涎腺肿瘤C-erbB-2癌基因mRNA表达的研究
作者：孙宏晨 吴珊 欧阳喈
单位：孙宏晨、欧阳喈 130041长春，白求恩医科大学口腔医学院；吴珊 白求恩医科大学基础医学院
关键词：涎腺肿瘤；RNA；免疫组织化学
中华口腔医学杂志990511 【摘要】 目的 探讨C-erbB-2mRNA表达水平同涎腺肿瘤组织类型、发生和生物学性质的关系。方法 采用Dotblot杂交，以32P标记的寡核苷酸探针，以正常涎腺为对照，对涎腺肿瘤C-erbB-2mRNA表达进行研究。结果 正常涎腺和涎腺肿瘤中发现不同程度C-erbB-2mRNA的表达，以正常涎腺组织的表达水平为基准，在腺淋巴瘤、基底细胞腺瘤呈现低表达、无表达或与正常涎腺组织表达水平相似，多形性腺瘤、粘液表皮样癌、腺泡细胞癌、腺样囊性癌、乳头状囊腺癌和肌上皮癌则呈现不同程度的过表达。结论 C-erbB-2表达水平同涎腺肿瘤的生物学性质有关。
, 百拇医药
Expression of C-erbB-2 oncogene mRNA in salivary gland tumors
SUN Hongchen， WU Shan， OUYANG Jie.
School of Stomatology， Norman Bethune University of Medical Sciences， Changchun 130041
【Abstract】 Objective To study relationship of C-erbB-2 oncogene mRNA expression and histotype, tumorigenesis and biological behavior of salivary gland neoplasms.Methods Using 32P labeled oligonucleotide as probe, the dot blot technique was used to study the expression of C-erbB-2 oncogene mRNA in salivary gland neoplasm with normal salivary gland as control. Results With the expression in normal salivary gland as a standard, low C-erbB-2 mRNA expression was seen in adenolymphoma, basal cell adenoma. However, various degrees of over-expression of C-erbB-2 oncogene mRNA were detected in pleomorphic adenoma, mucoepidermoid carcinoma,acinic cell carcinoma ,adenoid cystic carcinoma ,papillary cystic carcinoma,and myoethelial cell carcinoma. Conclusion C-erbB-2 oncogene mRNA over-expression in salivary gland neoplasm is related to biological behavior of salivary gland carcinoma.
, http://www.100md.com
【Key words】 Salivary gland neoplasms RNA Immunohistochemistry
C-erbB-2癌基因最初由Shin从大鼠神经胶质瘤中分离，它定位于人类染色体17q21上，编码的蛋白质与表皮生长因子受体相似，具有酪氨酸激酶活性，广泛分布于皮肤、肌肉、骨、涎腺、乳腺、胃、肠、肺及卵巢等组织脏器。我们采用Dotblot杂交以32P标记的寡核苷酸探针对涎腺良性、恶性肿瘤进行C-erbB-2mRNA表达研究，以探讨C-erbB-2mRNA的表达同涎腺肿瘤组织类型、发生和生物学性质的关系。
材料和方法
1.探针:为跨人类C-erbB-2癌基因外显子6、7的28个寡核苷酸，序列为5'-CCC AAG TCC TCA TTC TAC CTG GAT GACC-3'，经T4多核苷酸激酶标记系统(promeg公司)以32P(ATP)对其5'末端进行标记。
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2.组织:表1。
表1 C-erbB-2癌基因mRNA表达(例) 分组
例数
-
+
++
正常组织
腮腺
4
0
4
0
颌下腺
, 百拇医药
5
0
5
0
涎腺良性肿瘤
腺淋巴瘤
4
2
2
0
基底细胞腺瘤
3
3
0
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0
多形性腺瘤
12
0
0
12
涎腺恶性肿瘤
粘液表皮样癌
9
2
0
7
乳头状囊腺癌
, 百拇医药 6
0
0
6
腺泡细胞癌
4
0
1
3
腺样囊性癌
4
0
0
4
, 百拇医药
肌上皮癌
2
0
0
2
3.RNA的提取:常规尿素氯化锂法的基础上增加一步蛋白酶K消化1h的改良方法，定量以瑞典产RNA/DNACalculator进行。
4.Dotblot杂交：每种组织的RNA样品15μg常规行变性处理，点样量为60.00、30.00、15.00、7.50、3.75及1.88μl。65℃条件下预杂交7h(预杂交液内含5XSSC，5XDenhardt液，50mmol/L磷酸缓冲液，0.2%SDS)。将32P标记的探针加入到上述预杂交液中，65℃杂交12h，常规漂洗。于-70℃曝光24h。在暗室中X线片显影，定影。
, 百拇医药
结果
1.正常组织：9例正常涎腺组织均阳性，各例正常涎腺组织阳性程度基本相似，以正常涎腺的阳性程度为标准，评价良、恶性肿瘤的表达水平(表1)。
2.良性肿瘤：腺淋巴瘤、基底细胞腺瘤的信号强度与正常涎腺相似，2例腺淋巴瘤表达水平比正常涎腺低甚至未见表达。与此相对，在所有的多形性腺瘤组织，其C-erbB-2mRNA水平均呈现高表达。
3.恶性肿瘤：粘液表皮样癌中7例，腺泡细胞癌中3例及全部肌上皮癌、乳头状囊腺癌和所有腺样囊性癌的C-erbB-2mRNA比正常涎腺的表达水平高，有的甚至比多形性腺瘤表达水平还高。
讨论
癌基因在正常细胞的发生和维持其功能中起重要作用，C-erbB-2癌基因功能的异常在肿瘤发生中起关键作用。实验证明，C-erbB-2癌基因可使转基因动物产生肿瘤。在人细胞中该基因活化方式主要有基因扩增、重排及其产物的过表达(包括转录水平和翻译水平的过表达，表现为细胞内蛋白的积聚)，研究结果表明，该基因的激活可影响到肿瘤的发展进程和转归。
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C-erbB-2做为与细胞增殖有关的癌基因，其mRNA的表达与肿瘤的恶性度高、生长速度快、存活期短相关[1]，与肿瘤分级、病理分型、淋巴结转移及生存率有关[2]。有报道它可能成为一个独立的预后判定指标[3]，这在乳腺肿瘤的研究中已经得到证明。乳腺癌和卵巢癌的研究结果表明，C-erbB-2癌基因的扩增同肿瘤的预后有关。Slamon等[4]发现约30%的患者存在C-erbB-2癌基因的扩增和表达。我们的研究结果证明，C-erbB-2癌基因mRNA在涎腺多形性腺瘤、腺泡细胞癌、腺样囊性癌、乳头状囊腺癌中的表达明显高于正常涎腺，在多形性腺瘤中的过表达说明该肿瘤易复发、恶变。与此相比，腺淋巴瘤、基底细胞腺瘤却很少恶变。一些肿瘤C-erbB-2癌基因mRNA表达水平低于正常涎腺，可能部分涎腺为肿瘤周围涎腺组织，在形态和分子水平上已发生某些改变，如发生导管上皮的增生，基因表达的累积不属于正常涎腺范围，通过原位杂交技术已经在部分涎腺发现导管上皮增生，并证明有过表达的C-erbB-2mRNA信号存在。在恶性肿瘤中C-erbB-2mRNA的表达水平比多形性腺瘤中的还高。C-erbB-2是参与涎腺恶性肿瘤发生的相关基因。正常情况下，C-erbB-2作为细胞信号传递中的调控因子，不仅参与细胞增殖而且影响到细胞的生长分化，正常涎腺C-erbB-2在外界各种致癌因素作用下可能处于量的积累状态，一旦癌变，C-erbB-2mRNA表达便发生根本性变化。恶性肿瘤C-erbB-2癌基因在转录水平呈过度表达，相似于乳腺的研究结果，可能同二者在组织学结构、胚胎发生过程和病理学形态上相似有关。
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近年来，肿瘤的发生被认为是一多阶段多步骤的连续过程[5]，其间涉及多个癌基因的激活和抑癌基因的失活，通过它们所表达产物的不同影响细胞生长、分化及调控过程，最终引发癌变。本研究中，同一类型肿瘤如腺泡细胞癌、粘液表皮样癌并非均高表达，其原因除考虑RNA操作过程中的分解外，多基因、多阶段、多过程参与涎腺肿瘤发生亦不能排除，即使同一类型肿瘤在发生过程中的不同发展阶段参与的基因可能不同。
柴雨力等[6]根据对培养人乳腺上皮细胞化学致癌过程中C-erbB-2基因改变研究提出C-erbB-2参与癌转化过程中活动形式可能有二种，一是通过DNA扩增来增加表达，二是直接通过增强基因转录活性来增加表达，后者很可能是致癌物或细胞内某些致癌物激活因子起了一种转录活性因子作用，而且一旦被启动，即使致癌物消除后这种高转录活性仍持续存在，这一结果对阐明癌的发生机制有一定指导意义。Riviere等[7]对头颈部鳞状细胞癌和乳腺癌研究发现C-erbB-2癌基因mRNA在乳腺癌中的高表达更显著，提示C-erbB-2癌基因表达调节过程可能同腺上皮/肌上皮细胞恶性转化与分化过程中有规律地发生基因重排、基因扩增或基因突变等基因组重建有关。
, 百拇医药
卫生部青年基金资助课题(93125)
参考文献
1 Pisani AL,Barbuto DA,Chen D, et al. HER-2/neu,p53 and DNA analyses as prognosticators for survival in endometrial carcinoma. Obstet Gynecol， 1995，85:729-734.
2 Kristensen GB, Holm R, Abeler VM, et al.Evaluation of the prognostic significance of cathepsin D,epidermal growth factor receptor, and c-erbB-2 in early cervical squamous cellcarcinoma. An immunohisto-chemical study. Cancer, 1996,78:433-440.
, 百拇医药
3 Gusterson BA,Gelber RD,Goldhirsch A,et al.Prognostic importance of c-erbB-2 expression in breast cancer.International (ludwing) breat cancar study group.J Clin Oncol, 1992,10:1049-1056.
4 Slamon DJ,Godolphin W,Jones LA,et al.Studies of the HER-2/neu proto-oncogene in human breast and ovarian cancer.Science ,1989,244:707-712.
5 关谷刚男 .癌关连遗传子群の解析 .蛋白质 核酸 酵素 ,1993,38:314-319.
6 柴雨力 ,何德渊 ,张佩莉.培养人乳腺上皮细胞化学致癌过程中C-erbB-2基因研究 .中华
病理学杂志 ,1996,25:374-375.
7 Riviere A,Becker J,Loning T.Comparative investigation of C-erbB-2/neu expression in head and neck tumours and mammary cancer.Cancer ,1991,67:2142-2149.
(收稿:1998-08-24 修回:1999-03-03), 百拇医药
单位：孙宏晨、欧阳喈 130041长春，白求恩医科大学口腔医学院；吴珊 白求恩医科大学基础医学院
关键词：涎腺肿瘤；RNA；免疫组织化学
中华口腔医学杂志990511 【摘要】 目的 探讨C-erbB-2mRNA表达水平同涎腺肿瘤组织类型、发生和生物学性质的关系。方法 采用Dotblot杂交，以32P标记的寡核苷酸探针，以正常涎腺为对照，对涎腺肿瘤C-erbB-2mRNA表达进行研究。结果 正常涎腺和涎腺肿瘤中发现不同程度C-erbB-2mRNA的表达，以正常涎腺组织的表达水平为基准，在腺淋巴瘤、基底细胞腺瘤呈现低表达、无表达或与正常涎腺组织表达水平相似，多形性腺瘤、粘液表皮样癌、腺泡细胞癌、腺样囊性癌、乳头状囊腺癌和肌上皮癌则呈现不同程度的过表达。结论 C-erbB-2表达水平同涎腺肿瘤的生物学性质有关。
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Expression of C-erbB-2 oncogene mRNA in salivary gland tumors
SUN Hongchen， WU Shan， OUYANG Jie.
School of Stomatology， Norman Bethune University of Medical Sciences， Changchun 130041
【Abstract】 Objective To study relationship of C-erbB-2 oncogene mRNA expression and histotype, tumorigenesis and biological behavior of salivary gland neoplasms.Methods Using 32P labeled oligonucleotide as probe, the dot blot technique was used to study the expression of C-erbB-2 oncogene mRNA in salivary gland neoplasm with normal salivary gland as control. Results With the expression in normal salivary gland as a standard, low C-erbB-2 mRNA expression was seen in adenolymphoma, basal cell adenoma. However, various degrees of over-expression of C-erbB-2 oncogene mRNA were detected in pleomorphic adenoma, mucoepidermoid carcinoma,acinic cell carcinoma ,adenoid cystic carcinoma ,papillary cystic carcinoma,and myoethelial cell carcinoma. Conclusion C-erbB-2 oncogene mRNA over-expression in salivary gland neoplasm is related to biological behavior of salivary gland carcinoma.
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【Key words】 Salivary gland neoplasms RNA Immunohistochemistry
C-erbB-2癌基因最初由Shin从大鼠神经胶质瘤中分离，它定位于人类染色体17q21上，编码的蛋白质与表皮生长因子受体相似，具有酪氨酸激酶活性，广泛分布于皮肤、肌肉、骨、涎腺、乳腺、胃、肠、肺及卵巢等组织脏器。我们采用Dotblot杂交以32P标记的寡核苷酸探针对涎腺良性、恶性肿瘤进行C-erbB-2mRNA表达研究，以探讨C-erbB-2mRNA的表达同涎腺肿瘤组织类型、发生和生物学性质的关系。
材料和方法
1.探针:为跨人类C-erbB-2癌基因外显子6、7的28个寡核苷酸，序列为5'-CCC AAG TCC TCA TTC TAC CTG GAT GACC-3'，经T4多核苷酸激酶标记系统(promeg公司)以32P(ATP)对其5'末端进行标记。
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2.组织:表1。
表1 C-erbB-2癌基因mRNA表达(例) 分组
例数
-
+
++
正常组织
腮腺
4
0
4
0
颌下腺
, 百拇医药
5
0
5
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涎腺良性肿瘤
腺淋巴瘤
4
2
2
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基底细胞腺瘤
3
3
0
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0
多形性腺瘤
12
0
0
12
涎腺恶性肿瘤
粘液表皮样癌
9
2
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7
乳头状囊腺癌
, 百拇医药 6
0
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6
腺泡细胞癌
4
0
1
3
腺样囊性癌
4
0
0
4
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肌上皮癌
2
0
0
2
3.RNA的提取:常规尿素氯化锂法的基础上增加一步蛋白酶K消化1h的改良方法，定量以瑞典产RNA/DNACalculator进行。
4.Dotblot杂交：每种组织的RNA样品15μg常规行变性处理，点样量为60.00、30.00、15.00、7.50、3.75及1.88μl。65℃条件下预杂交7h(预杂交液内含5XSSC，5XDenhardt液，50mmol/L磷酸缓冲液，0.2%SDS)。将32P标记的探针加入到上述预杂交液中，65℃杂交12h，常规漂洗。于-70℃曝光24h。在暗室中X线片显影，定影。
, 百拇医药
结果
1.正常组织：9例正常涎腺组织均阳性，各例正常涎腺组织阳性程度基本相似，以正常涎腺的阳性程度为标准，评价良、恶性肿瘤的表达水平(表1)。
2.良性肿瘤：腺淋巴瘤、基底细胞腺瘤的信号强度与正常涎腺相似，2例腺淋巴瘤表达水平比正常涎腺低甚至未见表达。与此相对，在所有的多形性腺瘤组织，其C-erbB-2mRNA水平均呈现高表达。
3.恶性肿瘤：粘液表皮样癌中7例，腺泡细胞癌中3例及全部肌上皮癌、乳头状囊腺癌和所有腺样囊性癌的C-erbB-2mRNA比正常涎腺的表达水平高，有的甚至比多形性腺瘤表达水平还高。
讨论
癌基因在正常细胞的发生和维持其功能中起重要作用，C-erbB-2癌基因功能的异常在肿瘤发生中起关键作用。实验证明，C-erbB-2癌基因可使转基因动物产生肿瘤。在人细胞中该基因活化方式主要有基因扩增、重排及其产物的过表达(包括转录水平和翻译水平的过表达，表现为细胞内蛋白的积聚)，研究结果表明，该基因的激活可影响到肿瘤的发展进程和转归。
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C-erbB-2做为与细胞增殖有关的癌基因，其mRNA的表达与肿瘤的恶性度高、生长速度快、存活期短相关[1]，与肿瘤分级、病理分型、淋巴结转移及生存率有关[2]。有报道它可能成为一个独立的预后判定指标[3]，这在乳腺肿瘤的研究中已经得到证明。乳腺癌和卵巢癌的研究结果表明，C-erbB-2癌基因的扩增同肿瘤的预后有关。Slamon等[4]发现约30%的患者存在C-erbB-2癌基因的扩增和表达。我们的研究结果证明，C-erbB-2癌基因mRNA在涎腺多形性腺瘤、腺泡细胞癌、腺样囊性癌、乳头状囊腺癌中的表达明显高于正常涎腺，在多形性腺瘤中的过表达说明该肿瘤易复发、恶变。与此相比，腺淋巴瘤、基底细胞腺瘤却很少恶变。一些肿瘤C-erbB-2癌基因mRNA表达水平低于正常涎腺，可能部分涎腺为肿瘤周围涎腺组织，在形态和分子水平上已发生某些改变，如发生导管上皮的增生，基因表达的累积不属于正常涎腺范围，通过原位杂交技术已经在部分涎腺发现导管上皮增生，并证明有过表达的C-erbB-2mRNA信号存在。在恶性肿瘤中C-erbB-2mRNA的表达水平比多形性腺瘤中的还高。C-erbB-2是参与涎腺恶性肿瘤发生的相关基因。正常情况下，C-erbB-2作为细胞信号传递中的调控因子，不仅参与细胞增殖而且影响到细胞的生长分化，正常涎腺C-erbB-2在外界各种致癌因素作用下可能处于量的积累状态，一旦癌变，C-erbB-2mRNA表达便发生根本性变化。恶性肿瘤C-erbB-2癌基因在转录水平呈过度表达，相似于乳腺的研究结果，可能同二者在组织学结构、胚胎发生过程和病理学形态上相似有关。
, http://www.100md.com
近年来，肿瘤的发生被认为是一多阶段多步骤的连续过程[5]，其间涉及多个癌基因的激活和抑癌基因的失活，通过它们所表达产物的不同影响细胞生长、分化及调控过程，最终引发癌变。本研究中，同一类型肿瘤如腺泡细胞癌、粘液表皮样癌并非均高表达，其原因除考虑RNA操作过程中的分解外，多基因、多阶段、多过程参与涎腺肿瘤发生亦不能排除，即使同一类型肿瘤在发生过程中的不同发展阶段参与的基因可能不同。
柴雨力等[6]根据对培养人乳腺上皮细胞化学致癌过程中C-erbB-2基因改变研究提出C-erbB-2参与癌转化过程中活动形式可能有二种，一是通过DNA扩增来增加表达，二是直接通过增强基因转录活性来增加表达，后者很可能是致癌物或细胞内某些致癌物激活因子起了一种转录活性因子作用，而且一旦被启动，即使致癌物消除后这种高转录活性仍持续存在，这一结果对阐明癌的发生机制有一定指导意义。Riviere等[7]对头颈部鳞状细胞癌和乳腺癌研究发现C-erbB-2癌基因mRNA在乳腺癌中的高表达更显著，提示C-erbB-2癌基因表达调节过程可能同腺上皮/肌上皮细胞恶性转化与分化过程中有规律地发生基因重排、基因扩增或基因突变等基因组重建有关。
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卫生部青年基金资助课题(93125)
参考文献
1 Pisani AL,Barbuto DA,Chen D, et al. HER-2/neu,p53 and DNA analyses as prognosticators for survival in endometrial carcinoma. Obstet Gynecol， 1995，85:729-734.
2 Kristensen GB, Holm R, Abeler VM, et al.Evaluation of the prognostic significance of cathepsin D,epidermal growth factor receptor, and c-erbB-2 in early cervical squamous cellcarcinoma. An immunohisto-chemical study. Cancer, 1996,78:433-440.
, 百拇医药
3 Gusterson BA,Gelber RD,Goldhirsch A,et al.Prognostic importance of c-erbB-2 expression in breast cancer.International (ludwing) breat cancar study group.J Clin Oncol, 1992,10:1049-1056.
4 Slamon DJ,Godolphin W,Jones LA,et al.Studies of the HER-2/neu proto-oncogene in human breast and ovarian cancer.Science ,1989,244:707-712.
5 关谷刚男 .癌关连遗传子群の解析 .蛋白质 核酸 酵素 ,1993,38:314-319.
6 柴雨力 ,何德渊 ,张佩莉.培养人乳腺上皮细胞化学致癌过程中C-erbB-2基因研究 .中华
病理学杂志 ,1996,25:374-375.
7 Riviere A,Becker J,Loning T.Comparative investigation of C-erbB-2/neu expression in head and neck tumours and mammary cancer.Cancer ,1991,67:2142-2149.
(收稿:1998-08-24 修回:1999-03-03), 百拇医药