健肾片对嘌呤霉素肾病大鼠的及NO的影响
作者：曾安平 孙伟 王钢 邹燕勤
单位：曾安平 孙伟 王钢 邹燕勤(江苏省中医院全国中医肾病医疗中心 南京 210029)
关键词：健肾片；自由基反应；嘌呤霉素；一氧化氮
健肾片对嘌呤霉素肾病大鼠的及NO的影响健肾片对嘌呤霉素肾病大鼠的
及NO的影响*
摘 要 目的 进一步探讨健肾片对慢性肾炎的疗效及作用机理。方法 运用嘌呤霉素腹腔注射所致肾病大鼠病理模型。经用化学发光法检测实验动物的超氧阴离子，采用硝酸还原酶化学比色法检测NO含量。结果 发现该药可减轻嘌呤霉素肾病大鼠的病理变化，减低模型动物的血和红细胞含量，提高其NO含量。结论 健肾片具有调整自由基反应和增加血NO的生物活性作用。
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The Effects of Jianshen Tablet on Serum O2 and NO Level
Nephrotic rat caused by puromycin
ZENG an-ping, SUN wei, WANG gang, et al
(National Nephrosis Treatment Centor of TCM,the Division of Nephrology Jiangsu Hospital
of TCM,Nanjing(210029)
Objective:The effects and therapeutic mechanism of Jianshen Tablet on chronic nephritis were studied further.Methodology:The pathological model was nephrotic rat caused by puromycin (intro-abdominal injection 10mg/kg×7d).The serum O2 and erythrocyte O2 of the model rats were examined with chemiluminescence and their serum NO were examied with nitrite reduction test.Results:It was found that the precription could alleviate the pathological changes of the puromycin nephrotic rat,reduce the serum O2 and erythrocyte O2 of the model rat and increase the serum NO level.Conclusion:It was suggested that Jianshen Tablet may exhibit better efficacy on chronic nephritis by adjusting radical reaction and increasing serum NO physiologyical activity.
, 百拇医药
Key words:Jianshen Tablet free radical reaction puromycin Nitrc oxide
健肾片由党参、生黄芪、白术、山药、生苡仁、桑寄生、菟丝子等组成。其治疗慢性肾炎气虚证的临床效果及对实验性肾病综合征TXB2、PGF1α影响的实验研究已作报道[1～2]。为进一步分析健肾片治疗慢性肾炎的作用机理，我们进行了健肾片对嘌呤霉素肾病大鼠血及NO影响的实验研究。
材料与方法
1 材料
健康成年Wistar大白鼠24只，体重为195g±15g，全部为雄性，由上海动物实验中心提供。造模药物为1%的嘌呤霉素，购自Sigma化学公司。治疗药物健肾片由本院制剂部制备，批号为9203037。
, 百拇医药
2 方法
2.1 造模方法
动物购回后静养3日，随机分为病理组和治疗组。肾病模型制作方法参考Vernier RL的报道[3]。给实验大鼠腹腔注射嘌呤霉素10mg/(kg.d)，从第一次注射日算起，连续1周。
2.2 治疗方法
治疗组大鼠除常规注射嘌呤霉素外，按成人每日每kg体重10倍量，经胃灌服健肾片，每日2次，持续4周。病理组大鼠每日喂服相同量的自来水，余同治疗组。
2.3 检测方法
实验大鼠在实验第2周经尿蛋白定性出现2+以上，符合肾病模型时，经眼眶采血，采用化学发光法分别检测实验第3周及第4周的血浆
和红细胞含量。并在造模前及造模第2周采用硝酸还原酶化学比色法检测血NO含量。至实验第28d，断头处死，取肾组织做HE染色光镜检查及免疫酶标荧光检查。
, 百拇医药
结果
1 实验大鼠血浆超氧阴离子的变化
于实验第3周、第4周，检测大鼠血浆中超氧阴离子含量。结果显示，病理组在实验第3周、第4周血浆超氧阴离子含量均较治疗组明显增高(见表1)。
表1 大鼠血浆超氧阴离子的变化(
±s)单位：kcpm
组 别
n
实验第3周
实验第4周
, 百拇医药
病理组
11
19.62±2.77
19.18±2.07
治疗组
9
12.41±1.82
13.39±1.67
P值
<0.001
<0.001
2 实验大鼠红细胞超氧阴离子的变化
, 百拇医药
于实验第3周、第4周，检测大鼠红细胞中超氧阴离子含量。结果显示，病理组在实验第3周、第4周红细胞超氧阴离子含量均明显高于治疗组(见表2)。
表2 大鼠红细胞超氧阴离子的变化(±s)单位：kcpm
组 别
n
实验第3周
实验第4周
病理组
11
5.83±0.61
, http://www.100md.com
15.65±0.46
治疗组
9
4.79±0.65
4.69±0.51
P值
<0.001
<0.001
3 实验大鼠NO的变化
在实验造模前及第2周检测大鼠血NO含量。结果显示，治疗组明显高于病理组(见表3)。
表3 大鼠NO的变化(±s)单位：μmol/L
, 百拇医药
组别
造模前正常值
病理组
治疗组
0.44±0.03
0.39±0.01
0.467±0.05
P值
P<0.001
P<0.05
4 实验大鼠病理检查
HE染色显示，病理组肾小球基底膜外侧上皮细胞足突肿大，间质细胞增多，局部小管有坏死；治疗组病理改变明显轻于病理组，上皮细胞足突基本正常，间质细胞减少。免疫荧光示肾小球内及肾小管间隙SOD反应阳性，提示治疗组SOD增加。讨论
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嘌呤霉素所致的肾病综合征详细机理尚未阐明。有报道显示，在注射嘌呤霉素前后投用自由基清除剂SOD等可使嘌呤霉素造成的肾小球形态学改变及尿蛋白排泄减轻。因此认为是嘌呤霉素促进自由基产生而损害肾小球[4]。本实验也显示嘌呤霉素腹腔注射1周后，实验大鼠出现蛋白尿及血浆、红细胞中超氧阴离子含量升高，与目前的研究报道相一致。表明本模型属于氧化应激状态的大鼠肾病综合征模型。
近来研究提示，系膜细胞在血小板激活因子、免疫复合物、膜攻击物等刺激下能合成和分泌H2O2和
，这产无炎症细胞浸润的肾小球疾病中发挥着重要的致病作用[5～7]。活性氧除主要通过膜脂质过氧化反应破坏肾小球基底膜(GBM)和上皮细胞外，还可直接损伤GBM和通过髓过氧化物-过氧化氢-卤素系统损伤GBM。脂质和脂质趋化因子等还能引起肾组织的继发性损伤。因此，自由基氧化损伤在肾炎的发生、病程的进展过程中起着关键性作用[8]。应用抗氧化剂治疗慢性肾炎已成为一个重要的新课题，特别是中医中药的抗氧化特性目前在临床及实验中引起了研究者的极大兴趣[9]。本实验显示，使用健肾片治疗后，在改善大鼠肾脏病理损害同时，可降低实验大鼠的血浆及红细胞中超氧阴离子含量，肾组织荧光检查表明肾小球内及肾小管间隙SOD反应阳性，提示健肾片具有较强的抗氧化作用。
, 百拇医药
一氧化氮(NO)是由血管内皮细胞合成释放的一种内皮依赖性舒张因子，是介导平滑肌舒张神经传递和炎症控制的重要细胞间信使[10]。近年来的实验表明，NO可以通过调节肾脏入球小动脉、肾小球系膜细胞的张力以及某些情况下出球小动脉来调节肾血流动力学[11]。严重的NO阻滞3周内即可引起血压和肾血管阻力进行性升高，肾小球滤过率降低和蛋白尿的形成[12]。在肾小球疾病中，增加肾内NO的合成可削弱基质蛋白的合成和聚集，防止肾小球硬化的发生。内源性和外源性NO均可防止肾小球硬化的发生。[13]本实验显示，病理组血NO含量低于造模前正常值，而经服用健肾片治疗后，血NO含量明显高于病理组，提示中药健肾片可显著改善嘌呤霉素肾病大鼠模型血NO含量降低所致肾脏损害。另外，有研究提示超氧阴离子和NO反应不仅会干扰NO的信使功能，而且所产生的超氧化亚硝基阴离子会造成组织的损伤。肾脏是细胞外超氧化物歧化酶含量较高的组织之一[14]，细胞外超氧化物歧化酶具有一特殊的结构——肝素结合区，能特异地定位于细胞外基质，清除那里的超氧，调节NO的生物活性。本实验肾组织病理荧光检查显示健肾片治疗组肾小球内及肾小管间隙SOD反应阳性，表明中药健肾片可使嘌呤霉素肾病大鼠清除超氧能力显著提高，调节NO生物活性，改善局部肾组织损伤，而发挥治疗作用。
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* 江苏省教委资助课题
作者简介：曾安平，1992年毕业于南京中医药大学，中医内科学硕士，现为江苏省中医院(南京中医药大学附属医院)全国中医肾病医疗中心主治医师。
孙 伟，1983年毕业于南京中医药大学，1988年获该校中医内科硕士学位。1996年～1997年曾公派赴日本研修学习1年。现为江苏省中医院(南京中医药大学附属医院)全国中医肾病医疗中心副主任医师、副教授。主持和参加过10余项省、部级课题的研究，分别获省级科技进步奖二等奖1项，三等奖、四等奖各2项，发表论文30余篇，参编专著5部，译著4部。
王 钢，1975年毕业于南京中医药大学，1988年获该校中医内科学博士学位，3次赴日本进行学习研究活动。现为江苏省中医院(南京中医药大学附属医院)全国中医肾病医疗中心主任，主任医师、教授、博士生导师。主持近20项国家、省、部级课题的研究，分别获省级科技进步奖二等奖2项，三等奖、4等奖各2项，国内外发表论文70余篇，主编专著2部。
, 百拇医药
邹燕勤，南京中医药大学教授，江苏省中医院全国中医肾病医疗中心学科带头人，全国中医肾病专业委员会副主任委员。
参考文献
[1] 曾安平，等.健肾片治疗慢性肾炎脾肾气虚证.辽宁中医杂志 1993；(9)：26
[2] 曾安平，等.健肾片对实验性肾病模型血栓素B2等指标的影响.辽宁中医杂志 1994；(11)： 24
[3] Robert L.Vernier, Benjamin W.Papermaster, Robert A.Good:Aminonucleoside nephrosis. J Exp Med 1959; 109(1):115
[4] Jonathan R.Diamond, Joseph V.Bonventer, Morris J.Karnovsky:A role for oxygen free radicals in aminonucleoside nephrosis. Kindey Int 1986; 29(2):478
, 百拇医药
[5] Caurent B, Baud L.and Ardaillou R:Reactive oxygen species:Prodution and role in the kidney. Am J Physiol 1986; 251(5～2):765
[6] 小矶谦吉.活性酸素发生剂による肾障害.肾と透析 1988；25：57
[7] 松本顺子.系球体肾炎患儿における血清SOD活性にっいて.肾と透析 1986；2：33
[8] 祁狄克，陆履佩，张建儒.自由基、抗氧自由基系统在慢性肾功能不全发病机理中的探讨.中华肾脏病杂志 1991；7(6)：345
[9] 王钢.自由基与中医中药.南京：第1版.南京大学出版社，1993：455
[10] Moncada S, Palmer RMJ, Higgs A:Nitric oxide:physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol Rev 1991; 43:109
, 百拇医药
[11] Jamie Dananberg, Richard S.Sider, Roger J.Grekin:Sustained hypertension induced by orally administered Nitro-L-Arginine. Hypertension 1993; 21:359
[12] Deng AH, Baylisc:Locally produced EDRF controls preglomerular resistance and ultrafitration coefficient. Am J Physiol 1993; 264:212
[13] Leopoldo Raij, Janeth Guerra, Dwan Holmes:Glomerular thrombosis in pregnancy:Relo of the L-arginine-nitric oxide pathway. Kidney Int 1994;45:775
[14] Jan sandstrom, Kurt Karlsson, Thomas edlund, et al:Heparin-affinity patterns and composition of extracellular superoxide dismutase in human plasma and tissues. Biochem J 1993; 294:853
(收稿日期 1998—11—10 修回日期 1999—01—10), 百拇医药
单位：曾安平 孙伟 王钢 邹燕勤(江苏省中医院全国中医肾病医疗中心 南京 210029)
关键词：健肾片；自由基反应；嘌呤霉素；一氧化氮
健肾片对嘌呤霉素肾病大鼠的及NO的影响健肾片对嘌呤霉素肾病大鼠的
及NO的影响*摘 要 目的 进一步探讨健肾片对慢性肾炎的疗效及作用机理。方法 运用嘌呤霉素腹腔注射所致肾病大鼠病理模型。经用化学发光法检测实验动物的超氧阴离子，采用硝酸还原酶化学比色法检测NO含量。结果 发现该药可减轻嘌呤霉素肾病大鼠的病理变化，减低模型动物的血和红细胞
含量，提高其NO含量。结论 健肾片具有调整自由基反应和增加血NO的生物活性作用。, http://www.100md.com
The Effects of Jianshen Tablet on Serum O2 and NO Level
Nephrotic rat caused by puromycin
ZENG an-ping, SUN wei, WANG gang, et al
(National Nephrosis Treatment Centor of TCM,the Division of Nephrology Jiangsu Hospital
of TCM,Nanjing(210029)
Objective:The effects and therapeutic mechanism of Jianshen Tablet on chronic nephritis were studied further.Methodology:The pathological model was nephrotic rat caused by puromycin (intro-abdominal injection 10mg/kg×7d).The serum O2 and erythrocyte O2 of the model rats were examined with chemiluminescence and their serum NO were examied with nitrite reduction test.Results:It was found that the precription could alleviate the pathological changes of the puromycin nephrotic rat,reduce the serum O2 and erythrocyte O2 of the model rat and increase the serum NO level.Conclusion:It was suggested that Jianshen Tablet may exhibit better efficacy on chronic nephritis by adjusting radical reaction and increasing serum NO physiologyical activity.
, 百拇医药
Key words:Jianshen Tablet free radical reaction puromycin Nitrc oxide
健肾片由党参、生黄芪、白术、山药、生苡仁、桑寄生、菟丝子等组成。其治疗慢性肾炎气虚证的临床效果及对实验性肾病综合征TXB2、PGF1α影响的实验研究已作报道[1～2]。为进一步分析健肾片治疗慢性肾炎的作用机理，我们进行了健肾片对嘌呤霉素肾病大鼠血
及NO影响的实验研究。材料与方法
1 材料
健康成年Wistar大白鼠24只，体重为195g±15g，全部为雄性，由上海动物实验中心提供。造模药物为1%的嘌呤霉素，购自Sigma化学公司。治疗药物健肾片由本院制剂部制备，批号为9203037。
, 百拇医药
2 方法
2.1 造模方法
动物购回后静养3日，随机分为病理组和治疗组。肾病模型制作方法参考Vernier RL的报道[3]。给实验大鼠腹腔注射嘌呤霉素10mg/(kg.d)，从第一次注射日算起，连续1周。
2.2 治疗方法
治疗组大鼠除常规注射嘌呤霉素外，按成人每日每kg体重10倍量，经胃灌服健肾片，每日2次，持续4周。病理组大鼠每日喂服相同量的自来水，余同治疗组。
2.3 检测方法
实验大鼠在实验第2周经尿蛋白定性出现2+以上，符合肾病模型时，经眼眶采血，采用化学发光法分别检测实验第3周及第4周的血浆
和红细胞含量。并在造模前及造模第2周采用硝酸还原酶化学比色法检测血NO含量。至实验第28d，断头处死，取肾组织做HE染色光镜检查及免疫酶标荧光检查。, 百拇医药
结果
1 实验大鼠血浆超氧阴离子的变化
于实验第3周、第4周，检测大鼠血浆中超氧阴离子含量。结果显示，病理组在实验第3周、第4周血浆超氧阴离子含量均较治疗组明显增高(见表1)。
表1 大鼠血浆超氧阴离子的变化(
±s)单位：kcpm组 别
n
实验第3周
实验第4周
, 百拇医药
病理组
11
19.62±2.77
19.18±2.07
治疗组
9
12.41±1.82
13.39±1.67
P值
<0.001
<0.001
2 实验大鼠红细胞超氧阴离子的变化
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于实验第3周、第4周，检测大鼠红细胞中超氧阴离子含量。结果显示，病理组在实验第3周、第4周红细胞超氧阴离子含量均明显高于治疗组(见表2)。
表2 大鼠红细胞超氧阴离子的变化(
±s)单位：kcpm组 别
n
实验第3周
实验第4周
病理组
11
5.83±0.61
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15.65±0.46
治疗组
9
4.79±0.65
4.69±0.51
P值
<0.001
<0.001
3 实验大鼠NO的变化
在实验造模前及第2周检测大鼠血NO含量。结果显示，治疗组明显高于病理组(见表3)。
表3 大鼠NO的变化(
±s)单位：μmol/L, 百拇医药
组别
造模前正常值
病理组
治疗组
0.44±0.03
0.39±0.01
0.467±0.05
P值
P<0.001
P<0.05
4 实验大鼠病理检查
HE染色显示，病理组肾小球基底膜外侧上皮细胞足突肿大，间质细胞增多，局部小管有坏死；治疗组病理改变明显轻于病理组，上皮细胞足突基本正常，间质细胞减少。免疫荧光示肾小球内及肾小管间隙SOD反应阳性，提示治疗组SOD增加。讨论
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嘌呤霉素所致的肾病综合征详细机理尚未阐明。有报道显示，在注射嘌呤霉素前后投用自由基清除剂SOD等可使嘌呤霉素造成的肾小球形态学改变及尿蛋白排泄减轻。因此认为是嘌呤霉素促进自由基产生而损害肾小球[4]。本实验也显示嘌呤霉素腹腔注射1周后，实验大鼠出现蛋白尿及血浆、红细胞中超氧阴离子含量升高，与目前的研究报道相一致。表明本模型属于氧化应激状态的大鼠肾病综合征模型。
近来研究提示，系膜细胞在血小板激活因子、免疫复合物、膜攻击物等刺激下能合成和分泌H2O2和
，这产无炎症细胞浸润的肾小球疾病中发挥着重要的致病作用[5～7]。活性氧除主要通过膜脂质过氧化反应破坏肾小球基底膜(GBM)和上皮细胞外，还可直接损伤GBM和通过髓过氧化物-过氧化氢-卤素系统损伤GBM。脂质和脂质趋化因子等还能引起肾组织的继发性损伤。因此，自由基氧化损伤在肾炎的发生、病程的进展过程中起着关键性作用[8]。应用抗氧化剂治疗慢性肾炎已成为一个重要的新课题，特别是中医中药的抗氧化特性目前在临床及实验中引起了研究者的极大兴趣[9]。本实验显示，使用健肾片治疗后，在改善大鼠肾脏病理损害同时，可降低实验大鼠的血浆及红细胞中超氧阴离子含量，肾组织荧光检查表明肾小球内及肾小管间隙SOD反应阳性，提示健肾片具有较强的抗氧化作用。, 百拇医药
一氧化氮(NO)是由血管内皮细胞合成释放的一种内皮依赖性舒张因子，是介导平滑肌舒张神经传递和炎症控制的重要细胞间信使[10]。近年来的实验表明，NO可以通过调节肾脏入球小动脉、肾小球系膜细胞的张力以及某些情况下出球小动脉来调节肾血流动力学[11]。严重的NO阻滞3周内即可引起血压和肾血管阻力进行性升高，肾小球滤过率降低和蛋白尿的形成[12]。在肾小球疾病中，增加肾内NO的合成可削弱基质蛋白的合成和聚集，防止肾小球硬化的发生。内源性和外源性NO均可防止肾小球硬化的发生。[13]本实验显示，病理组血NO含量低于造模前正常值，而经服用健肾片治疗后，血NO含量明显高于病理组，提示中药健肾片可显著改善嘌呤霉素肾病大鼠模型血NO含量降低所致肾脏损害。另外，有研究提示超氧阴离子和NO反应不仅会干扰NO的信使功能，而且所产生的超氧化亚硝基阴离子会造成组织的损伤。肾脏是细胞外超氧化物歧化酶含量较高的组织之一[14]，细胞外超氧化物歧化酶具有一特殊的结构——肝素结合区，能特异地定位于细胞外基质，清除那里的超氧，调节NO的生物活性。本实验肾组织病理荧光检查显示健肾片治疗组肾小球内及肾小管间隙SOD反应阳性，表明中药健肾片可使嘌呤霉素肾病大鼠清除超氧能力显著提高，调节NO生物活性，改善局部肾组织损伤，而发挥治疗作用。
, http://www.100md.com
* 江苏省教委资助课题
作者简介：曾安平，1992年毕业于南京中医药大学，中医内科学硕士，现为江苏省中医院(南京中医药大学附属医院)全国中医肾病医疗中心主治医师。
孙 伟，1983年毕业于南京中医药大学，1988年获该校中医内科硕士学位。1996年～1997年曾公派赴日本研修学习1年。现为江苏省中医院(南京中医药大学附属医院)全国中医肾病医疗中心副主任医师、副教授。主持和参加过10余项省、部级课题的研究，分别获省级科技进步奖二等奖1项，三等奖、四等奖各2项，发表论文30余篇，参编专著5部，译著4部。
王 钢，1975年毕业于南京中医药大学，1988年获该校中医内科学博士学位，3次赴日本进行学习研究活动。现为江苏省中医院(南京中医药大学附属医院)全国中医肾病医疗中心主任，主任医师、教授、博士生导师。主持近20项国家、省、部级课题的研究，分别获省级科技进步奖二等奖2项，三等奖、4等奖各2项，国内外发表论文70余篇，主编专著2部。
, 百拇医药
邹燕勤，南京中医药大学教授，江苏省中医院全国中医肾病医疗中心学科带头人，全国中医肾病专业委员会副主任委员。
参考文献
[1] 曾安平，等.健肾片治疗慢性肾炎脾肾气虚证.辽宁中医杂志 1993；(9)：26
[2] 曾安平，等.健肾片对实验性肾病模型血栓素B2等指标的影响.辽宁中医杂志 1994；(11)： 24
[3] Robert L.Vernier, Benjamin W.Papermaster, Robert A.Good:Aminonucleoside nephrosis. J Exp Med 1959; 109(1):115
[4] Jonathan R.Diamond, Joseph V.Bonventer, Morris J.Karnovsky:A role for oxygen free radicals in aminonucleoside nephrosis. Kindey Int 1986; 29(2):478
, 百拇医药
[5] Caurent B, Baud L.and Ardaillou R:Reactive oxygen species:Prodution and role in the kidney. Am J Physiol 1986; 251(5～2):765
[6] 小矶谦吉.活性酸素发生剂による肾障害.肾と透析 1988；25：57
[7] 松本顺子.系球体肾炎患儿における血清SOD活性にっいて.肾と透析 1986；2：33
[8] 祁狄克，陆履佩，张建儒.自由基、抗氧自由基系统在慢性肾功能不全发病机理中的探讨.中华肾脏病杂志 1991；7(6)：345
[9] 王钢.自由基与中医中药.南京：第1版.南京大学出版社，1993：455
[10] Moncada S, Palmer RMJ, Higgs A:Nitric oxide:physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol Rev 1991; 43:109
, 百拇医药
[11] Jamie Dananberg, Richard S.Sider, Roger J.Grekin:Sustained hypertension induced by orally administered Nitro-L-Arginine. Hypertension 1993; 21:359
[12] Deng AH, Baylisc:Locally produced EDRF controls preglomerular resistance and ultrafitration coefficient. Am J Physiol 1993; 264:212
[13] Leopoldo Raij, Janeth Guerra, Dwan Holmes:Glomerular thrombosis in pregnancy:Relo of the L-arginine-nitric oxide pathway. Kidney Int 1994;45:775
[14] Jan sandstrom, Kurt Karlsson, Thomas edlund, et al:Heparin-affinity patterns and composition of extracellular superoxide dismutase in human plasma and tissues. Biochem J 1993; 294:853
(收稿日期 1998—11—10 修回日期 1999—01—10), 百拇医药