增后的细胞已不是具有增殖和分化双重能力的造血干/祖细胞，因而给临床应用带来了许多困难。1997年Piacibello等[5]从脐血中分离出CD34+细胞，采用无骨髓基质的液体培养系统，观察了多种细胞因子对脐血造血干/祖细胞的扩增情况，IL-3+FL(FLT3-Ligand)，IL-3+KL(c-kit ligand)，IL-3+FL+KL,KL+FL,IL-6+FL+KL,8周后细胞数均得到了极大的扩增，其中IL-6+FL+KL扩增细胞近3万倍，CFU-GM增加了200倍，KL+FL扩增细胞数近1万倍，CFU-GM增加了近400倍，FL+TPO(thrombopoietin)培养脐血CD34+细胞6个月，细胞扩增了千万倍，其中CD34+CD38-细胞扩增了3千万倍，CD34+ CD38+细胞扩增了1千万倍，CFU-GM增加了1千万倍，BFU-E扩增了12.2万倍，混合造血祖细胞(CFU-MIX)扩增了4.5万倍，CFU-GEMM扩增了2.7万倍，长期培养起始细胞(LTC-IC)(培养20周)扩增了8.3万倍，CFU-Blast(培养20周)扩增了30万倍。Mayani用(Ⅰ)SCF+IL-6+FP(GM-CSF/IL3融合蛋白)+GM-CSF+G-CSF,(Ⅱ)MGF(SCF)+IL-6+IL-3+EP和(Ⅲ)SCF+IL-6+FP+M-CSF+G-CSF+EPO等三种因子组合，以流式细胞技术观察CD34+CD45RALO。CD71LO亚群细胞的扩增情况，结果认为，因子组合Ⅰ和Ⅱ分别使髓系祖细胞，成熟细胞和红系祖细胞达最大增殖率(前者CFU-C增殖70倍，后者BFU-E增殖55倍)，因而分别将因子组合Ⅰ和Ⅱ称做髓系优势因子组合和红系优势因子组合；因子组合Ⅲ则能使红、髓系祖细胞同时达到最高扩增率。国内裴雪涛等的研究表明，脐血CD34+细胞在SCF、IL-3、IL-6、GM-CSF、G-CSF和EPO等细胞因子刺激下，CD34+、CFC细胞和细胞总数分别扩增约25、100和500倍[6]。
, http://www.100md.com
尽管人们在脐血造血干/祖细胞扩增方面做了很多的努力，但利用扩增的脐血造血干/祖细胞移植成功的报道目前尚未见到。可以认为脐血造血干/祖细胞外扩增及临床应用值得深入研究，不久将会给许多血液病病人带来福音。
4 脐血造血干/祖细胞的临床应用[7，8，9]
脐血造血干/祖细胞的临床应用主要应用于血液系统恶性肿瘤及某些实体肿瘤的治疗。脐血率先治疗Fanconi贫血获得成功，因而不断地应用临床，在美、英、法等国相继建立了脐血库。我国北京医科大学，苏州医学院，上海儿童医学中心等均采用脐血造血干/祖细胞治疗血液系统恶性肿瘤有获得成功的报道。脐血造血干/祖细胞在临床应用中虽然存在组织配型等问题，但由于脐血中其他免疫活性细胞在造血干/祖细胞分离中去除一部分，同时，脐血中的这些细胞免疫活性较低，发生GVHD的可能性较骨髓移植小，因而，脐血造血干/祖细胞的移植具有良好的应用前景。
, 百拇医药 参考文献
1 Darena G,Musto P,Cascavilla V,et al.Human umbilical cord blood:immunophenotypic heterogeneity of CD34+ hematopoietic progenitor cells.Haematologica,1996,81(5):404
2 Kogler G,Callejas J,Hakenberg P,et al.Hematopoietic transplant potential of unrelated cord blood:critical issues.J Hematother,1996,5(2):105
3 Sousa T,de Sousa M E,Godinho MI,et al.Umbilical cord blood processing:volume reduction and recovery of CD34+ cells.Bone Marrow Transplantation,1997,19(4):311
, 百拇医药
4 Broxmeyer H E,Hangoc G,Coopers,et al.Growth characteristics and expansion of human umbilical cord blood and estimation of its potential for transplantation in adults.Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:4 109
5 Piacibello W,Sanavio F,Garetto L,et al.Extensive amplification and self-renewal of human primitive hematopoietic stem cells from cord blood.Blood,1997,89(8):2 644
6 裴雪涛，王立生，徐黎，等.脐血CD34+细胞扩增和改善其移植效率的实验研究.中华血液学杂志，1997，18(3)：133
, http://www.100md.com
7 Denning Kendall P A,Nicol A,Horsley H,et al.Is in vitro expansion of human cord blood cells clinically relevant?Bone Marrow Transplant,1998,21(3):225
8 Denning Kendall P A,Horsley H,Nicol A,et al.Clinical application of in vitro expansion of cord blood.Bone Marrow Transplant,1998,22(suppl 1):s63
9 Burgio G R,Locatelli F.Transplant of bone marrow and cord blood hematopoietic stem cells in pediatric practice,revisited according to the fundamental principles of bioethics.Bone Marrow Transplant,1997,19(12):1 163
10 胡嘉波，许文荣，朱伟，等.脐血细胞成份及造血干/祖细胞的定量研究.镇江医学院学报，1998，8：437
(1999-05-20收稿), 百拇医药
单位：镇江医学院检验系
关键词：
临床检验杂志990542 80年代以来，脐血作为造血干/祖细胞来源治疗血液病患者的有效方法受人们关注，由于临床血液疾病治疗的迫切需要，近年来较多的临床血液病和实验血液学工作者为此付出了各自艰巨的努力，在脐血的采集、造血干/祖细胞的分离、鉴定、体外扩增及临床应用方面均取得了显著成就，本文将这些研究成果作一概要文献学习。
1 脐血造血干/祖细胞的含量和特性
脐血中含有较丰富的更原始、能重建长期造血的干/祖细胞，具有较强的自我增殖、多向分化的能力，是造血干/祖细胞又一丰富来源。脐血中约有1%左右的有核细胞表达高水平的CD34抗原的表达。脐血CD34+细胞占有核细胞比例略低于骨髓，但CD34+细胞中CD34+CD38-亚群比例明显高于骨髓。1996年Darena[1]用流式细胞仪对脐血中的CD34+细胞作双标记定量分析发现，CD34占0.84±0.83%，大部分CD34+细胞属于初始(initial)髓系分化细胞(CD34+ CD33+)和运铁蛋白因子受体(CD71+)；近40%的细胞同时表达CD45RA和CD117，很少细胞表达CD2、CD5、CD41(<2%)；表达淋巴细胞分化标记如CD2、CD5、CD7、CD10和CD19则小于6%。约有11%的CD34+细胞其表面缺乏HLA-DR和CD38。与骨髓和外周血相比人脐血(HUCB)CD34+细胞具有高度特异性。Kogler[2]对574份脐血的研究结果显示，平均总的有核细胞数(NC)：8.5±5×108，红系祖细胞(BFU-E)：9.5±8.6×105，粒单系祖细胞(CFU-GM)：5.7±6.3×105，粒、红、单、巨核混合祖细胞(CFU-GEMM)：1.6±1.9×105。本室研究结果显示[10]，CD34+细胞较文献报道要高，而造血干/祖细胞存在形态学上的不均一性。
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2 脐血造血干/祖细胞的分离和纯化
脐血造血干/祖细胞的分离和纯化是研究脐血造血干/祖细胞和临床应用的关键因素之一，迄今有以下几种方法用于脐血造血干/祖细胞的分离和纯化：①单纯离心分离法，该方法分离的干/祖细胞损失率达40～80%；②不连续密度梯度离心法，脐血干/祖细胞主要集中于低密度(近1.063 g/ml)组分中，该方法增加了体外操作的过程，易污染；③三联袋(tripleblood bagsystem)分步离心浓集法，该法可除去59%RBC，体积减少56%，CD34+细胞回收率为87%[3]；④Ficoll、peroll、甲基纤维素、明胶、淀粉等方法，有结果表明明胶法干/祖细胞损失率较低，集落形成细胞(CFC)、CD34+细胞的回收率分别为92%和86%；⑤免疫磁珠吸附法(MACS)，生物素-抗生素亲和柱法，这些方法具有快速、纯度好、产量高等优点，现已趋于商品化，并有应用于临床的报道；⑥流式细胞技术分选法(FCM)，该方法以流式细胞仪分选CD34+及其亚群细胞纯度可高达95%～99%，是目前分选CD34+细胞纯度最高的方法，但耗时费资，产率并不高，也难保持无菌，目前主要应用于科研。因此选择较好的脐血干/祖细胞分离纯化的方法既要考虑纯度、产率、又要顾及生物学活性及临床应用的可行性。
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3 脐血造血细胞的体外扩增
虽然脐血造血干/祖细胞有极强的增殖能力，但单份脐血中造血干/祖细胞含量少，难以满足成人受者造血重建的需要，因而很大程度上限制了脐血造血干/祖细胞的临床应用。为此国内外学者做了大量的工作。1992年Broxmeyer[4]率先采用干细胞因子(SCF)联合GM-CSF，EPO，IL-3扩增脐血MNC，但扩增后的细胞已不是具有增殖和分化双重能力的造血干/祖细胞，因而给临床应用带来了许多困难。1997年Piacibello等[5]从脐血中分离出CD34+细胞，采用无骨髓基质的液体培养系统，观察了多种细胞因子对脐血造血干/祖细胞的扩增情况，IL-3+FL(FLT3-Ligand)，IL-3+KL(c-kit ligand)，IL-3+FL+KL,KL+FL,IL-6+FL+KL,8周后细胞数均得到了极大的扩增，其中IL-6+FL+KL扩增细胞近3万倍，CFU-GM增加了200倍，KL+FL扩增细胞数近1万倍，CFU-GM增加了近400倍，FL+TPO(thrombopoietin)培养脐血CD34+细胞6个月，细胞扩增了千万倍，其中CD34+CD38-细胞扩增了3千万倍，CD34+ CD38+细胞扩增了1千万倍，CFU-GM增加了1千万倍，BFU-E扩增了12.2万倍，混合造血祖细胞(CFU-MIX)扩增了4.5万倍，CFU-GEMM扩增了2.7万倍，长期培养起始细胞(LTC-IC)(培养20周)扩增了8.3万倍，CFU-Blast(培养20周)扩增了30万倍。Mayani用(Ⅰ)SCF+IL-6+FP(GM-CSF/IL3融合蛋白)+GM-CSF+G-CSF,(Ⅱ)MGF(SCF)+IL-6+IL-3+EP和(Ⅲ)SCF+IL-6+FP+M-CSF+G-CSF+EPO等三种因子组合，以流式细胞技术观察CD34+CD45RALO。CD71LO亚群细胞的扩增情况，结果认为，因子组合Ⅰ和Ⅱ分别使髓系祖细胞，成熟细胞和红系祖细胞达最大增殖率(前者CFU-C增殖70倍，后者BFU-E增殖55倍)，因而分别将因子组合Ⅰ和Ⅱ称做髓系优势因子组合和红系优势因子组合；因子组合Ⅲ则能使红、髓系祖细胞同时达到最高扩增率。国内裴雪涛等的研究表明，脐血CD34+细胞在SCF、IL-3、IL-6、GM-CSF、G-CSF和EPO等细胞因子刺激下，CD34+、CFC细胞和细胞总数分别扩增约25、100和500倍[6]。
, http://www.100md.com
尽管人们在脐血造血干/祖细胞扩增方面做了很多的努力，但利用扩增的脐血造血干/祖细胞移植成功的报道目前尚未见到。可以认为脐血造血干/祖细胞外扩增及临床应用值得深入研究，不久将会给许多血液病病人带来福音。
4 脐血造血干/祖细胞的临床应用[7，8，9]
脐血造血干/祖细胞的临床应用主要应用于血液系统恶性肿瘤及某些实体肿瘤的治疗。脐血率先治疗Fanconi贫血获得成功，因而不断地应用临床，在美、英、法等国相继建立了脐血库。我国北京医科大学，苏州医学院，上海儿童医学中心等均采用脐血造血干/祖细胞治疗血液系统恶性肿瘤有获得成功的报道。脐血造血干/祖细胞在临床应用中虽然存在组织配型等问题，但由于脐血中其他免疫活性细胞在造血干/祖细胞分离中去除一部分，同时，脐血中的这些细胞免疫活性较低，发生GVHD的可能性较骨髓移植小，因而，脐血造血干/祖细胞的移植具有良好的应用前景。
, 百拇医药 参考文献
1 Darena G,Musto P,Cascavilla V,et al.Human umbilical cord blood:immunophenotypic heterogeneity of CD34+ hematopoietic progenitor cells.Haematologica,1996,81(5):404
2 Kogler G,Callejas J,Hakenberg P,et al.Hematopoietic transplant potential of unrelated cord blood:critical issues.J Hematother,1996,5(2):105
3 Sousa T,de Sousa M E,Godinho MI,et al.Umbilical cord blood processing:volume reduction and recovery of CD34+ cells.Bone Marrow Transplantation,1997,19(4):311
, 百拇医药
4 Broxmeyer H E,Hangoc G,Coopers,et al.Growth characteristics and expansion of human umbilical cord blood and estimation of its potential for transplantation in adults.Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:4 109
5 Piacibello W,Sanavio F,Garetto L,et al.Extensive amplification and self-renewal of human primitive hematopoietic stem cells from cord blood.Blood,1997,89(8):2 644
6 裴雪涛，王立生，徐黎，等.脐血CD34+细胞扩增和改善其移植效率的实验研究.中华血液学杂志，1997，18(3)：133
, http://www.100md.com
7 Denning Kendall P A,Nicol A,Horsley H,et al.Is in vitro expansion of human cord blood cells clinically relevant?Bone Marrow Transplant,1998,21(3):225
8 Denning Kendall P A,Horsley H,Nicol A,et al.Clinical application of in vitro expansion of cord blood.Bone Marrow Transplant,1998,22(suppl 1):s63
9 Burgio G R,Locatelli F.Transplant of bone marrow and cord blood hematopoietic stem cells in pediatric practice,revisited according to the fundamental principles of bioethics.Bone Marrow Transplant,1997,19(12):1 163
10 胡嘉波，许文荣，朱伟，等.脐血细胞成份及造血干/祖细胞的定量研究.镇江医学院学报，1998，8：437
(1999-05-20收稿), 百拇医药