人肝癌组织GGT异常表达与逆转录巢式PCR分析**
作者：姚登福 汤琪云 刘艳华 孟宪镛 陆建新 吴信华 黄介飞
单位：南通医学院附属医院 邮政编码：226001
关键词：肝癌 γ-谷氨酰转肽酶基因 表达 总核糖核酸 逆转录巢式多聚酶链反应
江苏医药990601 摘要 为探讨肝癌组织中γ-谷氨酰转肽酶(GGT)的表达与改变，将自身配对的肝癌、癌周及远癌组织总RNA纯化，分析不同分子形式GGT表达，并以逆转录巢式PCR(RT-PCR)扩增GGT5?-末端非编码区基因。结果：肝癌、癌周和远癌组总RNA浓度呈明显的梯度升高趋势(P<0.05)；肝癌组总GGT比活性和不同分子形式GGT均明显高于癌周和远癌组(P<0.05)；RT-PCR扩增GGT基因片段，在肝癌、癌周和远癌组阳性率分别为95.8%、87.5%和79.2%。提示肝癌组织中GGT呈异常表达，GGT基因分析可望成为监测肝细胞癌变的灵敏方法。
, 百拇医药
Abnormal Expression and RT-PCR Analysis of γ-Glutamyl Transpeptidase Genes in the Tissues of Human Hepatocelullar Carcinoma
Yao Dengfu et al
Affiliated Hospital, Nantong Medical college, Nantong
Abstract To explore the situation of expression of γ-glutamyl transpeptidase (GGT) genes in the tissues of hepatocellular carcinoma, The total RNA were purified and quantified, the different molecular forms of GGT were analyzed, The 5′-non coding (5′-NC) regions of the GGT genes were amplified using reverse transcription nest polymerase chain reaction (RT-PCR) in the self-paired samples of hepatocellular carcinoma, adjacent paracancerous and distal cancerous tissues. Total RNA quantitation showed an increasing tendency from carcinoma to distal cancerous. The specific activities (U/g) of total GGT and the amount of different molecular forms of GGT were significantly higher in carcinoma tissues than those in paracancerous and distal cancerous tissues (P<0.05). The positive rates of GGT gene fragment amplified by RT-PCR were 95.8% in hepatocellular carcinoma, 87.5% in paracancerous tissue, and 79.2% in distal cancerous tissues. The present data suggest that GGT gene in the tissues of hepatocellular carcinoma was overexpressed and the analysis of GGT gene fragments may play a role in monitoring the early events of hepatocellular carcinoma.
, 百拇医药
Key words Hepatocellular carcinoma γ-glutamyl transpeptidase gene Expression Total RNA RT-PCR
肿瘤发生与DNA合成及核酸代谢旺盛密切相关。人体内γ-谷氨酰转肽酶(GGT)既与生物转化、核酸代谢及肿瘤发生有密切关系，又是反映肝细胞恶性病变的灵敏标志酶[1，2]。当肝细胞癌变时，GGT大量表达，并出现明显的异质性改变，但GGT为何异常表达了解甚少[3]。本研究纯化人肝癌组织中GGT酶蛋白和总RNA，以逆转录巢式PCR(RT-PCR)对GGT基因进行了扩增和分析，旨在探讨肝细胞癌变过程中GGT的表达和改变机制。
材料与方法
一、研究对象
在1997年7月～1998年4月期间，采用自身配对法留取肝癌、癌周及远癌组织各24份。患者年龄平均51.3岁；男18例，女6例；肝癌>3cm20例，<3cm4例；血AFP浓度>50ng/ml14例，<50ng/ml10例；HBsAg阳性19例，阴性5例。每份肝组织重约250mg于-85℃保存，分别作病理学检查(HE染色)、总RNA提取和GGT制备。
, 百拇医药
二、肝GGT提取与浓度分析
取癌、癌周或远癌组织50mg，以A液和B液(含0.5%TritonX-100)分别提取可溶性GGT和总GGT(膜结合性和可溶性)。肝组织于冰水浴中迅速研碎后置于4℃过夜。经高速冷冻离心机离心后，以γ-谷氨酰对硝基苯胺直接法分析上清液中GGT活力(U/L)；以福林一酚试剂法测蛋白浓度(g/L)，计算组织中酶比活性(U/g)。
三、总RNA制备与浓度分析
取肝组织50mg，置无RNAase的匀浆器中，加RNAzole匀浆并以氯仿沉淀，经高速冷冻离心，取上清液加等量异丙醇提取，预冷乙醇洗2次，加TE缓冲液于60℃水浴10分钟，取部分于岛津UV-2201型紫外分光光度计上测A260，换算组织总RNA(μg/mg组织)，并紫外分光连续扫描以鉴定RNA纯度，置-85℃保存备用。
, 百拇医药 四、引物设计与RT-PCR扩增
按肝癌细胞株GGT核苷酸序列[4]，在5?-NC区设计巢式PCR扩增引物，由中科院上海细胞所合成。取2μgRNA及随机引物，经逆转录酶合成GGT-cDNA后，再进行巢式PCR扩增，其产物第一阶段为400bp，第二阶段为280bp。PCR终产物经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，紫外透射光照射并与DNA标准比较判别结果。
五、资料统计和分析
用方差分析、χ2检验等分析统计处理数据，并以
±s表示结果和进行两两比较。
结果
, http://www.100md.com
一、肝癌组织的病理学检查
经病理组织学检查发现24例肝癌中，20例系原发性肝癌(PHC)，4例为转移性肝癌(胃癌2例、胰腺癌和乳腺癌各1例)，经地衣红染色示HBV阳性者19例。癌周组织和远癌组织在组织学上呈肝硬化和慢性肝炎改变，癌旁组织伴肝硬化和不典型增生17例，远癌组织伴肝硬化和不典型增生11例。
二、癌组织中GGT的表达与变化
癌组织中总GGT、可溶性GGT和膜结合性GGT的表达与变化见表1。总GGT、可溶性GGT和膜结合性GGT，在癌组织中的表达非常显著地高于癌周和远癌组织(P<0.01)；而癌周和远癌组织间的表达，其比活性差别较小(P>0.05)；可溶性GGT与总GGT的比率在肝癌、癌周和远癌组间较恒定(P>0.05)。
表1 肝癌组织总GGT及不同分子形式GGT的变化(μg,±s)
, 百拇医药
例数
总GGT
可溶性GGT
膜结合性GGT
肝癌
24
100.60±87.43
49.23±53.24
50.87±48.13
癌周
24
51.61±21.71*
, 百拇医药
22.45±13.47*
29.16±16.31*
远癌
24
46.61±16.42*
22.74±14.32*
23.87±11.80*
与肝癌组织比较： *P<0.01
三、总RNA浓度与基因扩增分析
GGT-cDNA以巢式PCR进行扩增，其终产物为280bp与原设计一致，区带清晰。癌组织中总RNA及GGT基因的扩增结果见表2。总RNA浓度在肝癌组明显低于癌周(P<0.05)和远癌组(P<0.001)。肝癌组、癌周和远癌组被扩增片段的出现率，分别为95.8%、87.5%和79.2%。未见基因片段有8例，肝癌组1例系胰腺癌转移；癌周组3例，2例为肝硬化，1例为慢性肝炎；远癌组5例，其中2例为肝硬化，3例为慢性肝炎。表2 肝癌组织中总RNA浓度与GGT基因的RT-PCR扩增
, 百拇医药
例数
总RNA
(μg/mg)
5?NC区扩增区带
阳性(%)
阴性(%)
肝癌
24
21.11±30.84
23(95.8)
1(4.2)
癌周
, http://www.100md.com
24
39.98±31.45*
21(87.5)
3(12.5)
远癌
24
53.84±50.50**
19(79.2)
5(20.8)
与肝癌组比较：*P<0.05 **P<0.001讨论
肝癌发生的分子机制复杂，它是病毒、化学致癌物等多病因及启动、促进、演进多阶段发病过程。推测有多种基因发生改变，其根本原因在于癌基因及癌相关基因的激活及抗癌基因的失活等，其总和引起细胞生长失控，肝细胞出现持续增殖，最后导致癌变[5]。肝GGT可通过酶促反应使肝脏解毒及生物转化功能加强，以解除病毒、化学致癌剂及其它物质的毒性作用[6]，保护正常肝脏免受启动因素和促癌因素的影响，也可造成肝组织病理性损害。本文对24例肝癌、癌周和远癌组织病理学检查发现，从远癌→癌周→癌组织是以慢性肝炎为主到肝硬化为主到肝癌的发展过程，且大多数(19/24)伴有HBV感染，符合人类肝癌的形成往往是从慢性肝炎到肝硬化到肝癌的多阶段过程。随肝组织病理学改变的加深而总RNA浓度逐步下降，提示可能与长期的肝细胞坏死、结节样增生、假小叶形成，出现大量的纤维结缔组织代替正常肝细胞，使肿瘤组织残存肝细胞减少，引起组织总RNA减少有关。
, http://www.100md.com
肝癌组组织中GGT呈过度表达趋势，肝癌组总GGT、可溶性及膜结合性GGT比活性，都明显高于癌周及远癌组(P<0.05)，而在癌周和远癌组间相差不明显(P>0.05)。可溶性GGT存在于细胞浆中，膜结合性主要结合于细胞膜上。可溶性GGT各组中均升高，且与总GGT的比值几乎都恒定在0.47左右，反映了癌变的肝细胞可诱导胞浆可溶性GGT释放增加，使血清GGT活性增加，分析此异常标志物有助于肝癌的诊断，以往临床已得到证实[2，7]。
人类GGT基因位于22号染色体BCR基因相关区域，可能存在GGT基因家族，以适应高度生理变异及不同的生理状态下的表达。在鼠胎肝→新生肝→成熟肝的发育过程中，GGT基因从甲基化不足→中等甲基化→充分甲基化，并伴有酶活性进行性下降，说明GGT基因甲基化状态在肝细胞分化中起重要调节作用[8，9]。本文以RT-PCR法分析了肝癌、癌周和远癌组织GGT基因的表达，扩增区带出现率在癌组织为95.8%，癌周为87.5%，远癌为79.2%，且区带特异，可在小肝癌和血AFP低浓度肝癌中出现。说明此方法灵敏可靠，除可用于GGT基因的甲基化分析外，如开展外周血GGT基因[1]和AFP-mRN联合分析[10]，对于早期监测外周血中肝癌细胞出现、肝癌转移或复发等具有良好的应用前景。
, 百拇医药
**国家教委留学回国人员课题及南通市科委课题资助
参考文献
[1] Tsutsumi M, et al. Hepatology 1996；23(5)：1093.
[2] Xu KC, et al. Am J Gastroent 1992；87(8)：991.
[3] 姚登福，等.国外医学内科学分册 1997；24(2)：59.
[4] Okamoto T, et al. Biochem 1994；33(38)：11536.
[5] Countay L, et al. Biochem J 1994；297(5)：503.
, 百拇医药
[6] Bellini M, et al. Alcohl & Alcolism 1997；32(3)：259.
[7] 姚登福，等.胃肠病学和肝脏病学杂志 1997；6(1)：78.
[8] Peng SY, et al. Hepatology 1993；17(1)：35.
[9] Jennifer L, et al. Cell 1995；83(1)：13.
[10] Komeda T, et al. Cancer 1995；75(4)：2214.
(1998年7月29日收稿 同年9月10日修回), 百拇医药
单位：南通医学院附属医院 邮政编码：226001
关键词：肝癌 γ-谷氨酰转肽酶基因 表达 总核糖核酸 逆转录巢式多聚酶链反应
江苏医药990601 摘要 为探讨肝癌组织中γ-谷氨酰转肽酶(GGT)的表达与改变，将自身配对的肝癌、癌周及远癌组织总RNA纯化，分析不同分子形式GGT表达，并以逆转录巢式PCR(RT-PCR)扩增GGT5?-末端非编码区基因。结果：肝癌、癌周和远癌组总RNA浓度呈明显的梯度升高趋势(P<0.05)；肝癌组总GGT比活性和不同分子形式GGT均明显高于癌周和远癌组(P<0.05)；RT-PCR扩增GGT基因片段，在肝癌、癌周和远癌组阳性率分别为95.8%、87.5%和79.2%。提示肝癌组织中GGT呈异常表达，GGT基因分析可望成为监测肝细胞癌变的灵敏方法。
, 百拇医药
Abnormal Expression and RT-PCR Analysis of γ-Glutamyl Transpeptidase Genes in the Tissues of Human Hepatocelullar Carcinoma
Yao Dengfu et al
Affiliated Hospital, Nantong Medical college, Nantong
Abstract To explore the situation of expression of γ-glutamyl transpeptidase (GGT) genes in the tissues of hepatocellular carcinoma, The total RNA were purified and quantified, the different molecular forms of GGT were analyzed, The 5′-non coding (5′-NC) regions of the GGT genes were amplified using reverse transcription nest polymerase chain reaction (RT-PCR) in the self-paired samples of hepatocellular carcinoma, adjacent paracancerous and distal cancerous tissues. Total RNA quantitation showed an increasing tendency from carcinoma to distal cancerous. The specific activities (U/g) of total GGT and the amount of different molecular forms of GGT were significantly higher in carcinoma tissues than those in paracancerous and distal cancerous tissues (P<0.05). The positive rates of GGT gene fragment amplified by RT-PCR were 95.8% in hepatocellular carcinoma, 87.5% in paracancerous tissue, and 79.2% in distal cancerous tissues. The present data suggest that GGT gene in the tissues of hepatocellular carcinoma was overexpressed and the analysis of GGT gene fragments may play a role in monitoring the early events of hepatocellular carcinoma.
, 百拇医药
Key words Hepatocellular carcinoma γ-glutamyl transpeptidase gene Expression Total RNA RT-PCR
肿瘤发生与DNA合成及核酸代谢旺盛密切相关。人体内γ-谷氨酰转肽酶(GGT)既与生物转化、核酸代谢及肿瘤发生有密切关系，又是反映肝细胞恶性病变的灵敏标志酶[1，2]。当肝细胞癌变时，GGT大量表达，并出现明显的异质性改变，但GGT为何异常表达了解甚少[3]。本研究纯化人肝癌组织中GGT酶蛋白和总RNA，以逆转录巢式PCR(RT-PCR)对GGT基因进行了扩增和分析，旨在探讨肝细胞癌变过程中GGT的表达和改变机制。
材料与方法
一、研究对象
在1997年7月～1998年4月期间，采用自身配对法留取肝癌、癌周及远癌组织各24份。患者年龄平均51.3岁；男18例，女6例；肝癌>3cm20例，<3cm4例；血AFP浓度>50ng/ml14例，<50ng/ml10例；HBsAg阳性19例，阴性5例。每份肝组织重约250mg于-85℃保存，分别作病理学检查(HE染色)、总RNA提取和GGT制备。
, 百拇医药
二、肝GGT提取与浓度分析
取癌、癌周或远癌组织50mg，以A液和B液(含0.5%TritonX-100)分别提取可溶性GGT和总GGT(膜结合性和可溶性)。肝组织于冰水浴中迅速研碎后置于4℃过夜。经高速冷冻离心机离心后，以γ-谷氨酰对硝基苯胺直接法分析上清液中GGT活力(U/L)；以福林一酚试剂法测蛋白浓度(g/L)，计算组织中酶比活性(U/g)。
三、总RNA制备与浓度分析
取肝组织50mg，置无RNAase的匀浆器中，加RNAzole匀浆并以氯仿沉淀，经高速冷冻离心，取上清液加等量异丙醇提取，预冷乙醇洗2次，加TE缓冲液于60℃水浴10分钟，取部分于岛津UV-2201型紫外分光光度计上测A260，换算组织总RNA(μg/mg组织)，并紫外分光连续扫描以鉴定RNA纯度，置-85℃保存备用。
, 百拇医药 四、引物设计与RT-PCR扩增
按肝癌细胞株GGT核苷酸序列[4]，在5?-NC区设计巢式PCR扩增引物，由中科院上海细胞所合成。取2μgRNA及随机引物，经逆转录酶合成GGT-cDNA后，再进行巢式PCR扩增，其产物第一阶段为400bp，第二阶段为280bp。PCR终产物经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，紫外透射光照射并与DNA标准比较判别结果。
五、资料统计和分析
用方差分析、χ2检验等分析统计处理数据，并以
±s表示结果和进行两两比较。结果
, http://www.100md.com
一、肝癌组织的病理学检查
经病理组织学检查发现24例肝癌中，20例系原发性肝癌(PHC)，4例为转移性肝癌(胃癌2例、胰腺癌和乳腺癌各1例)，经地衣红染色示HBV阳性者19例。癌周组织和远癌组织在组织学上呈肝硬化和慢性肝炎改变，癌旁组织伴肝硬化和不典型增生17例，远癌组织伴肝硬化和不典型增生11例。
二、癌组织中GGT的表达与变化
癌组织中总GGT、可溶性GGT和膜结合性GGT的表达与变化见表1。总GGT、可溶性GGT和膜结合性GGT，在癌组织中的表达非常显著地高于癌周和远癌组织(P<0.01)；而癌周和远癌组织间的表达，其比活性差别较小(P>0.05)；可溶性GGT与总GGT的比率在肝癌、癌周和远癌组间较恒定(P>0.05)。
表1 肝癌组织总GGT及不同分子形式GGT的变化(μg,
±s), 百拇医药
例数
总GGT
可溶性GGT
膜结合性GGT
肝癌
24
100.60±87.43
49.23±53.24
50.87±48.13
癌周
24
51.61±21.71*
, 百拇医药
22.45±13.47*
29.16±16.31*
远癌
24
46.61±16.42*
22.74±14.32*
23.87±11.80*
与肝癌组织比较： *P<0.01
三、总RNA浓度与基因扩增分析
GGT-cDNA以巢式PCR进行扩增，其终产物为280bp与原设计一致，区带清晰。癌组织中总RNA及GGT基因的扩增结果见表2。总RNA浓度在肝癌组明显低于癌周(P<0.05)和远癌组(P<0.001)。肝癌组、癌周和远癌组被扩增片段的出现率，分别为95.8%、87.5%和79.2%。未见基因片段有8例，肝癌组1例系胰腺癌转移；癌周组3例，2例为肝硬化，1例为慢性肝炎；远癌组5例，其中2例为肝硬化，3例为慢性肝炎。表2 肝癌组织中总RNA浓度与GGT基因的RT-PCR扩增
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例数
总RNA
(μg/mg)
5?NC区扩增区带
阳性(%)
阴性(%)
肝癌
24
21.11±30.84
23(95.8)
1(4.2)
癌周
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24
39.98±31.45*
21(87.5)
3(12.5)
远癌
24
53.84±50.50**
19(79.2)
5(20.8)
与肝癌组比较：*P<0.05 **P<0.001讨论
肝癌发生的分子机制复杂，它是病毒、化学致癌物等多病因及启动、促进、演进多阶段发病过程。推测有多种基因发生改变，其根本原因在于癌基因及癌相关基因的激活及抗癌基因的失活等，其总和引起细胞生长失控，肝细胞出现持续增殖，最后导致癌变[5]。肝GGT可通过酶促反应使肝脏解毒及生物转化功能加强，以解除病毒、化学致癌剂及其它物质的毒性作用[6]，保护正常肝脏免受启动因素和促癌因素的影响，也可造成肝组织病理性损害。本文对24例肝癌、癌周和远癌组织病理学检查发现，从远癌→癌周→癌组织是以慢性肝炎为主到肝硬化为主到肝癌的发展过程，且大多数(19/24)伴有HBV感染，符合人类肝癌的形成往往是从慢性肝炎到肝硬化到肝癌的多阶段过程。随肝组织病理学改变的加深而总RNA浓度逐步下降，提示可能与长期的肝细胞坏死、结节样增生、假小叶形成，出现大量的纤维结缔组织代替正常肝细胞，使肿瘤组织残存肝细胞减少，引起组织总RNA减少有关。
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肝癌组组织中GGT呈过度表达趋势，肝癌组总GGT、可溶性及膜结合性GGT比活性，都明显高于癌周及远癌组(P<0.05)，而在癌周和远癌组间相差不明显(P>0.05)。可溶性GGT存在于细胞浆中，膜结合性主要结合于细胞膜上。可溶性GGT各组中均升高，且与总GGT的比值几乎都恒定在0.47左右，反映了癌变的肝细胞可诱导胞浆可溶性GGT释放增加，使血清GGT活性增加，分析此异常标志物有助于肝癌的诊断，以往临床已得到证实[2，7]。
人类GGT基因位于22号染色体BCR基因相关区域，可能存在GGT基因家族，以适应高度生理变异及不同的生理状态下的表达。在鼠胎肝→新生肝→成熟肝的发育过程中，GGT基因从甲基化不足→中等甲基化→充分甲基化，并伴有酶活性进行性下降，说明GGT基因甲基化状态在肝细胞分化中起重要调节作用[8，9]。本文以RT-PCR法分析了肝癌、癌周和远癌组织GGT基因的表达，扩增区带出现率在癌组织为95.8%，癌周为87.5%，远癌为79.2%，且区带特异，可在小肝癌和血AFP低浓度肝癌中出现。说明此方法灵敏可靠，除可用于GGT基因的甲基化分析外，如开展外周血GGT基因[1]和AFP-mRN联合分析[10]，对于早期监测外周血中肝癌细胞出现、肝癌转移或复发等具有良好的应用前景。
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**国家教委留学回国人员课题及南通市科委课题资助
参考文献
[1] Tsutsumi M, et al. Hepatology 1996；23(5)：1093.
[2] Xu KC, et al. Am J Gastroent 1992；87(8)：991.
[3] 姚登福，等.国外医学内科学分册 1997；24(2)：59.
[4] Okamoto T, et al. Biochem 1994；33(38)：11536.
[5] Countay L, et al. Biochem J 1994；297(5)：503.
, 百拇医药
[6] Bellini M, et al. Alcohl & Alcolism 1997；32(3)：259.
[7] 姚登福，等.胃肠病学和肝脏病学杂志 1997；6(1)：78.
[8] Peng SY, et al. Hepatology 1993；17(1)：35.
[9] Jennifer L, et al. Cell 1995；83(1)：13.
[10] Komeda T, et al. Cancer 1995；75(4)：2214.
(1998年7月29日收稿 同年9月10日修回), 百拇医药