Ⅳ型胶原α3、α5链免疫组化检测在遗传性肾炎诊断中的意义
作者：张婷婷 刘志红 周 虹 陈惠萍 黎磊石
单位：南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所(南 京，210002)
关键词：Alport综合征；Ⅳ型胶原；免疫荧光
摘 要 目的 摘 要 目的：分析肾组织Ⅳ型胶原α3、α5链的免疫荧光染色在Alport综合征(AS)诊断中的意义。 方 法：采用特异性抗Ⅳ型胶原α3和α5链NC1区域的单克隆抗体，对4例正常人及43例临床疑诊为遗传性肾炎患者的肾脏组织进行了间接免疫荧光染色。结果：抗α3和α5链的抗体荧光染色在10例患者的肾组织中分布异常，并呈现三种类型。在这10例患者中，根据α3和α5链在肾组织中异常分布的特点，对其遗传方式进行分析发现其中7例为X连锁显性遗传，3例为常染色体隐性遗传。 结论：肾活检组织Ⅳ型胶原α3和α5链的免疫荧光染色，在遗传性肾炎，特别AS诊断及其遗传方式分析上具有重要意义。
, 百拇医药
DIAGNOSTIC VALUE OF IMMUNOHISTOC HEMICAL STUDY OF TYPE Ⅳ COLLAGEN α3 AND α5 CHAINSON PATIENTS WITH HEREDITARY NEPHRITIS
Zhang Tingting， Liu Zhihong， Zhou Hong， Chen Huipin， Li Leishi
Research Institute of Nephrology， Jinlin g Hospital， Nanjing University School of Medicine，Nanjing 210002
OBJECTIVE To evaluate the diagnostic value of immunoflurescent staining of type Ⅳ collagen α3 and α5 chains in renal biopsy specimen in patients with Alport syndrome.
, 百拇医药
METHODOLOGY This study inclu ded 49 patients who satisfied the clinical criteria for the diagnosis of hereditary nephritis. Type Ⅳ collagen α3 and α5 chains in renal biopsy secti ons were detected with indirect immunofl uorescence assay.
RESULTS Three types of abnor mal distribution of renal type Ⅳ collagen α3 and α5 chains were observed in 10 of the 49 patients with hereditary nephr itis. Based on the immunohistochemistry features of type Ⅳ collagen chains in glomerular base membrane， 7 of the 10 patients were diagnosed as X-linked dominant inherited Alport syndrome，and 3 as autosomal recessive inherited Alport syndrome.
, 百拇医药
CONCLUSION Immunohistochemic al staining of type Ⅳ collagen α3 and α5 chains in renal biopsy sections is of d iagnostic importance in hereditary nephr itis，especially in the diagnosis of Alpr ot syndrome and the inheritance patten a nalysis.
Key words Alport syndrom e t ype Ⅳ collagen immunohistochemical staining
Alport综合征(Alport syndrome，AS)是一类以血尿、蛋白尿、进性性肾功能减退，伴有感觉神经性耳聋及眼部损害为主要临床症状的遗传性基底膜异常疾病，其遗传方式中约80%～85%为X连锁显性遗传(X-linked AS，XLAS)，约15%属于常染色体隐性遗传(autosomal recessive AS，ARAS)，而极少数为常染色体显性 遗传(autosomal dominant AS，ADAS)。自1902年Gut hrie首次报道AS以来，人们先后从临床、病理、免疫病理以及分子生物学等方面进行深 入探讨及本质揭露，目前已证实，XLAS和ARAS分别是由于位于X染色体的Ⅳ型胶原α5链的基因COL4A5或者位于2号染色体的Ⅳ型胶原α3或α4链的基因(COL4A3 或COL4A4)发生突变[1，2]导致，由于相应编码产物表达异常或缺失，从而不能构建正常的Ⅳ型胶原网状结构[3]，通过主要受累的器官，即肾脏、眼和耳表现出相应的典型临床症状。
, 百拇医药
但在实际临床工作中对遗传性肾炎中AS的确诊及定性仍存在困难，尤其当患者的遗传病史不 明确或临床症状非典型时，本研究根据AS的分子发病机制，对肾活检组织Ⅳ型胶原α3和α5链特异性染色在AS诊断中的意义进行评价，以期进一步提高AS的诊断水平。
1 对象和方法
1.1 研究对象 43例临床及肾脏病理检查诊断为遗传性肾炎的患者来自互不关联的家系，年龄2～51(平均21±11)岁，其中男性30例，女性13例。所有患者均符合Flinder[4]提出的遗传性肾炎的下列临床诊断标准的两条或两条以上：①家族性血尿，伴或不伴有进行性肾功能减退；②电镜下肾组织以肾小球基底膜(GBM)改变为主；③高频区感觉神经性耳聋；④眼部病变，典型改变为前球形晶状体及黄斑周围颗粒。
1.2 方法
1.2.1 实验试剂 抗Ⅳ型胶原α3和α5链NC1区域的鼠源性单克隆抗体(monoclonal antibody，Mab)Mab 17和Mab A7均由美国明尼苏达大学Kashtan教授惠赠。异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗小鼠IgG抗体购自DAKO公司。
, 百拇医药
1.2.2 Ⅳ型胶原α3和α5链的间接免疫荧光染色 经肾脏穿刺获取肾脏活检组织后直接冰冻，进行连续4μm的冰冻组织切片，将冰冻组织切片在空气中干燥后，置于冷丙酮中固定10min，经新鲜的磷酸盐缓冲液(0.01mol/LPBS，pH7.4)冲洗，加入1∶50稀释的Mab17和MabA7，湿盒内室温孵育120min，PBS充分洗涤后加入FITC标记的二抗室温孵育45min。在抗α5链NC1区域的MabA7作用前，组织需经6mol/L尿素、0.1mol/L甘氨酸缓冲液(pH3.5)室温作用10min以变性，暴露抗原结合位点[5]。正常人的移植供肾作为正常对照。
2 结 果
2.1 Ⅳ型胶原α3和α5链在正常肾组织中的分布 在正常人的肾组织中，抗α3和α5链间接免疫荧光染色发现，α3和α5在肾小球基底膜上呈现均一的、连续的线性荧光(图1)，此外肾小囊和远曲小管基底膜也有线性荧光存在，在肾小球基质中则无荧光存在。
, 百拇医药
2.2 受检患者的Ⅳ型胶原α3和α5链荧光检查结果 43例临床疑诊为遗传性肾炎患者中有10例检出Ⅳ型胶原α3和α5链分布异常。在这10例患者中，Ⅳ型胶原α3和α5链在肾组织中的免疫荧光呈现三种分布类型：患者1、2、3和4肾组织的肾小球基底膜、肾小囊及远曲小管基底膜抗α3和α5链抗体荧光染色均为阴性；患者5、6和7肾组织的肾小球基底膜抗α3和α5链抗体荧光染色呈节段阳性，似马赛克状(mosaic)(图2)；患者8、9和10肾组织的肾小球基底膜、肾小囊及远曲小管基底膜抗α3链抗体荧光染色均为阴性，而抗α5链虽然肾小球基底膜荧光染色阴性，但肾小囊及远曲小管基底膜则呈阳性。上述所检出的患者在肾组织中α3和α5链的异常分布与相对应的AS遗传方式如表1所示。
A
, 百拇医药
B
图1 正常人肾组织基底膜的Ⅳ型胶 原α3及α5链的表达(IF，×400)
图A示α3链沿肾小球基底膜呈连续线性分布，球囊壁正常不表达；图B示α5链沿肾小球基底膜及球囊壁连续线性分布
A
B
图2 女性XLAS肾组织基底膜的 Ⅳ型胶原α3及α5链的表达(IF，×400)
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图A示α3链沿肾小球基底膜呈马赛克式节段分布；图B示 α5链沿肾小球基底膜及球囊壁均呈马赛克式节段分布
表1 受检患者在肾组织中α 3和α5链的异常分布特点
患者
遗传方式
性别
荧光分布*
GBM
BC
dTBM
α3
α5
, 百拇医药
α3
α5
α3
α5
1，2，3，4
XLAS
男
-
-
-
-
-
-
5，6，7
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XLAS
女
马赛
克状
马赛
克状
8，9
ARAS
男
-
-
-
+
-
, 百拇医药
+
10
ARAS
女
-
-
-
+
-
+
*GBM肾小球基底膜，BC肾小囊，dTBM远曲小管基底膜
2.3 AS患者的临床资料分析 10例AS患者的具体临床资料如表2所示，所检出患者年龄6～51(平均22±12)岁，其中6例男性，4例女性，6例患者有肯定的肾脏病家族史。7例患者以反复镜下或肉眼血尿起病，就诊时肾功能正常；3例则主要以蛋白尿、浮肿起病，就诊时已出现肾功能不全。有4例男性患者伴听力障碍，主要表现为高频感觉神经性耳聋。3例男性患者伴眼部病变，其中患者1表现为黄斑周围颗粒，其余两名则表现为非典型的晶状体浑浊。肾组织的电镜检查结果以GBM出现厚薄不均，局部有撕裂、分层的改变为主。
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表2 10例AS患者的临床资料
患 者
性
别
年
龄
家族史
临床
表现
肾功能
听力
障碍
眼部
, 百拇医药
病变
GBM
电镜改变
1
男
13
+
血尿
正常
+
+
厚薄不均
2
男
, 百拇医药
13
+
血尿
正常
+
+
厚薄不均
3
男
17
-
蛋白尿
不全
-
, 百拇医药
+
未做
4
男
15
-
蛋白尿
不全
+
-
未做
5
女
38
, 百拇医药
+
血尿
正常
-
-
厚薄不均
6
女
11
+
血尿
正常
-
-
, 百拇医药
局部变薄
7
女
51
+
血尿
正常
-
-
厚薄不均
8
男
23
+
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蛋白尿
不全
+
-
厚薄不均
9
男
10
+
血尿
正常
-
-
厚薄不均
, 百拇医药
10
女
6
-
血尿
正常
-
-
厚薄不均
3 讨 论
Ⅳ型胶原由6条α链组成，但在不同组织基底膜分布的α链成分及数量不尽相同。通过特异的免疫组化染色发现，在肾组织中α1、α2链作为基底膜组成的基本成分分布于所有的基底膜和间质，α3～α5链则分布于肾小球基底膜、肾小囊和远曲小管基底膜，其中α3、α4相伴存在，而α6链则主要分布于肾小囊和远曲小管基底膜[6]；在皮肤组织的表皮基底膜(epidermal basment membrane，EBM)上主要分布α5链。因而本研究选择AS患者所主要受累的基因产物α3、α5链作为观察对象，分析其表达及分布情况，从而作为明确诊断的重要依据。
, 百拇医药
本研究从43例临床及病理拟诊为遗传性肾炎的患者中，通过α3、α5链的免疫荧光染色，筛查出10例肾组织荧光染色结果异常的患者，同时根据α3、α5链荧光在肾组织中所表现出的三种分布类型，对其遗传方式进行了探讨。如表3所示，男性XLAS虽然是由于COL4A5异常导致，但肾组织的α3～α5免疫荧光在肾小球基底膜、肾小囊及远曲小管基底膜上均呈现阴性，这可能是由于α5链的表达异常或缺失，从而导致其它相应α链不能正常参与形成Ⅳ型胶原的三螺旋基本结构[7]，同时男性XLAS皮肤组织的免疫荧光结果表明在EBM中α5链异常缺失。女性XLAS的COL4A5属于杂合子，α5链仍可以部分的表达，因此肾组织的α3～α5免疫荧光在肾小球基底膜上呈现似马赛克状节段分布，而α5链在皮肤EBM上同样出现不连续现象，ARAS是由于COL4A3或COL4A4异常所致，在肾组织中α3～α5的免疫荧光染色出现分离现象[7]，即α3、α4链在肾小球基底膜、肾小囊及远曲小管基底膜上异常缺失，而α5除在GBM中缺失外，仍可正常存在于肾小囊及远曲小管基底膜上，α5链在皮肤EBM上正常存在。因而根据α3、α5链的免疫荧光在肾脏中的独特分布特点在对AS作出诊断的同时，还可进一步对其遗传方式进行分析，将患者区分为男性XLAS、女性XLAS与ARAS，无法获取肾组织的患者亦可根据α5链在皮肤EBM的分布情况而协助男性及女性XLAS的诊断，但是检查结果阴性并不能排除AS诊断。
, 百拇医药
本研究通过对Ⅳ型胶原α3和α5链的检测，在43例遗传性肾炎患者中确诊了10例AS，分析其遗传方式7例为XLAS，3例为ARAS。利用特异性单克隆抗体，对肾活检组织Ⅳ型胶原α3和α5链进行免疫组化检测，是从分子发病机制诊断AS及其遗传方式的一个新方法，也是确诊AS的一个非常重要的指标。但是，我们必须认识到有大约15%～20%AS患者其肾组织中α3和α5的分布是正常的[8]。这表明肾组织α3和α5链检测阴性并不能排除AS的诊断。在本组43例遗传性肾炎患者中，就有数例患者虽然家族史、临床表现和超微病理都非常支持AS诊断，但是，肾组织α3和α5链免疫检测则为阴性，也证明了该检测方法在AS诊断中的局限性。另一个值得重视的问题是要对AS不同遗传方式患者α3和α5链在肾组织不同结构和部位的特殊分布(表3)有所了解，只有这样才能避免漏诊，才能对免疫组化所获得的信息结合临床及病理进行深入的分析和正确的诊断。
表3 AS患者基底膜的α3和α5链免疫 组化分布特点
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遗传类型
GBM*
BC
dTBM
EBM
X连锁显性遗传
男性
α3(Ⅳ型胶原)
-
-
-
-(正常)
α5(Ⅳ型胶原)
, 百拇医药
-
-
-
-
女性
α3(Ⅳ型胶原)
马赛克状
-(正常)
α5(Ⅳ型胶原)
马赛克状
马赛克状
常染色体隐性遗传
男性和女性
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α3(Ⅳ型胶原)
-
-
-
-(正常)
α5(Ⅳ型胶原)
-
+
+
+
*GBM 肾小球基底膜，BC 肾小囊，dTBM 远曲小管基底膜，EBM 表皮基底膜参考文献
1 Barker DF，Hostikka SL，Zhou J et al.Idenification of mutations in the C OL4A5 collagen gene in Alport syndrome.S cience，1990，248：1224
, 百拇医药
2 Lemmink HH，Schroder CH，Monnens LAH et al.The clinical spectrum of type Ⅳ col lagen muations.Hum Mutat，1997，9：477
3 Kashtan CE，Michael AF.Alport syndrome：from bedside to genome to bedside.Am J K idney Dis，1993，22：627
4 Flinter FA，Cameron JS.Genetics of clas sic Alpors syndrome.Lancet，1988，2：1005
5 Gubler MC，Knebelmann B，Beziau A et al .Autosomal recessive Alport syndrome：Im munohistochemical stidy of type Ⅳ collag en chain distribution.Kidney Int，1995，47 ：1142
, 百拇医药
6 Ninomiya Y，Kagawa M，Iyama K et al.Di fferenttial expression of two basement m embrane collagen genea，COL4A6 and COL4A5 ，demonstrated by immunofluorescence stai ning using peptide-specific monoclonal a nttibodies.J Cell Biol，1995，130：1219
7 Thorner PS，Zheng K，Kalluri R et al.C oordinate gene expression of the α3，α4 a nd α5 chains of clooagen type Ⅳ：Evidence from a canine model of X-linked nephrit is with a COL4A5 gene mutation.J Biol Ch em，1996，271：13821
8 Pirson Y.Making the diagnosis of Alport's syndrome.Kidney Int，1999，56：760
(1999-09-09收稿), http://www.100md.com
单位：南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所(南 京，210002)
关键词：Alport综合征；Ⅳ型胶原；免疫荧光
摘 要 目的 摘 要 目的：分析肾组织Ⅳ型胶原α3、α5链的免疫荧光染色在Alport综合征(AS)诊断中的意义。 方 法：采用特异性抗Ⅳ型胶原α3和α5链NC1区域的单克隆抗体，对4例正常人及43例临床疑诊为遗传性肾炎患者的肾脏组织进行了间接免疫荧光染色。结果：抗α3和α5链的抗体荧光染色在10例患者的肾组织中分布异常，并呈现三种类型。在这10例患者中，根据α3和α5链在肾组织中异常分布的特点，对其遗传方式进行分析发现其中7例为X连锁显性遗传，3例为常染色体隐性遗传。 结论：肾活检组织Ⅳ型胶原α3和α5链的免疫荧光染色，在遗传性肾炎，特别AS诊断及其遗传方式分析上具有重要意义。
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DIAGNOSTIC VALUE OF IMMUNOHISTOC HEMICAL STUDY OF TYPE Ⅳ COLLAGEN α3 AND α5 CHAINSON PATIENTS WITH HEREDITARY NEPHRITIS
Zhang Tingting， Liu Zhihong， Zhou Hong， Chen Huipin， Li Leishi
Research Institute of Nephrology， Jinlin g Hospital， Nanjing University School of Medicine，Nanjing 210002
OBJECTIVE To evaluate the diagnostic value of immunoflurescent staining of type Ⅳ collagen α3 and α5 chains in renal biopsy specimen in patients with Alport syndrome.
, 百拇医药
METHODOLOGY This study inclu ded 49 patients who satisfied the clinical criteria for the diagnosis of hereditary nephritis. Type Ⅳ collagen α3 and α5 chains in renal biopsy secti ons were detected with indirect immunofl uorescence assay.
RESULTS Three types of abnor mal distribution of renal type Ⅳ collagen α3 and α5 chains were observed in 10 of the 49 patients with hereditary nephr itis. Based on the immunohistochemistry features of type Ⅳ collagen chains in glomerular base membrane， 7 of the 10 patients were diagnosed as X-linked dominant inherited Alport syndrome，and 3 as autosomal recessive inherited Alport syndrome.
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CONCLUSION Immunohistochemic al staining of type Ⅳ collagen α3 and α5 chains in renal biopsy sections is of d iagnostic importance in hereditary nephr itis，especially in the diagnosis of Alpr ot syndrome and the inheritance patten a nalysis.
Key words Alport syndrom e t ype Ⅳ collagen immunohistochemical staining
Alport综合征(Alport syndrome，AS)是一类以血尿、蛋白尿、进性性肾功能减退，伴有感觉神经性耳聋及眼部损害为主要临床症状的遗传性基底膜异常疾病，其遗传方式中约80%～85%为X连锁显性遗传(X-linked AS，XLAS)，约15%属于常染色体隐性遗传(autosomal recessive AS，ARAS)，而极少数为常染色体显性 遗传(autosomal dominant AS，ADAS)。自1902年Gut hrie首次报道AS以来，人们先后从临床、病理、免疫病理以及分子生物学等方面进行深 入探讨及本质揭露，目前已证实，XLAS和ARAS分别是由于位于X染色体的Ⅳ型胶原α5链的基因COL4A5或者位于2号染色体的Ⅳ型胶原α3或α4链的基因(COL4A3 或COL4A4)发生突变[1，2]导致，由于相应编码产物表达异常或缺失，从而不能构建正常的Ⅳ型胶原网状结构[3]，通过主要受累的器官，即肾脏、眼和耳表现出相应的典型临床症状。
, 百拇医药
但在实际临床工作中对遗传性肾炎中AS的确诊及定性仍存在困难，尤其当患者的遗传病史不 明确或临床症状非典型时，本研究根据AS的分子发病机制，对肾活检组织Ⅳ型胶原α3和α5链特异性染色在AS诊断中的意义进行评价，以期进一步提高AS的诊断水平。
1 对象和方法
1.1 研究对象 43例临床及肾脏病理检查诊断为遗传性肾炎的患者来自互不关联的家系，年龄2～51(平均21±11)岁，其中男性30例，女性13例。所有患者均符合Flinder[4]提出的遗传性肾炎的下列临床诊断标准的两条或两条以上：①家族性血尿，伴或不伴有进行性肾功能减退；②电镜下肾组织以肾小球基底膜(GBM)改变为主；③高频区感觉神经性耳聋；④眼部病变，典型改变为前球形晶状体及黄斑周围颗粒。
1.2 方法
1.2.1 实验试剂 抗Ⅳ型胶原α3和α5链NC1区域的鼠源性单克隆抗体(monoclonal antibody，Mab)Mab 17和Mab A7均由美国明尼苏达大学Kashtan教授惠赠。异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗小鼠IgG抗体购自DAKO公司。
, 百拇医药
1.2.2 Ⅳ型胶原α3和α5链的间接免疫荧光染色 经肾脏穿刺获取肾脏活检组织后直接冰冻，进行连续4μm的冰冻组织切片，将冰冻组织切片在空气中干燥后，置于冷丙酮中固定10min，经新鲜的磷酸盐缓冲液(0.01mol/LPBS，pH7.4)冲洗，加入1∶50稀释的Mab17和MabA7，湿盒内室温孵育120min，PBS充分洗涤后加入FITC标记的二抗室温孵育45min。在抗α5链NC1区域的MabA7作用前，组织需经6mol/L尿素、0.1mol/L甘氨酸缓冲液(pH3.5)室温作用10min以变性，暴露抗原结合位点[5]。正常人的移植供肾作为正常对照。
2 结 果
2.1 Ⅳ型胶原α3和α5链在正常肾组织中的分布 在正常人的肾组织中，抗α3和α5链间接免疫荧光染色发现，α3和α5在肾小球基底膜上呈现均一的、连续的线性荧光(图1)，此外肾小囊和远曲小管基底膜也有线性荧光存在，在肾小球基质中则无荧光存在。
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2.2 受检患者的Ⅳ型胶原α3和α5链荧光检查结果 43例临床疑诊为遗传性肾炎患者中有10例检出Ⅳ型胶原α3和α5链分布异常。在这10例患者中，Ⅳ型胶原α3和α5链在肾组织中的免疫荧光呈现三种分布类型：患者1、2、3和4肾组织的肾小球基底膜、肾小囊及远曲小管基底膜抗α3和α5链抗体荧光染色均为阴性；患者5、6和7肾组织的肾小球基底膜抗α3和α5链抗体荧光染色呈节段阳性，似马赛克状(mosaic)(图2)；患者8、9和10肾组织的肾小球基底膜、肾小囊及远曲小管基底膜抗α3链抗体荧光染色均为阴性，而抗α5链虽然肾小球基底膜荧光染色阴性，但肾小囊及远曲小管基底膜则呈阳性。上述所检出的患者在肾组织中α3和α5链的异常分布与相对应的AS遗传方式如表1所示。
A
, 百拇医药
B
图1 正常人肾组织基底膜的Ⅳ型胶 原α3及α5链的表达(IF，×400)
图A示α3链沿肾小球基底膜呈连续线性分布，球囊壁正常不表达；图B示α5链沿肾小球基底膜及球囊壁连续线性分布
A
B
图2 女性XLAS肾组织基底膜的 Ⅳ型胶原α3及α5链的表达(IF，×400)
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图A示α3链沿肾小球基底膜呈马赛克式节段分布；图B示 α5链沿肾小球基底膜及球囊壁均呈马赛克式节段分布
表1 受检患者在肾组织中α 3和α5链的异常分布特点
患者
遗传方式
性别
荧光分布*
GBM
BC
dTBM
α3
α5
, 百拇医药
α3
α5
α3
α5
1，2，3，4
XLAS
男
-
-
-
-
-
-
5，6，7
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XLAS
女
马赛
克状
马赛
克状
8，9
ARAS
男
-
-
-
+
-
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+
10
ARAS
女
-
-
-
+
-
+
*GBM肾小球基底膜，BC肾小囊，dTBM远曲小管基底膜
2.3 AS患者的临床资料分析 10例AS患者的具体临床资料如表2所示，所检出患者年龄6～51(平均22±12)岁，其中6例男性，4例女性，6例患者有肯定的肾脏病家族史。7例患者以反复镜下或肉眼血尿起病，就诊时肾功能正常；3例则主要以蛋白尿、浮肿起病，就诊时已出现肾功能不全。有4例男性患者伴听力障碍，主要表现为高频感觉神经性耳聋。3例男性患者伴眼部病变，其中患者1表现为黄斑周围颗粒，其余两名则表现为非典型的晶状体浑浊。肾组织的电镜检查结果以GBM出现厚薄不均，局部有撕裂、分层的改变为主。
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表2 10例AS患者的临床资料
患 者
性
别
年
龄
家族史
临床
表现
肾功能
听力
障碍
眼部
, 百拇医药
病变
GBM
电镜改变
1
男
13
+
血尿
正常
+
+
厚薄不均
2
男
, 百拇医药
13
+
血尿
正常
+
+
厚薄不均
3
男
17
-
蛋白尿
不全
-
, 百拇医药
+
未做
4
男
15
-
蛋白尿
不全
+
-
未做
5
女
38
, 百拇医药
+
血尿
正常
-
-
厚薄不均
6
女
11
+
血尿
正常
-
-
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局部变薄
7
女
51
+
血尿
正常
-
-
厚薄不均
8
男
23
+
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蛋白尿
不全
+
-
厚薄不均
9
男
10
+
血尿
正常
-
-
厚薄不均
, 百拇医药
10
女
6
-
血尿
正常
-
-
厚薄不均
3 讨 论
Ⅳ型胶原由6条α链组成，但在不同组织基底膜分布的α链成分及数量不尽相同。通过特异的免疫组化染色发现，在肾组织中α1、α2链作为基底膜组成的基本成分分布于所有的基底膜和间质，α3～α5链则分布于肾小球基底膜、肾小囊和远曲小管基底膜，其中α3、α4相伴存在，而α6链则主要分布于肾小囊和远曲小管基底膜[6]；在皮肤组织的表皮基底膜(epidermal basment membrane，EBM)上主要分布α5链。因而本研究选择AS患者所主要受累的基因产物α3、α5链作为观察对象，分析其表达及分布情况，从而作为明确诊断的重要依据。
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本研究从43例临床及病理拟诊为遗传性肾炎的患者中，通过α3、α5链的免疫荧光染色，筛查出10例肾组织荧光染色结果异常的患者，同时根据α3、α5链荧光在肾组织中所表现出的三种分布类型，对其遗传方式进行了探讨。如表3所示，男性XLAS虽然是由于COL4A5异常导致，但肾组织的α3～α5免疫荧光在肾小球基底膜、肾小囊及远曲小管基底膜上均呈现阴性，这可能是由于α5链的表达异常或缺失，从而导致其它相应α链不能正常参与形成Ⅳ型胶原的三螺旋基本结构[7]，同时男性XLAS皮肤组织的免疫荧光结果表明在EBM中α5链异常缺失。女性XLAS的COL4A5属于杂合子，α5链仍可以部分的表达，因此肾组织的α3～α5免疫荧光在肾小球基底膜上呈现似马赛克状节段分布，而α5链在皮肤EBM上同样出现不连续现象，ARAS是由于COL4A3或COL4A4异常所致，在肾组织中α3～α5的免疫荧光染色出现分离现象[7]，即α3、α4链在肾小球基底膜、肾小囊及远曲小管基底膜上异常缺失，而α5除在GBM中缺失外，仍可正常存在于肾小囊及远曲小管基底膜上，α5链在皮肤EBM上正常存在。因而根据α3、α5链的免疫荧光在肾脏中的独特分布特点在对AS作出诊断的同时，还可进一步对其遗传方式进行分析，将患者区分为男性XLAS、女性XLAS与ARAS，无法获取肾组织的患者亦可根据α5链在皮肤EBM的分布情况而协助男性及女性XLAS的诊断，但是检查结果阴性并不能排除AS诊断。
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本研究通过对Ⅳ型胶原α3和α5链的检测，在43例遗传性肾炎患者中确诊了10例AS，分析其遗传方式7例为XLAS，3例为ARAS。利用特异性单克隆抗体，对肾活检组织Ⅳ型胶原α3和α5链进行免疫组化检测，是从分子发病机制诊断AS及其遗传方式的一个新方法，也是确诊AS的一个非常重要的指标。但是，我们必须认识到有大约15%～20%AS患者其肾组织中α3和α5的分布是正常的[8]。这表明肾组织α3和α5链检测阴性并不能排除AS的诊断。在本组43例遗传性肾炎患者中，就有数例患者虽然家族史、临床表现和超微病理都非常支持AS诊断，但是，肾组织α3和α5链免疫检测则为阴性，也证明了该检测方法在AS诊断中的局限性。另一个值得重视的问题是要对AS不同遗传方式患者α3和α5链在肾组织不同结构和部位的特殊分布(表3)有所了解，只有这样才能避免漏诊，才能对免疫组化所获得的信息结合临床及病理进行深入的分析和正确的诊断。
表3 AS患者基底膜的α3和α5链免疫 组化分布特点
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遗传类型
GBM*
BC
dTBM
EBM
X连锁显性遗传
男性
α3(Ⅳ型胶原)
-
-
-
-(正常)
α5(Ⅳ型胶原)
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-
-
-
-
女性
α3(Ⅳ型胶原)
马赛克状
-(正常)
α5(Ⅳ型胶原)
马赛克状
马赛克状
常染色体隐性遗传
男性和女性
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α3(Ⅳ型胶原)
-
-
-
-(正常)
α5(Ⅳ型胶原)
-
+
+
+
*GBM 肾小球基底膜，BC 肾小囊，dTBM 远曲小管基底膜，EBM 表皮基底膜参考文献
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(1999-09-09收稿), http://www.100md.com