应用差异显示从高低转移癌系克隆出基因G3BP
作者：刘宇欣 郑杰 方伟岗 由江峰 吴秉铨
单位：北京医科大学病理学系(北京100083)
关键词：肺肿瘤；肿瘤转移；基因，G3BP；肿瘤细胞，培养的
肿瘤990504 摘要：目的 以mRNA差异显示技术对比研究具有不同转移潜能的癌系，克隆与肿瘤转移相关的基因。方法 以肺巨细胞癌细胞系PG具有不同转移潜能的亚系(BE1，LH7)为研究对象，应用mRNA差异显示技术克隆差异片段，经Northern杂交验证后测序，进入GenBank数据库检验同源性。结果 mRNA差异显示技术对比高低转移癌系mRNA，分别建立了高低转移相关基因资源库。其中一个849 bp片段在高转移亚系(BE1)低表达，而在不转移亚系(LH7)高表达，两者差异显著，经GenBank Blastn检索，与G3BP(Ras-GTPase-Activating protein SH3 domain binding protein)同源性高达99%。结论 在高低转移癌系中G3BP的表达具有显著差异，提示G3BP与肿瘤的转移表型有一定相关性，为G3BP功能的研究提供了新的线索。
, http://www.100md.com
IDENTIFICATION OF G3BP DIFFERENTIALLY EXPRESSED IN HUMAN LUNG GIANT CELL CARCINOMA SUBLINES WITH DIFFERENT METASTATIC CAPACITY BY MESSENGER RNA DIFFERENTIAL DISPLAY
LIU Yu-xin,ZHENG Jie,FANG Wei-gang,et al.
(Department of Pathology,Beijing Medical University,Beijing 100083,China)
Abstract：Objective The Messenger RNA Differential Display technique was used to identify mRNAs expressed differentially in human lung giant cell carcinoma sublines with different metastatic capacity and to find out the metastasis related gene.Methods Different metastatic potency sublines of human lung giant cell carcinoma PG line was studied by mRNA differential display technique.After Northern hybridization and sequencing,the DNA sequence was checked with GenBank data for homology.Results A clone was isolated,which is uniquely expressed in the low-metastatic subline LH7.DNA sequence of the clone was checked in the database of Genbank by Blastn and indicated a significant homology to G3BP(Ras-GTPase-Activating protein SH3 domain binding protein).Conclusions G3BP is uniquely expressed in the low-metastatic human lung giant cell carcinoma subline LH7,so it might have some relationship with cancer metastasis.
, 百拇医药
Key words： Lung neoplasms；Neoplasm metastasis；Gene,G3BP;Tumor cells,cultured
临床资料表明很多肿瘤病人的死因并非原发癌，而是肿瘤的转移，因此肿瘤转移机制的探讨是人类与肿瘤的战斗中重要一役。mRNA差异显示技术(mRNA Differential Display)[1]是一种快速而有效的克隆差异性表达基因的方法，已被广泛应用于克隆新基因及研究已知基因新功能。我室应用该技术对比高低转移癌细胞系mRNA时，发现一个849 bp片段在高转移癌细胞系低表达，而在低转移癌细胞系高表达，经GenBank Blastn检索，与G3BP(Ras-GTPase-Activating protein SH3 domain binding protein)同源性高达99%。为G3BP功能的研究提供了新的线索，提示G3BP与肿瘤的转移具有一定的相关性。
材料和方法
, 百拇医药
一、细胞培养
人巨细胞肺癌PG亚系BE1和LH7以含10%灭活小牛血清的RPMI 1640培养，贴壁生长，置37℃，5% CO2温育箱中。
二、细胞总RNA提取及DNaseⅠ处理
生长状态良好的BE1和LH7，弃培养液，预冷的PBS洗2次，按照TRIzol(GIBCO BRL)说明书提取细胞总RNA。2%甲醛变性琼脂糖/EB胶电泳检测RNA质量，28 S与18 S比例约1.5～2.5∶1。50 μg RNA中加入RNase抑制剂(1 U/μl)10 μl，无RNase的DNase I(10 U/μl)1 μl，0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.3) 5 μl，0.5 mol/L KCl 5 μl，15 mmol/L MgCl2 5 μl,37℃温育30 min去除DNA污染。加入等体积的酚/氯仿(3∶1)，用力震荡，12 000 g离心2 min，移上层至新管中，加入3 mol/L乙酸钠5 μl，无水乙醇200 μl，-70℃过夜沉淀RNA。12 000g离心10 min，弃上清，70%乙醇500 μl洗沉淀。干燥后溶于DEPC水20 μl，取2 μl稀释至500 μl用分光光度计测A260nm，计算RNA含量，取3 μg RNA电泳以检测RNA的完整性，其余冻存于-70℃。
, 百拇医药
三、合成第一链cDNA
取BE1和LH7细胞总RNA各2 μg，分别加入cDNA合成引物1 μl〔即1 μmol/L oligo(dT)〕，加DEPC水至终体积5 μl。混匀后稍离心，65 ℃温育3 min后置于冰上，加入5×逆转录缓冲液2 μl〔250 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)，375 mmol/L KCl，30 mmol/L MgCl2〕，5 mmol/L dNTP 2 μl，MMLV逆转录酶1 μl(200 units/μl)，混匀后稍离心，42℃温育90 min，75℃ 10 min终止反应。将2 μl移至另一管，分别在两管中加DEPC水至终体积80 μl(各稀释20倍和40倍)，保存于-20℃。
四、mRNA差异显示
按照Clontech公司DeltaTM差异显示试剂盒说明书操作。两个稀释度的cDNA，水，2 μg细胞总RNA(阴性对照)分别作为模板进行反应。2 μl cDNA，20 μmol/L锚定引物1 μl，20 μmol/L随机引物1 μl，10×PCR缓冲液2 μl，5 mmol/L dNTP 0.2 μl，[α-32P]dCTP(3000 Ci/mmol，亚辉公司)0.2 μl，50×Taq酶(Clontech公司)0.4 μl，加水至20 μl，混匀后稍离心，滴入石蜡油，放入温度循环仪中。PCR参数为：第1个循环94℃ 5 min，40 ℃ 5 min，68 ℃ 5 min；第2～3个循环94℃ 2 min，40 ℃ 5 min，68 ℃ 5 min；第4～25个循环94℃ 1 min，60℃ 1 min，68℃ 2 min；68℃延长7 min。PCR产物冻存于-20 ℃。
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五、电泳，放射自显影
以19∶1单双丙烯酰胺储存液配制5%变性丙烯酰胺凝胶(含8 mol/L尿素)，灌胶3 h后，以0.5×TBE为电泳缓冲液，预电泳33 mA 30 min，混合5 μl PCR产物和5 μl上样缓冲液，94 ℃变性2 min后立即置冰上，冲洗上样孔后每泳道上样3 μl,60 W(电压小于1700 V)电泳至二甲苯青到达凝胶底部。拆除电泳装置，冷至室温后移去上板，用滤纸粘起凝胶，表面铺保鲜膜后放入暗盒中，-20℃过夜。
六、差异条带的回收及二次扩增
将X-ray片与凝胶对齐并固定，用大头针在差异条带边缘刺孔，用一次性刀片将条带切下，放入离心管中加40 μl无菌水，盖2～3滴石蜡油，100℃煮15 min，置室温过夜。离心后将上清移至新管，冻存于-20 ℃。用相同的引物二次扩增：回收上清10 μl，10×PCR缓冲液5 μl，5 mmol/L dNTP 0.5 μl，20 μmol/L锚定引物2.5 μl，20 μmol/L随机引物2.5 μl，50×Taq酶1 μl，加水至50 μl，混匀后稍离心，滴入石蜡油，放入温度循环仪中。PCR参数为94℃ 1 min，60 ℃ 1 min，68℃ 2 min，20个循环。PCR产物在2%琼脂糖/EB胶电泳，切下扩增条带，用Nucleo Trap核酸纯化试剂盒(Clontech公司)回收纯化PCR产物，冻存于-20℃。
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七、Northern杂交及点杂交
异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。分光光度计测A260nm，计算RNA含量，取15 μg RNA于2%甲醛变性琼脂糖/EB胶电泳约4 h(电压10 V/cm)，紫外灯下观察记录18 S(约2 kb)，28 S(约5 kb)与上样孔的距离。10×SSC为缓冲液按常规方法吸印过夜。硝酸纤维膜，80℃烤90 min。以二次PCR扩增产物25 ng为模板，按照Prim-a-gene试剂盒(Promega公司)说明书随机引物法标记探针。将硝酸纤维素膜封入杂交袋中，按0.2 ml/cm2加预杂交液(6×SSC,50%甲酰胺，1% SDS，1×Denhard试剂，150 μg/ml断裂的鲑鱼精DNA)，42℃预杂交3 h后剪开一角插入1 ml枪尖作为通道加入已100℃变性5 min的探针，42℃杂交24 h。以2×SSC，0.1% SDS 200 ml室温洗膜15 min 2次，0.2×SSC，0.1% SDS 200 ml 42 ℃洗膜15 min 2次。膜在2×SSC中漂洗后用保鲜膜包好，放射自显影1～6天。点杂交为10 μg RNA以负压抽滤加样器点于膜上，其它同Northern杂交，两者匀以β-actin作为内参照。
, 百拇医药
八、PCR产物的克隆及测序
纯化的PCR产物按照说明书连接于pGEM-T载体(Promega公司)。用Wizard Plus SV miniprep DNA试剂盒(Promega公司)提取质粒，SacⅡ和PstⅠ双酶切鉴定阳性克隆，用fmol测序试剂盒(Promega公司)按照Sanger双脱氧法测序，以自动双向测序(赛百胜公司)验证结果。进入GenBank数据库同源性检索。
结果
我室应用倍比稀释法对肺巨细胞癌细胞系PG进行单细胞克隆，并经体内外实验鉴定(生长曲线，matrigel侵袭实验，软琼脂集落形成，裸鼠异种接种及自发性转移)，建立了两个具有不同转移潜能的亚系BE1和LH7。在差异显示前，我室将两个亚系再一次各接种裸鼠8只，验证其转移潜能的差异：在两者均100%成瘤的情况下，BE1裸鼠体内转移率100%，而LH7无1例转移。
, 百拇医药
我室尝试差异显示30种引物组合，对比高低转移癌系mRNA，分别建立了高低转移相关基因资源库。在众多的差异基因中，一个849 bp片段在高转移亚系BE1中低表达，而在不转移亚系LH7高表达，两者差异显著，且在差异显示的重复实验中得到了验证(见图1，所用引物序列为P10∶5′-ATTAACCCTCACTAAAGCACCGTCC-3′；T8：5′-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTGC-3′)。成功的回收该片段，连接入pGEM-T载体，经Sanger双脱氧末端终止法测序及自动双向测序获得其碱基序列，经GenBank Blastn检索，与G3BP(U32519)同源性高达99%(见附表)。
图1 mRNA差异显示对比人肺巨细胞癌亚系LH7，BE1 mRNA，可见G3BP在BE1中低表达，在LH7中高表达(每一个样品同时上样4个泳道)。
, 百拇医药
附表 GenBank Blastn同源性检测结果，其中第574-576碱基为终止密码。Query为我室所克隆的差异片段的序列，sbjct为G3BP碱基序列。
Northern杂交验证了G3BP在BE1，LH7亚系中表达的显著差异(见图2)，可见G3BP在LH7高表达(约3.3 kb)，而在BE1中无表达，验证了差异显示的结果。为了进一步验证这一规律，作者又引入了另一组来自人类前列腺癌细胞系PC-3M的具有不同转移潜能的亚系(我室建立)：1E8为高转移癌系(裸鼠体内转移率100%)，2E7(裸鼠体内转移率62.5%)，2B6(裸鼠体内转移率62.5%)，2B4(裸鼠体内转移率0)[2]。点杂交显示G3BP在高转移癌系1E8中表达显著低于不转移癌系2B4(见图3)，2E7，2B6的表达介于中间，该结果符合作者所总结的结论，即G3BP在高低转移癌系中的表达具有显著差异。
, 百拇医药
图2 Northern杂交检测G3BP在BE1中无杂交信号，而在LH7中可见强杂交信号。β-actin作为内参照(图下部)。
图3 点杂交检测G3BP在BE1，LH7(来自人肺巨细胞癌PG)，1E8，2E7，2B6，2B4(来自人前列腺癌细胞系PC-3M)中的表达。可见G3BP在高转移癌系BE1，1E8中的表达低于其对应的低转移癌系LH7，2B4。以β-actin作为内参照(图下部)。
讨论
克隆人类肿瘤转移相关基因是国内外肿瘤研究中的热点。mRNA差异显示技术是一种快速而有效的克隆差异性表达基因的方法。其关键在于选择匹配的对比对象，即严格控制遗传背景，摒除无关差异，仅使所关注的表型(如肿瘤细胞的转移潜能)具有显著差异。差异显示从表型差异入手，通过展示mRNA差异深入到基因差异，克隆与差异表型高度相关的新基因。
, 百拇医药
我室所建立的两个具有不同转移潜能的亚系BE1和LH7，两者在完全相同的遗传背景下，转移表型的显著差异必然反映了转移相关基因表达与调控的差异。因此该系统的建立为mRNA差异显示技术提供了良好模型。
在众多的差异基因中，G3BP引起了作者极大的兴趣。G3BP在高转移癌系BE1中低表达，而在不转移亚系LH7高表达，两者差异显著。在差异显示重复实验、Northern杂交中均验证了这一差异。当研究对象扩大到另一组不同转移潜能的亚系(人类前列腺癌细胞系)时，也得到了相同的规律，即G3BP在转移潜能具有差异的癌细胞亚系中的表达具有差异。
G3BP由法国Rhone-Poulenc Rorer实验室于1996年克隆，在血清刺激的而非静止状态的中国仓鼠肺成纤维细胞中，G3BP与Ras-GAP-SH3功能区牢固结合[3]，其功能研究集中于G3BP的RNA结合能力，以及内源性核糖核酸酶(RNase)活性[4]，G3BP可在多个位点断裂c-myc mRNA的3′非编码区，导致c-myc mRNA的降解。通过G3BP将RNA的稳定性与上游Ras信号传导通路联系起来，为我们勾划出一个新的Ras信号传导通路：Ras通过GAP和G3BP控制新合成的mRNA的稳定性来传导信号。基于其所处的关键位置，G3BP已引起广泛的关注。
, 百拇医药
本文结果证明G3BP在高低转移癌系中的表达具有显著差异，提示G3BP与肿瘤的转移表型可能相关，为G3BP功能的研究提供了新的线索。Ras作为细胞生长分化重要的信号传导通路及癌基因已被广泛研究，G3BP的表达差异是否预示着Ras的信号传导在高低转移癌系中具有差异，影响着肿瘤转移表型。这与众多研究显示Ras与肿瘤转移表型相关一致。本室将在多个不同转移潜能的肿瘤细胞系及临床肿瘤原发灶，转移灶标本中广泛验证G3BP与转移的相关性，为揭示G3BP的功能全貌拓宽思路，为肿瘤转移机制的研究提供有价值的侯选肿瘤转移相关基因。
作者简介：刘宇欣，女，在读博士生。
参考文献
[1]Liang P,Pardee AB.Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction.Science,1992,257:967
, 百拇医药
[2]刘宇欣，郑 杰，方伟岗，等.具有不同转移潜能的前列腺癌细胞亚系的分离鉴定.中华病理杂志，(in press)
[3]Parker F,Maurier F,Delumeau I,et al.A ras-GTPase-activating protein SH3-domain-binding protein.Mol Cell Biol,1996,16:2561
[4]Gallouzi I,Parker F,Chebli K,et al. A novel phosphorylation-dependent RNase activity of GAP-SH3 binding protein:a potential link between signal transduction and RNA stability.Mol Cell Biol,1998,18:3956
(收稿日期：1999-03-17 修回日期：1999-05-10), 百拇医药
单位：北京医科大学病理学系(北京100083)
关键词：肺肿瘤；肿瘤转移；基因，G3BP；肿瘤细胞，培养的
肿瘤990504 摘要：目的 以mRNA差异显示技术对比研究具有不同转移潜能的癌系，克隆与肿瘤转移相关的基因。方法 以肺巨细胞癌细胞系PG具有不同转移潜能的亚系(BE1，LH7)为研究对象，应用mRNA差异显示技术克隆差异片段，经Northern杂交验证后测序，进入GenBank数据库检验同源性。结果 mRNA差异显示技术对比高低转移癌系mRNA，分别建立了高低转移相关基因资源库。其中一个849 bp片段在高转移亚系(BE1)低表达，而在不转移亚系(LH7)高表达，两者差异显著，经GenBank Blastn检索，与G3BP(Ras-GTPase-Activating protein SH3 domain binding protein)同源性高达99%。结论 在高低转移癌系中G3BP的表达具有显著差异，提示G3BP与肿瘤的转移表型有一定相关性，为G3BP功能的研究提供了新的线索。
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IDENTIFICATION OF G3BP DIFFERENTIALLY EXPRESSED IN HUMAN LUNG GIANT CELL CARCINOMA SUBLINES WITH DIFFERENT METASTATIC CAPACITY BY MESSENGER RNA DIFFERENTIAL DISPLAY
LIU Yu-xin,ZHENG Jie,FANG Wei-gang,et al.
(Department of Pathology,Beijing Medical University,Beijing 100083,China)
Abstract：Objective The Messenger RNA Differential Display technique was used to identify mRNAs expressed differentially in human lung giant cell carcinoma sublines with different metastatic capacity and to find out the metastasis related gene.Methods Different metastatic potency sublines of human lung giant cell carcinoma PG line was studied by mRNA differential display technique.After Northern hybridization and sequencing,the DNA sequence was checked with GenBank data for homology.Results A clone was isolated,which is uniquely expressed in the low-metastatic subline LH7.DNA sequence of the clone was checked in the database of Genbank by Blastn and indicated a significant homology to G3BP(Ras-GTPase-Activating protein SH3 domain binding protein).Conclusions G3BP is uniquely expressed in the low-metastatic human lung giant cell carcinoma subline LH7,so it might have some relationship with cancer metastasis.
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Key words： Lung neoplasms；Neoplasm metastasis；Gene,G3BP;Tumor cells,cultured
临床资料表明很多肿瘤病人的死因并非原发癌，而是肿瘤的转移，因此肿瘤转移机制的探讨是人类与肿瘤的战斗中重要一役。mRNA差异显示技术(mRNA Differential Display)[1]是一种快速而有效的克隆差异性表达基因的方法，已被广泛应用于克隆新基因及研究已知基因新功能。我室应用该技术对比高低转移癌细胞系mRNA时，发现一个849 bp片段在高转移癌细胞系低表达，而在低转移癌细胞系高表达，经GenBank Blastn检索，与G3BP(Ras-GTPase-Activating protein SH3 domain binding protein)同源性高达99%。为G3BP功能的研究提供了新的线索，提示G3BP与肿瘤的转移具有一定的相关性。
材料和方法
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一、细胞培养
人巨细胞肺癌PG亚系BE1和LH7以含10%灭活小牛血清的RPMI 1640培养，贴壁生长，置37℃，5% CO2温育箱中。
二、细胞总RNA提取及DNaseⅠ处理
生长状态良好的BE1和LH7，弃培养液，预冷的PBS洗2次，按照TRIzol(GIBCO BRL)说明书提取细胞总RNA。2%甲醛变性琼脂糖/EB胶电泳检测RNA质量，28 S与18 S比例约1.5～2.5∶1。50 μg RNA中加入RNase抑制剂(1 U/μl)10 μl，无RNase的DNase I(10 U/μl)1 μl，0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.3) 5 μl，0.5 mol/L KCl 5 μl，15 mmol/L MgCl2 5 μl,37℃温育30 min去除DNA污染。加入等体积的酚/氯仿(3∶1)，用力震荡，12 000 g离心2 min，移上层至新管中，加入3 mol/L乙酸钠5 μl，无水乙醇200 μl，-70℃过夜沉淀RNA。12 000g离心10 min，弃上清，70%乙醇500 μl洗沉淀。干燥后溶于DEPC水20 μl，取2 μl稀释至500 μl用分光光度计测A260nm，计算RNA含量，取3 μg RNA电泳以检测RNA的完整性，其余冻存于-70℃。
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三、合成第一链cDNA
取BE1和LH7细胞总RNA各2 μg，分别加入cDNA合成引物1 μl〔即1 μmol/L oligo(dT)〕，加DEPC水至终体积5 μl。混匀后稍离心，65 ℃温育3 min后置于冰上，加入5×逆转录缓冲液2 μl〔250 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)，375 mmol/L KCl，30 mmol/L MgCl2〕，5 mmol/L dNTP 2 μl，MMLV逆转录酶1 μl(200 units/μl)，混匀后稍离心，42℃温育90 min，75℃ 10 min终止反应。将2 μl移至另一管，分别在两管中加DEPC水至终体积80 μl(各稀释20倍和40倍)，保存于-20℃。
四、mRNA差异显示
按照Clontech公司DeltaTM差异显示试剂盒说明书操作。两个稀释度的cDNA，水，2 μg细胞总RNA(阴性对照)分别作为模板进行反应。2 μl cDNA，20 μmol/L锚定引物1 μl，20 μmol/L随机引物1 μl，10×PCR缓冲液2 μl，5 mmol/L dNTP 0.2 μl，[α-32P]dCTP(3000 Ci/mmol，亚辉公司)0.2 μl，50×Taq酶(Clontech公司)0.4 μl，加水至20 μl，混匀后稍离心，滴入石蜡油，放入温度循环仪中。PCR参数为：第1个循环94℃ 5 min，40 ℃ 5 min，68 ℃ 5 min；第2～3个循环94℃ 2 min，40 ℃ 5 min，68 ℃ 5 min；第4～25个循环94℃ 1 min，60℃ 1 min，68℃ 2 min；68℃延长7 min。PCR产物冻存于-20 ℃。
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五、电泳，放射自显影
以19∶1单双丙烯酰胺储存液配制5%变性丙烯酰胺凝胶(含8 mol/L尿素)，灌胶3 h后，以0.5×TBE为电泳缓冲液，预电泳33 mA 30 min，混合5 μl PCR产物和5 μl上样缓冲液，94 ℃变性2 min后立即置冰上，冲洗上样孔后每泳道上样3 μl,60 W(电压小于1700 V)电泳至二甲苯青到达凝胶底部。拆除电泳装置，冷至室温后移去上板，用滤纸粘起凝胶，表面铺保鲜膜后放入暗盒中，-20℃过夜。
六、差异条带的回收及二次扩增
将X-ray片与凝胶对齐并固定，用大头针在差异条带边缘刺孔，用一次性刀片将条带切下，放入离心管中加40 μl无菌水，盖2～3滴石蜡油，100℃煮15 min，置室温过夜。离心后将上清移至新管，冻存于-20 ℃。用相同的引物二次扩增：回收上清10 μl，10×PCR缓冲液5 μl，5 mmol/L dNTP 0.5 μl，20 μmol/L锚定引物2.5 μl，20 μmol/L随机引物2.5 μl，50×Taq酶1 μl，加水至50 μl，混匀后稍离心，滴入石蜡油，放入温度循环仪中。PCR参数为94℃ 1 min，60 ℃ 1 min，68℃ 2 min，20个循环。PCR产物在2%琼脂糖/EB胶电泳，切下扩增条带，用Nucleo Trap核酸纯化试剂盒(Clontech公司)回收纯化PCR产物，冻存于-20℃。
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七、Northern杂交及点杂交
异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。分光光度计测A260nm，计算RNA含量，取15 μg RNA于2%甲醛变性琼脂糖/EB胶电泳约4 h(电压10 V/cm)，紫外灯下观察记录18 S(约2 kb)，28 S(约5 kb)与上样孔的距离。10×SSC为缓冲液按常规方法吸印过夜。硝酸纤维膜，80℃烤90 min。以二次PCR扩增产物25 ng为模板，按照Prim-a-gene试剂盒(Promega公司)说明书随机引物法标记探针。将硝酸纤维素膜封入杂交袋中，按0.2 ml/cm2加预杂交液(6×SSC,50%甲酰胺，1% SDS，1×Denhard试剂，150 μg/ml断裂的鲑鱼精DNA)，42℃预杂交3 h后剪开一角插入1 ml枪尖作为通道加入已100℃变性5 min的探针，42℃杂交24 h。以2×SSC，0.1% SDS 200 ml室温洗膜15 min 2次，0.2×SSC，0.1% SDS 200 ml 42 ℃洗膜15 min 2次。膜在2×SSC中漂洗后用保鲜膜包好，放射自显影1～6天。点杂交为10 μg RNA以负压抽滤加样器点于膜上，其它同Northern杂交，两者匀以β-actin作为内参照。
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八、PCR产物的克隆及测序
纯化的PCR产物按照说明书连接于pGEM-T载体(Promega公司)。用Wizard Plus SV miniprep DNA试剂盒(Promega公司)提取质粒，SacⅡ和PstⅠ双酶切鉴定阳性克隆，用fmol测序试剂盒(Promega公司)按照Sanger双脱氧法测序，以自动双向测序(赛百胜公司)验证结果。进入GenBank数据库同源性检索。
结果
我室应用倍比稀释法对肺巨细胞癌细胞系PG进行单细胞克隆，并经体内外实验鉴定(生长曲线，matrigel侵袭实验，软琼脂集落形成，裸鼠异种接种及自发性转移)，建立了两个具有不同转移潜能的亚系BE1和LH7。在差异显示前，我室将两个亚系再一次各接种裸鼠8只，验证其转移潜能的差异：在两者均100%成瘤的情况下，BE1裸鼠体内转移率100%，而LH7无1例转移。
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我室尝试差异显示30种引物组合，对比高低转移癌系mRNA，分别建立了高低转移相关基因资源库。在众多的差异基因中，一个849 bp片段在高转移亚系BE1中低表达，而在不转移亚系LH7高表达，两者差异显著，且在差异显示的重复实验中得到了验证(见图1，所用引物序列为P10∶5′-ATTAACCCTCACTAAAGCACCGTCC-3′；T8：5′-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTGC-3′)。成功的回收该片段，连接入pGEM-T载体，经Sanger双脱氧末端终止法测序及自动双向测序获得其碱基序列，经GenBank Blastn检索，与G3BP(U32519)同源性高达99%(见附表)。
图1 mRNA差异显示对比人肺巨细胞癌亚系LH7，BE1 mRNA，可见G3BP在BE1中低表达，在LH7中高表达(每一个样品同时上样4个泳道)。
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附表 GenBank Blastn同源性检测结果，其中第574-576碱基为终止密码。Query为我室所克隆的差异片段的序列，sbjct为G3BP碱基序列。
Northern杂交验证了G3BP在BE1，LH7亚系中表达的显著差异(见图2)，可见G3BP在LH7高表达(约3.3 kb)，而在BE1中无表达，验证了差异显示的结果。为了进一步验证这一规律，作者又引入了另一组来自人类前列腺癌细胞系PC-3M的具有不同转移潜能的亚系(我室建立)：1E8为高转移癌系(裸鼠体内转移率100%)，2E7(裸鼠体内转移率62.5%)，2B6(裸鼠体内转移率62.5%)，2B4(裸鼠体内转移率0)[2]。点杂交显示G3BP在高转移癌系1E8中表达显著低于不转移癌系2B4(见图3)，2E7，2B6的表达介于中间，该结果符合作者所总结的结论，即G3BP在高低转移癌系中的表达具有显著差异。
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图2 Northern杂交检测G3BP在BE1中无杂交信号，而在LH7中可见强杂交信号。β-actin作为内参照(图下部)。
图3 点杂交检测G3BP在BE1，LH7(来自人肺巨细胞癌PG)，1E8，2E7，2B6，2B4(来自人前列腺癌细胞系PC-3M)中的表达。可见G3BP在高转移癌系BE1，1E8中的表达低于其对应的低转移癌系LH7，2B4。以β-actin作为内参照(图下部)。
讨论
克隆人类肿瘤转移相关基因是国内外肿瘤研究中的热点。mRNA差异显示技术是一种快速而有效的克隆差异性表达基因的方法。其关键在于选择匹配的对比对象，即严格控制遗传背景，摒除无关差异，仅使所关注的表型(如肿瘤细胞的转移潜能)具有显著差异。差异显示从表型差异入手，通过展示mRNA差异深入到基因差异，克隆与差异表型高度相关的新基因。
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我室所建立的两个具有不同转移潜能的亚系BE1和LH7，两者在完全相同的遗传背景下，转移表型的显著差异必然反映了转移相关基因表达与调控的差异。因此该系统的建立为mRNA差异显示技术提供了良好模型。
在众多的差异基因中，G3BP引起了作者极大的兴趣。G3BP在高转移癌系BE1中低表达，而在不转移亚系LH7高表达，两者差异显著。在差异显示重复实验、Northern杂交中均验证了这一差异。当研究对象扩大到另一组不同转移潜能的亚系(人类前列腺癌细胞系)时，也得到了相同的规律，即G3BP在转移潜能具有差异的癌细胞亚系中的表达具有差异。
G3BP由法国Rhone-Poulenc Rorer实验室于1996年克隆，在血清刺激的而非静止状态的中国仓鼠肺成纤维细胞中，G3BP与Ras-GAP-SH3功能区牢固结合[3]，其功能研究集中于G3BP的RNA结合能力，以及内源性核糖核酸酶(RNase)活性[4]，G3BP可在多个位点断裂c-myc mRNA的3′非编码区，导致c-myc mRNA的降解。通过G3BP将RNA的稳定性与上游Ras信号传导通路联系起来，为我们勾划出一个新的Ras信号传导通路：Ras通过GAP和G3BP控制新合成的mRNA的稳定性来传导信号。基于其所处的关键位置，G3BP已引起广泛的关注。
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本文结果证明G3BP在高低转移癌系中的表达具有显著差异，提示G3BP与肿瘤的转移表型可能相关，为G3BP功能的研究提供了新的线索。Ras作为细胞生长分化重要的信号传导通路及癌基因已被广泛研究，G3BP的表达差异是否预示着Ras的信号传导在高低转移癌系中具有差异，影响着肿瘤转移表型。这与众多研究显示Ras与肿瘤转移表型相关一致。本室将在多个不同转移潜能的肿瘤细胞系及临床肿瘤原发灶，转移灶标本中广泛验证G3BP与转移的相关性，为揭示G3BP的功能全貌拓宽思路，为肿瘤转移机制的研究提供有价值的侯选肿瘤转移相关基因。
作者简介：刘宇欣，女，在读博士生。
参考文献
[1]Liang P,Pardee AB.Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction.Science,1992,257:967
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[2]刘宇欣，郑 杰，方伟岗，等.具有不同转移潜能的前列腺癌细胞亚系的分离鉴定.中华病理杂志，(in press)
[3]Parker F,Maurier F,Delumeau I,et al.A ras-GTPase-activating protein SH3-domain-binding protein.Mol Cell Biol,1996,16:2561
[4]Gallouzi I,Parker F,Chebli K,et al. A novel phosphorylation-dependent RNase activity of GAP-SH3 binding protein:a potential link between signal transduction and RNA stability.Mol Cell Biol,1998,18:3956
(收稿日期：1999-03-17 修回日期：1999-05-10), 百拇医药