HBV基因高同源性是急性自限性乙型肝炎的主要特征*
作者：张瑞 王洪莉 顾长海 王海涛
单位：张瑞 顾长海 第三军医大学西南医院全军传染病专科中心 重庆市 400038； 王洪莉 (天津254医院传染科；王海涛 军事医学科学院
关键词：主题词 肝炎，乙型；基因，病毒；乙型肝炎病毒
Subject headings hepatitis B Subject headings hepatitis B; gene, viral; hepatitis B virus
中国图书馆分类号 R 512.6
有关HBV分子生物学研究已较多[1-4]，本文用计算机对30个克隆1.5+万碱基进行了同源性分析、变异位点的插入和缺失突变现象的分析，并对各克隆间的遗传距离进行了初步研究.
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1 材料和方法
血清标本取自3例急性乙型肝炎患者(天津254医院1995-04/ 1995-07住院患者)，按1996年全国制定标准诊断为急性自限性乙型肝炎，发病后3 mo复查HBsAg转阴，血清中HBVDNA多次检查阴性. 前S/ S基因PCR扩增所用引物为S1：5’-CGCGGTACCGGTCACCATATTCTTGGGAA-3’(2815～2835),划线处为KpnⅠ位点；S2:5’-TGCGACTGCAGTTAGGGTTTAATGTATACC-3’(842～832)，划线处为PstⅠ位点；S3:5’-AAACTGCAGCCGTCCTGATGT(T/ G)(G/ A)TG(T/ C)TCTCCAT-3’(155～181)，划线处为PstⅠ位点. 进行血清HBVDNA扩增和根据文献进行PCR产物的克隆和序列分析后，采用Goldkey软件(军事医学科学院吴加金等编制)，对所有克隆进行同源性分析等. 进化树分析采用PHYLIP(3.57版)软件包中的DNADIST和NEIGBOR软件块，遗传距离算法采用JQININF方法.
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2 结果
2.1 采用Goldkey软件将所测每个序列与HBV同源性分析 与基因库中27条HBV序列比较，选用同源性最高者为假野生株，并经Goldkey排列核苷酸序列方阵(略). 其结果表明，3例急性自限性乙型肝炎患者中序列呈高度同源性，其中1例10个克隆完全一致，1例9个克隆一致，另一例8个克隆一致.
2.2 遗传距离分析 将3个患者，30个克隆的HBV前S序列，用PHYLT35C软件中心，DNADIST计算出每条序列之间的遗传距离，(Jukes-cunkork距离系数)再用NEIGHBOR软件的NELGHBOR-JOINIG方法按遗传距离序列制出遗传距离图. U患者10个克隆的遗传距离较小，U2，U4，U5，U7，U8，U9，U10克隆在同一遗传距离上，克隆间最大的遗传距离仅0.028. L患者的10个克隆除L4外均在一个遗传距离上，克隆间的最大遗传距离为0.0058；W患者的10个克隆均在一个距离上，并且克隆间的遗传距离为0.
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3 讨论
研究发现急性自限性乙型肝炎患者体内HBV前S1/ S2各克隆间的序列的同源性最好，3个患者体内的病毒序列同源性为80%～100%，与野生株相比碱基的替代、缺失、插入率均低，所有患者体内各克隆的遗传距离一致或接近，克隆的最大的遗传距离为0.028，推测急性自限性乙型肝炎感染者体内的HBV病毒感染时毒株较单一，并且进入体内时间较短，机体通过正常的免疫机制很快将进入体内的病毒清除. 此外，我们的实验发现，急性自限性乙型肝炎患者体内各克隆的B细胞表位与野生株相比均无变化，推测此类患者体内HBV病毒CD4+，CD8+T细胞表位亦是恒定的(因为此种患者体内HBV前S1/ S2区的变异率较极低)，因此已经致敏的CTL/ 或抗体能够很准确地攻击受染的肝细胞，从而清除病毒，机体在经过一过性的炎性损伤后，恢复痊愈. 通过我们的以上的研究对更好地了解慢性HBV携带及慢性重型乙型肝炎体内的HBV病毒株的状况，提供了对照资料，并从分子生物水平证实了急性自限性乙型肝炎的体内的病毒状况.
, 百拇医药
*本课题是国家自然基金资助，No.39270642
通讯作者：张瑞
4 参考文献
[1] Junge U, Deinhardt F, Gerety RJ. Hepatitis B Aeademic press orlando, 1993:93-118
[2] Askonas BA. Immunopathology and virus infectious. In: Thomas HC, Waters J eds. Immunology of liver disease, Kluwer, London, 1993:1-10
[3] Phan BN, Klopchin K, Morigama T. Flow cytometry CD4+/ CD8+ ratio of liver-derived lymphocytes correlates with viral neplication in chronic hepatitis B. Clin Exp Immunol, 1994:97:403
[4] Barnaba V, Franco A, Alberti A. Selective expansion of cytotoxic T lymphocytes with a CD4+, CD56+ surface phenotype and T helper type 1 profile of cytokine secretion in the liver of patients chronically infected with hepatitis B virus. J Immunol, 1994;152:3074
收稿日期：1998-08-27, http://www.100md.com
单位：张瑞 顾长海 第三军医大学西南医院全军传染病专科中心 重庆市 400038； 王洪莉 (天津254医院传染科；王海涛 军事医学科学院
关键词：主题词 肝炎，乙型；基因，病毒；乙型肝炎病毒
Subject headings hepatitis B Subject headings hepatitis B; gene, viral; hepatitis B virus
中国图书馆分类号 R 512.6
有关HBV分子生物学研究已较多[1-4]，本文用计算机对30个克隆1.5+万碱基进行了同源性分析、变异位点的插入和缺失突变现象的分析，并对各克隆间的遗传距离进行了初步研究.
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1 材料和方法
血清标本取自3例急性乙型肝炎患者(天津254医院1995-04/ 1995-07住院患者)，按1996年全国制定标准诊断为急性自限性乙型肝炎，发病后3 mo复查HBsAg转阴，血清中HBVDNA多次检查阴性. 前S/ S基因PCR扩增所用引物为S1：5’-CGCGGTACCGGTCACCATATTCTTGGGAA-3’(2815～2835),划线处为KpnⅠ位点；S2:5’-TGCGACTGCAGTTAGGGTTTAATGTATACC-3’(842～832)，划线处为PstⅠ位点；S3:5’-AAACTGCAGCCGTCCTGATGT(T/ G)(G/ A)TG(T/ C)TCTCCAT-3’(155～181)，划线处为PstⅠ位点. 进行血清HBVDNA扩增和根据文献进行PCR产物的克隆和序列分析后，采用Goldkey软件(军事医学科学院吴加金等编制)，对所有克隆进行同源性分析等. 进化树分析采用PHYLIP(3.57版)软件包中的DNADIST和NEIGBOR软件块，遗传距离算法采用JQININF方法.
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2 结果
2.1 采用Goldkey软件将所测每个序列与HBV同源性分析 与基因库中27条HBV序列比较，选用同源性最高者为假野生株，并经Goldkey排列核苷酸序列方阵(略). 其结果表明，3例急性自限性乙型肝炎患者中序列呈高度同源性，其中1例10个克隆完全一致，1例9个克隆一致，另一例8个克隆一致.
2.2 遗传距离分析 将3个患者，30个克隆的HBV前S序列，用PHYLT35C软件中心，DNADIST计算出每条序列之间的遗传距离，(Jukes-cunkork距离系数)再用NEIGHBOR软件的NELGHBOR-JOINIG方法按遗传距离序列制出遗传距离图. U患者10个克隆的遗传距离较小，U2，U4，U5，U7，U8，U9，U10克隆在同一遗传距离上，克隆间最大的遗传距离仅0.028. L患者的10个克隆除L4外均在一个遗传距离上，克隆间的最大遗传距离为0.0058；W患者的10个克隆均在一个距离上，并且克隆间的遗传距离为0.
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3 讨论
研究发现急性自限性乙型肝炎患者体内HBV前S1/ S2各克隆间的序列的同源性最好，3个患者体内的病毒序列同源性为80%～100%，与野生株相比碱基的替代、缺失、插入率均低，所有患者体内各克隆的遗传距离一致或接近，克隆的最大的遗传距离为0.028，推测急性自限性乙型肝炎感染者体内的HBV病毒感染时毒株较单一，并且进入体内时间较短，机体通过正常的免疫机制很快将进入体内的病毒清除. 此外，我们的实验发现，急性自限性乙型肝炎患者体内各克隆的B细胞表位与野生株相比均无变化，推测此类患者体内HBV病毒CD4+，CD8+T细胞表位亦是恒定的(因为此种患者体内HBV前S1/ S2区的变异率较极低)，因此已经致敏的CTL/ 或抗体能够很准确地攻击受染的肝细胞，从而清除病毒，机体在经过一过性的炎性损伤后，恢复痊愈. 通过我们的以上的研究对更好地了解慢性HBV携带及慢性重型乙型肝炎体内的HBV病毒株的状况，提供了对照资料，并从分子生物水平证实了急性自限性乙型肝炎的体内的病毒状况.
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*本课题是国家自然基金资助，No.39270642
通讯作者：张瑞
4 参考文献
[1] Junge U, Deinhardt F, Gerety RJ. Hepatitis B Aeademic press orlando, 1993:93-118
[2] Askonas BA. Immunopathology and virus infectious. In: Thomas HC, Waters J eds. Immunology of liver disease, Kluwer, London, 1993:1-10
[3] Phan BN, Klopchin K, Morigama T. Flow cytometry CD4+/ CD8+ ratio of liver-derived lymphocytes correlates with viral neplication in chronic hepatitis B. Clin Exp Immunol, 1994:97:403
[4] Barnaba V, Franco A, Alberti A. Selective expansion of cytotoxic T lymphocytes with a CD4+, CD56+ surface phenotype and T helper type 1 profile of cytokine secretion in the liver of patients chronically infected with hepatitis B virus. J Immunol, 1994;152:3074
收稿日期：1998-08-27, http://www.100md.com