用腺苷三磷酸酶组化反应探讨脾虚证与骨骼肌功能的关系
作者：贾旭
单位：北京中医药大学基础医学院病理教研室 北京100029
关键词：脾虚证；骨骼肌；腺苷三磷酸酶；组化反应
北京中医药大学学报990523 摘要：用组织化学方法探讨脾气虚状态下骨骼肌腺苷三磷酸酶(M-ATPase)含量的变化。结果表明，大鼠脾气虚证模型骨骼肌M-ATPase含量呈现规律的下降趋势。提示骨骼肌M-ATPase组织化学反应方法是一项用来探讨中医学“脾主肌肉”理论的直观手段。
Discussion on Relations between TCM Syndrome of Spleen_deficiency
and SkeletalMuscles' Function through Histochemical Reactive Method
, 百拇医药
of the M-ATPase
Jia Xu(贾 旭)
(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijng 100029)
ABSTRACT: The content change of M-ATPase in skeletal muscles in state of spleen-deficiency is explored with the histochemical method. The result shows the content of M-ATPase presents regularly decreasing trend in the mouse model. It reveals that the histochemical reactive method of the M-ATPase is a directly observable method used to further prove the correctness of the TCM theory that “the spleen dominates muscles".
, 百拇医药
KEY WORDS: Spleen-deficiency syndrome; Skeletal muscles; M-ATPase; Enzymatic histochemical reaction
中医理论认为，脾的生理功能之一为主肌肉的发育和运动。脾气虚弱时，肌肉的发育和运动功能亦随之发生障碍，表现为肌肉消瘦、四肢乏力、不耐劳作等，显示在脾气虚时，肌肉的能量处于“供不应求”的状态[1]。腺苷三磷酸酶(M-ATPase)的活性与肌肉的兴奋收缩偶联关系密切[2]。笔者采用组织化学反应方法，显示骨骼肌肌球蛋白M-ATPase的含量变化，探讨脾气虚证时骨骼肌的功能状态及纤维炎型的变化特征。
1 材料与方法
1.1 动物模型的制备
动物选用Wistar系雄性大鼠，体重180 g。泻下药化饲料为：大黄∶芒硝∶普通饲料为0.85∶0.15∶9.00。对照组每只大鼠每日给予普通饲料，自由取食；脾气虚组每只大鼠单笼饲养，每日给泻下药化饲料，自由取食。
, 百拇医药
1.2 取材
两组大鼠在喂养22 d后，断头处死。解剖鼠大腿肌肉，取出左侧跖浅屈肌，把肌肉组织置小空瓶中盖紧，放入预冷的异戊烷之中，然后将其一起放入液氮之中骤冷10 s。
组织从液氮中取出，放进冰冻切片机中冷冻。于温度-15℃时，开始切片，切片厚为8 μm。
1.3 染色步骤与方法
(1)切片分别进入A、B、C三种不同的先期孵育液中预孵育。室温20℃为宜。A液(pH 10.5)；B液(pH 4.65)；C液(pH 4.35)；A、B、C均为0.2 mol/L巴比妥氯化钙缓冲液。三种液体各孵育5 min。
(2)切片经三步先期孵育之后，进入0.18 mol/L的氯化钙液浸5 min。
, 百拇医药
(3)切片进入孵育状态：在M-ATPase孵育液中孵育40 min。配方为：0.1 mol/L巴比妥钠2 mL；0.18 mol/L氯化钙1 mL；三蒸水7 mL；三磷酸腺苷钠盐(M-ATP)25 mg。37℃孵育。
(4)用1%氯化钙液浸3次，每次3 min。
(5)2%氯化钴液浸泡3 min。
(6)0.01 mol/L巴比妥钠液换洗4～8次。
(7)三蒸水浸洗15～20 min。
(8)0.8%硫化胺液显色20～30 s。
(9)蒸馏水冲洗5 min。
(10)常规脱水、透明、封片。
, http://www.100md.com
(11)显微镜观察。
2 结果
(1)M-ATPase组化反应能够鉴别Ⅰ、Ⅱ型肌纤维。大鼠跖浅屈肌的M-ATPase反应在pH 10.4的碱性孵育液中可区分两种纤维：Ⅰ型纤维清亮着色浅；Ⅱ型纤维着色深，呈深褐色。见图1。
图1 大鼠骨骼肌M-ATPase染色
Ⅰ型纤维清亮，着色浅；Ⅱ型纤维着色深，呈深褐色(200×)
(2)M-ATPase组化反应能够反应脾气虚证状态下肌肉的代谢及功能状态。选择在pH 4.65孵育液中的切片进行染色，结果Ⅰ型、Ⅱ型纤维在脾气虚时酶含量下降。
3 讨论
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组织化学反应能稳定地显示M-ATPase，并可显著区分骨骼肌Ⅰ、Ⅱ型纤维，并且随着骨骼肌代谢及功能的变化而出现染色水平的改变。骨骼肌肉收缩全过程称为兴奋收缩偶联，是通过肌动蛋白及肌球蛋白的调节作用，形成肌动球蛋白，引起粗丝与细丝间的相对滑动过程。在这一过程中，启动状态的肌动蛋白可激活M-ATPase的活性，释放的能量迫使细丝沿粗丝滑动。可见，M-ATPase含量的下降，势必影响兴奋收缩偶联，使肌肉的运动能力减弱。
本实验显示M-ATPase含量在脾气虚时降低，体现了中医“气”与能量动力变化的关系。
国家中医药管理局资助课题，1993年获北京市科学技术进步二等奖
作者简介：贾旭，女，41岁，主管技师
参考文献
1 杨维益，梁 嵘，文 平，等.中医脾虚证的研究.北京中医学院学报，1992，15(1)：65
2 北京医学院.生物化学.北京：人民卫生出版社，1978.452～453
收稿日期：1998-04-22, 百拇医药
单位：北京中医药大学基础医学院病理教研室 北京100029
关键词：脾虚证；骨骼肌；腺苷三磷酸酶；组化反应
北京中医药大学学报990523 摘要：用组织化学方法探讨脾气虚状态下骨骼肌腺苷三磷酸酶(M-ATPase)含量的变化。结果表明，大鼠脾气虚证模型骨骼肌M-ATPase含量呈现规律的下降趋势。提示骨骼肌M-ATPase组织化学反应方法是一项用来探讨中医学“脾主肌肉”理论的直观手段。
Discussion on Relations between TCM Syndrome of Spleen_deficiency
and SkeletalMuscles' Function through Histochemical Reactive Method
, 百拇医药
of the M-ATPase
Jia Xu(贾 旭)
(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijng 100029)
ABSTRACT: The content change of M-ATPase in skeletal muscles in state of spleen-deficiency is explored with the histochemical method. The result shows the content of M-ATPase presents regularly decreasing trend in the mouse model. It reveals that the histochemical reactive method of the M-ATPase is a directly observable method used to further prove the correctness of the TCM theory that “the spleen dominates muscles".
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KEY WORDS: Spleen-deficiency syndrome; Skeletal muscles; M-ATPase; Enzymatic histochemical reaction
中医理论认为，脾的生理功能之一为主肌肉的发育和运动。脾气虚弱时，肌肉的发育和运动功能亦随之发生障碍，表现为肌肉消瘦、四肢乏力、不耐劳作等，显示在脾气虚时，肌肉的能量处于“供不应求”的状态[1]。腺苷三磷酸酶(M-ATPase)的活性与肌肉的兴奋收缩偶联关系密切[2]。笔者采用组织化学反应方法，显示骨骼肌肌球蛋白M-ATPase的含量变化，探讨脾气虚证时骨骼肌的功能状态及纤维炎型的变化特征。
1 材料与方法
1.1 动物模型的制备
动物选用Wistar系雄性大鼠，体重180 g。泻下药化饲料为：大黄∶芒硝∶普通饲料为0.85∶0.15∶9.00。对照组每只大鼠每日给予普通饲料，自由取食；脾气虚组每只大鼠单笼饲养，每日给泻下药化饲料，自由取食。
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1.2 取材
两组大鼠在喂养22 d后，断头处死。解剖鼠大腿肌肉，取出左侧跖浅屈肌，把肌肉组织置小空瓶中盖紧，放入预冷的异戊烷之中，然后将其一起放入液氮之中骤冷10 s。
组织从液氮中取出，放进冰冻切片机中冷冻。于温度-15℃时，开始切片，切片厚为8 μm。
1.3 染色步骤与方法
(1)切片分别进入A、B、C三种不同的先期孵育液中预孵育。室温20℃为宜。A液(pH 10.5)；B液(pH 4.65)；C液(pH 4.35)；A、B、C均为0.2 mol/L巴比妥氯化钙缓冲液。三种液体各孵育5 min。
(2)切片经三步先期孵育之后，进入0.18 mol/L的氯化钙液浸5 min。
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(3)切片进入孵育状态：在M-ATPase孵育液中孵育40 min。配方为：0.1 mol/L巴比妥钠2 mL；0.18 mol/L氯化钙1 mL；三蒸水7 mL；三磷酸腺苷钠盐(M-ATP)25 mg。37℃孵育。
(4)用1%氯化钙液浸3次，每次3 min。
(5)2%氯化钴液浸泡3 min。
(6)0.01 mol/L巴比妥钠液换洗4～8次。
(7)三蒸水浸洗15～20 min。
(8)0.8%硫化胺液显色20～30 s。
(9)蒸馏水冲洗5 min。
(10)常规脱水、透明、封片。
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(11)显微镜观察。
2 结果
(1)M-ATPase组化反应能够鉴别Ⅰ、Ⅱ型肌纤维。大鼠跖浅屈肌的M-ATPase反应在pH 10.4的碱性孵育液中可区分两种纤维：Ⅰ型纤维清亮着色浅；Ⅱ型纤维着色深，呈深褐色。见图1。
图1 大鼠骨骼肌M-ATPase染色
Ⅰ型纤维清亮，着色浅；Ⅱ型纤维着色深，呈深褐色(200×)
(2)M-ATPase组化反应能够反应脾气虚证状态下肌肉的代谢及功能状态。选择在pH 4.65孵育液中的切片进行染色，结果Ⅰ型、Ⅱ型纤维在脾气虚时酶含量下降。
3 讨论
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组织化学反应能稳定地显示M-ATPase，并可显著区分骨骼肌Ⅰ、Ⅱ型纤维，并且随着骨骼肌代谢及功能的变化而出现染色水平的改变。骨骼肌肉收缩全过程称为兴奋收缩偶联，是通过肌动蛋白及肌球蛋白的调节作用，形成肌动球蛋白，引起粗丝与细丝间的相对滑动过程。在这一过程中，启动状态的肌动蛋白可激活M-ATPase的活性，释放的能量迫使细丝沿粗丝滑动。可见，M-ATPase含量的下降，势必影响兴奋收缩偶联，使肌肉的运动能力减弱。
本实验显示M-ATPase含量在脾气虚时降低，体现了中医“气”与能量动力变化的关系。
国家中医药管理局资助课题，1993年获北京市科学技术进步二等奖
作者简介：贾旭，女，41岁，主管技师
参考文献
1 杨维益，梁 嵘，文 平，等.中医脾虚证的研究.北京中医学院学报，1992，15(1)：65
2 北京医学院.生物化学.北京：人民卫生出版社，1978.452～453
收稿日期：1998-04-22, 百拇医药