端粒酶活性检测在膀胱癌早期诊断及其术后复发监测中的意义
作者：李显文(综述) 莫曾南 陈坚(审校)
单位：广西医科大学一附院泌尿外科
关键词：
广西医学990636
端粒是染色体末端的特殊结构，是高度重复的DNA序列，它虽不带基因，但却具有稳定染色体结构和功能的重要作用。端粒酶是催化合成并维持端粒序列稳定的一种核糖核蛋白，也是RNA依赖性的DNA多聚酶(1)。近年来研究发现约90%的人类癌症有端粒酶活性表达而大多数的成熟组织则不表达(2)，这表明端粒酶的活化和上调可能与癌症的演进存在相关性。肿瘤细胞端粒酶活性检测及活性抑制具有潜在的诊治应用前景。
1 端粒酶的结构与功能
端粒酶具有模板功能的RNA组分和催化活性蛋白组分构成。作为依赖RNA的一种特殊聚合物，它属于反转录酶范畴。端粒酶能以自身RNA组分为模板从头合成端粒序列以弥补细胞分裂时染色体末端的缩短，从而稳定端粒的长度。人端粒RNA组分(human telomerase RNA component,hTR)于1995被克隆，其模板区序列与人端粒重复序列(TTAGGG)n互补配对，对合成端粒DNA至关重要(3)。进一步研究发现，拷贝hTR的基因位于人3号染色体长臂远端。相比之下，端粒酶蛋白组分研究步伐较慢。1995年Collins等(4)首次应用联合层析、免疫沉淀及紫外交联等技术，成功地分离、克隆了四膜虫端粒酶蛋白基因，分子量分别为soKDa和95KDa。P95KDa亚单位蛋白能与32P标记的端粒DNA序列引物d(GT2G3)2(GU2G3)特异交联，而P80亚单位蛋白能与32P标记的端粒酶RNA特异结合。此后，端粒酶蛋白组分先后在哺乳动物中得到确认。目前已确认出与回膜虫端粒酶P80蛋白同源的人类TPI/TLPI蛋白。新近报道，人类端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTRT)就是端粒酶蛋白组分。hTRT与逆转录酶同源，类似于与Eap123、Est2p和SPTrtT1端粒酶相关的蛋白。逆转录酶类似种类中Est2p的一个催化结构已被确认，它不是P80蛋白或其同源物。hTRT是有催化活性的端粒酶蛋白组分，正常人体二倍体细胞短暂表达具有端粒酶活性的hTRT表明hTRT是这些细胞恢复端粒酶活性必需的限制性成分(5)。
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2 端粒酶与肿瘤演进的关系
近年来认为在癌症发展中一个潜在的限速阶段是人体正常细胞转化为能无限增殖的永生化细胞。在永生化出现前，至少存在两个不同的细胞内机制的实现。第一步通常是要涉及到两个抑癌基因即P53和PRB失活的途径；而第二步则大都涉及到端粒酶表达的调控机制大部未知。一般认为肿瘤细胞端粒酶再激活机制可能有：染色体突变，3号染色体基因失活，P21、Rb抑癌基因调控(6，7，8)。研究亦表明持续性瘤细胞增殖有赖于端粒酶活性的存在，端粒酶活性表达程度一般随肿瘤演进阶段的上升而增强。但事实上端粒酶与肿瘤的关系并非那么简单。多种真核生物(包括人)中有替代的端粒延伸机制的发现和某些情况下永生化细胞端粒酶活性无表达的事实(9，10)说明肿瘤演进机制是复杂而多元的，端粒酶在其中扮演何种角色待进一步阐明。
3 端粒酶活性表达与膀胱癌相关性研究
1989年Morin等(11)在人Hela细胞中首先检测到了端粒酶活性并创建了测定端粒酶活性的端粒重复序列延伸方法。但因该法需细胞量多且提取物中端粒酶信号较弱，需时长，故限制了其临床推广。1994年Kim等(12)建立了一种基于PCR的高度敏感的端粒酶活性表达测定法-端粒重复片段扩增法(telomeric repeat amplification protocol,TRAP)。此法使得可从少至10个细胞中快速检测到端粒酶活性，从而使端粒酶活性检测在肿瘤包括泌尿系肿瘤得到了广泛开展。
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3.1 膀胱癌组织中端粒酶活性研究
1996年Hoshi等(13)首先报道了膀胱癌组织中端粒酶活性的表达。应用TRAP法对50例膀胱癌病人进行了研究，端粒酶活性表达的总敏感度为90%，其中G1(病理1级)敏感度为50%，G2、G3(病理2级、3级)敏感度为100%。Heine等(14)应用非放射性的TRAP法测定20例膀胱癌标本，亦发现95%的标本表达端粒酶活性。Lin等(15)测定了40例膀胱癌标本的端粒酶活性，结果发现总敏感度97.5%，G1、G2、G3的敏感度分别为20%、62%、100%；Ta～T1期的端粒酶活性敏感度为45.5%，T2～T4期则为100%。故此认为端粒酶活性与膀胱癌肿瘤细胞分级和浸润深度明显相关，可以作为临床诊断和判断预后的指标。国内彭钧铮等(16)研究结果与Lin的基本一致。Yoshida等(17)测定56例膀胱癌标本、17例非恶性膀胱疾病和2例泌尿道发育不全疾病组织标本的端粒酶活性，结果发现膀胱组织标本无阳性表达。但是在泌尿道发育不全组织标本及近乎所有的分化良好的I期膀胱癌中可检测到端粒酶活性，这提示膀胱癌早期阶段即表达出端粒酶活性，这在发现早期初发或复发膀胱肿瘤上也许是一个有用的标记物。
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但也有一些作者认为端粒酶的表达率与肿瘤的分级、分期无关。Kyo等(18)用非放射性的TRAP法测定了22例尿路上皮肿瘤(包括13例膀胱癌)组织的端粒酶活性，结果发现总敏感度为100%。其中9例在标本样品稀释10倍后仍可检出端粒酶活性，这表明这些肿瘤有高活性的端粒酶表达。但出人意料的是，高活性的端粒酶表达与肿瘤的临床病理特征包括临床分期、病理分级、肿瘤多样性和复发状态等无相关意义。Kamata等(19)的研究也得出了类似的结论。
3.2 端粒酶活性检测在膀胱癌早期诊断及其复发监测中的意义
Kavaler等(20)检测了104例膀胱癌病人尿标本脱落细胞端粒酶活性发现总敏感度为85%(88/104)，其中G179%(23/29)、G284%(32/38)、G387.5%(28/32)，5例原位癌均为阳性而健康对照组均为阴性。作为对照，对其中88例病人进行了尿脱落细胞学检查，总检出率为51%(45/88)，其中G113%(3/23)、G244%(14/32)、G382%(23/28)。端粒酶活性总敏感度与脱细胞学总检出率比较，两者差异显著(P<0.001)，而且在低分级细胞学水平(G1和G2)脱落细胞学检出率31%(17/55)与端粒酶活性敏感度82%(55/67)相比两者有显著差异(P<0.001)。Yoshida等(17)检测了26例膀胱癌病人和83例非恶性疾病病人的尿脱落细胞端粒酶活性，结果发现26例膀胱癌中有16例有端粒酶活性表达，敏感度为62%；而83例非恶性病中只有3例良性前列腺增生症患者可测出端粒酶活性，特异度为96.4%。Kinoshita等(21)检测了45例膀胱癌病人尿标本中42例尿标本和43例膀胱冲洗液标本脱落细胞端粒酶活性，发现尿标本敏感度为55%，膀胱冲洗液标本为84%；如把这两组标本合并则可发现端粒酶活性共在40例标本中表达，敏感度为89%(40/45)，而同时作为对照的常规脱落细胞学检查只在19例病人中有阳性发现，检出率为42%(19/45)。Lee等(22)测定了23例膀胱癌病人膀胱冲洗液脱落细胞端粒酶活性，显示总敏感度为95.7%(22/23)作为对照研究的冲洗液脱落细胞学检查总检出率仅为69.6%。而且，在5例细胞学分级为G1的病例冲洗液脱落细胞学的检出率仅为20%，而端粒酶活性则可在80%的标本中检出(P<0.05)。在Ta和T1期膀胱癌病人膀胱冲洗液中可检测出端粒酶活性敏感度为93.3%(14/15)，而同样的病人其膀胱冲洗液脱落细胞检出率只有60%(9/15)。Ramakumar等(23)最近比较了尿细胞学、膀胱肿瘤抗原(BTA)、FDP、NMP22、端粒酶等几项膀胱癌诊断指标的敏感度和特异度。结果发现：在兼顾敏感度和特异度上尿端粒酶是最高的，分别为70%和90%。在细胞分级为1级和非浸润性肿瘤(PTa)尤其是在原位癌病人，尿端粒酶检测在精确度上是最强的指标。总之，目前众多作者认为尿和膀胱冲洗液端粒酶活性检测可能是早期诊断初发和复发膀胱癌的更敏感的指标，尤其在低分级肿瘤，更具实用价值，它可望取代常规的尿或膀胱冲洗液脱落细胞学检查而成为膀胱癌早期诊断和术后复发监测的首选方法。
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4 结语
虽然目前对端粒酶的研究还存在许多未知领域，特别是真核生物(包括人)中发现不依赖端粒酶的端粒延长机制以及端粒序列的变化规律等有待于进一步深入探索，但端粒酶与肿瘤的发生发展密切相关已经得到肯定。通过进一步的实验与临床研究，端粒酶活性检测有望成为早期诊断膀胱癌及复发的敏感指标。
参考文献
1 Holt SE,Wright WE,Shay JW.Multiple pathways for the regutation of tel omerase activity.Eur J Cancer 1997;31:761
2 Shay JW.Telomerase in human development and cancer.J.Ceuphysiol 199 7;173:266
, 百拇医药
3 Feng J,Furk WD,Wang SS,et al.The RNA component of human telomerase.S cience 1995;269:1236
4 Collins K,kobayasm R,Greider CW.Purification of testrahymena telomera se and c loning of genes encoding the two protein components of the enzyme.Cell 1995;81: 677
5 Weinrich SL,Pruzan R,Ma LB,et al.Reconstitution of human telomerase w ith the template RNA component hTR and the catlytic protein Subunith TRT.Nat Gen et 199 7;17:498
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6 Hoit SE,Shay JW,Wright WE.Refining the telomere telomerase hypothesis e of aging and cancer.Nat Biotechnol 1996;14:836
7 Ohmura H,Tahara H,Suzu K,et al.Rsetoration of the cellular sensescenc e progra m and repression of telomerase by human chromosome 3.Jpn J Cancer Res 1995;86: 899
8 Savoysky E,Yoshida K,Ohtome T,et al.Down-regulation of telomerase act ivity is an early evtht in the differentiation of HL 60 Cells.Biochem Biophys Res Commu n 1996;226:329
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9 Biessmann H,Mason JM.Telomere muintenance without telomerase.Chromo soma 1997;106:63
10 Reddel RR,Bryan TM,Mumane JP.lmmortalozedcells with no detectable te lomerase.Biochemistry 1997;62:1254
11 Morin GB.The human telomere teminal transferase enzyme is aribonucle orotein that synthesizes TTAGGG repeats.Cell 1989;59:521
12 Kim NW.Piatys zek MA.Prowse KR,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.Science 1994;260:2011
, http://www.100md.com
13 刘佃成，陈宝琦.端粒、端粒酶与膀胱癌的研究进展.国外医学泌尿系统分册1999；19：35
14 Heine b,Hummel M,Muller M,et al.Nonradioactive measurement of telome rase ac tivity in human bladder cancer,bladder washings and in urine.J Pathol 1998;184: 74
15 Lin Y,Miyamoto H,Fujinami K,et al.Telomerase activity in human bladd er cancer.Clin Cancer Res 1996;2:929
16 彭钧铮，张元芳，丁 强等.膀胱癌组织中端粒酶活性研究.中华泌尿外科杂志 1994；18：601
, 百拇医药
17 Yoshida K Sugino T,Tahara H,et al.Telomerase activity in bladder car cinoma a nd its implication for noninvasive diagnosis by detection of exfoliated cancer c ells in urine.Cancer 1997;79:362
18 Kyo S,Kunimi K,Uchibayashi T,et al.Telomerase actitivity in human ur othelial tumors.Am J Clin Pathol 1997;107～555
19 Kamata S,kageyama Y,Yonese J,et al.Significant telomere reduction in h uman superficial transitional cell carcinoma.Br J Urol 1996;78:704
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20 Kavaler E,Landman J,Chang Y,et al.Detecting human bladder carcinoma ce lls in vuided urine samples by assaying for the presence of telomerase activity.Cance r 1998;82:708
21 Kinshita,H Ogawa D,kakehi Y,et al.Detection of telomerase activity in exfoli ated cells in urine from patients with bladder cancer.J Natl Cancer Inst 1997;8 9:724
22 Lee Dh,Yang SC,Hong SJ,et al.Telomerase:A potential marker of bladder trastitonal cell carcinoma in bladder washes.Clin Cancer Res 1998;4:535
23 Ramakumars,Bhuiyan J,Besse JA,et al.Comparison of scieening methods in the detection of bladder cancer.J Urol 1999;161:388, 百拇医药
单位：广西医科大学一附院泌尿外科
关键词：
广西医学990636
端粒是染色体末端的特殊结构，是高度重复的DNA序列，它虽不带基因，但却具有稳定染色体结构和功能的重要作用。端粒酶是催化合成并维持端粒序列稳定的一种核糖核蛋白，也是RNA依赖性的DNA多聚酶(1)。近年来研究发现约90%的人类癌症有端粒酶活性表达而大多数的成熟组织则不表达(2)，这表明端粒酶的活化和上调可能与癌症的演进存在相关性。肿瘤细胞端粒酶活性检测及活性抑制具有潜在的诊治应用前景。
1 端粒酶的结构与功能
端粒酶具有模板功能的RNA组分和催化活性蛋白组分构成。作为依赖RNA的一种特殊聚合物，它属于反转录酶范畴。端粒酶能以自身RNA组分为模板从头合成端粒序列以弥补细胞分裂时染色体末端的缩短，从而稳定端粒的长度。人端粒RNA组分(human telomerase RNA component,hTR)于1995被克隆，其模板区序列与人端粒重复序列(TTAGGG)n互补配对，对合成端粒DNA至关重要(3)。进一步研究发现，拷贝hTR的基因位于人3号染色体长臂远端。相比之下，端粒酶蛋白组分研究步伐较慢。1995年Collins等(4)首次应用联合层析、免疫沉淀及紫外交联等技术，成功地分离、克隆了四膜虫端粒酶蛋白基因，分子量分别为soKDa和95KDa。P95KDa亚单位蛋白能与32P标记的端粒DNA序列引物d(GT2G3)2(GU2G3)特异交联，而P80亚单位蛋白能与32P标记的端粒酶RNA特异结合。此后，端粒酶蛋白组分先后在哺乳动物中得到确认。目前已确认出与回膜虫端粒酶P80蛋白同源的人类TPI/TLPI蛋白。新近报道，人类端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTRT)就是端粒酶蛋白组分。hTRT与逆转录酶同源，类似于与Eap123、Est2p和SPTrtT1端粒酶相关的蛋白。逆转录酶类似种类中Est2p的一个催化结构已被确认，它不是P80蛋白或其同源物。hTRT是有催化活性的端粒酶蛋白组分，正常人体二倍体细胞短暂表达具有端粒酶活性的hTRT表明hTRT是这些细胞恢复端粒酶活性必需的限制性成分(5)。
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2 端粒酶与肿瘤演进的关系
近年来认为在癌症发展中一个潜在的限速阶段是人体正常细胞转化为能无限增殖的永生化细胞。在永生化出现前，至少存在两个不同的细胞内机制的实现。第一步通常是要涉及到两个抑癌基因即P53和PRB失活的途径；而第二步则大都涉及到端粒酶表达的调控机制大部未知。一般认为肿瘤细胞端粒酶再激活机制可能有：染色体突变，3号染色体基因失活，P21、Rb抑癌基因调控(6，7，8)。研究亦表明持续性瘤细胞增殖有赖于端粒酶活性的存在，端粒酶活性表达程度一般随肿瘤演进阶段的上升而增强。但事实上端粒酶与肿瘤的关系并非那么简单。多种真核生物(包括人)中有替代的端粒延伸机制的发现和某些情况下永生化细胞端粒酶活性无表达的事实(9，10)说明肿瘤演进机制是复杂而多元的，端粒酶在其中扮演何种角色待进一步阐明。
3 端粒酶活性表达与膀胱癌相关性研究
1989年Morin等(11)在人Hela细胞中首先检测到了端粒酶活性并创建了测定端粒酶活性的端粒重复序列延伸方法。但因该法需细胞量多且提取物中端粒酶信号较弱，需时长，故限制了其临床推广。1994年Kim等(12)建立了一种基于PCR的高度敏感的端粒酶活性表达测定法-端粒重复片段扩增法(telomeric repeat amplification protocol,TRAP)。此法使得可从少至10个细胞中快速检测到端粒酶活性，从而使端粒酶活性检测在肿瘤包括泌尿系肿瘤得到了广泛开展。
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3.1 膀胱癌组织中端粒酶活性研究
1996年Hoshi等(13)首先报道了膀胱癌组织中端粒酶活性的表达。应用TRAP法对50例膀胱癌病人进行了研究，端粒酶活性表达的总敏感度为90%，其中G1(病理1级)敏感度为50%，G2、G3(病理2级、3级)敏感度为100%。Heine等(14)应用非放射性的TRAP法测定20例膀胱癌标本，亦发现95%的标本表达端粒酶活性。Lin等(15)测定了40例膀胱癌标本的端粒酶活性，结果发现总敏感度97.5%，G1、G2、G3的敏感度分别为20%、62%、100%；Ta～T1期的端粒酶活性敏感度为45.5%，T2～T4期则为100%。故此认为端粒酶活性与膀胱癌肿瘤细胞分级和浸润深度明显相关，可以作为临床诊断和判断预后的指标。国内彭钧铮等(16)研究结果与Lin的基本一致。Yoshida等(17)测定56例膀胱癌标本、17例非恶性膀胱疾病和2例泌尿道发育不全疾病组织标本的端粒酶活性，结果发现膀胱组织标本无阳性表达。但是在泌尿道发育不全组织标本及近乎所有的分化良好的I期膀胱癌中可检测到端粒酶活性，这提示膀胱癌早期阶段即表达出端粒酶活性，这在发现早期初发或复发膀胱肿瘤上也许是一个有用的标记物。
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但也有一些作者认为端粒酶的表达率与肿瘤的分级、分期无关。Kyo等(18)用非放射性的TRAP法测定了22例尿路上皮肿瘤(包括13例膀胱癌)组织的端粒酶活性，结果发现总敏感度为100%。其中9例在标本样品稀释10倍后仍可检出端粒酶活性，这表明这些肿瘤有高活性的端粒酶表达。但出人意料的是，高活性的端粒酶表达与肿瘤的临床病理特征包括临床分期、病理分级、肿瘤多样性和复发状态等无相关意义。Kamata等(19)的研究也得出了类似的结论。
3.2 端粒酶活性检测在膀胱癌早期诊断及其复发监测中的意义
Kavaler等(20)检测了104例膀胱癌病人尿标本脱落细胞端粒酶活性发现总敏感度为85%(88/104)，其中G179%(23/29)、G284%(32/38)、G387.5%(28/32)，5例原位癌均为阳性而健康对照组均为阴性。作为对照，对其中88例病人进行了尿脱落细胞学检查，总检出率为51%(45/88)，其中G113%(3/23)、G244%(14/32)、G382%(23/28)。端粒酶活性总敏感度与脱细胞学总检出率比较，两者差异显著(P<0.001)，而且在低分级细胞学水平(G1和G2)脱落细胞学检出率31%(17/55)与端粒酶活性敏感度82%(55/67)相比两者有显著差异(P<0.001)。Yoshida等(17)检测了26例膀胱癌病人和83例非恶性疾病病人的尿脱落细胞端粒酶活性，结果发现26例膀胱癌中有16例有端粒酶活性表达，敏感度为62%；而83例非恶性病中只有3例良性前列腺增生症患者可测出端粒酶活性，特异度为96.4%。Kinoshita等(21)检测了45例膀胱癌病人尿标本中42例尿标本和43例膀胱冲洗液标本脱落细胞端粒酶活性，发现尿标本敏感度为55%，膀胱冲洗液标本为84%；如把这两组标本合并则可发现端粒酶活性共在40例标本中表达，敏感度为89%(40/45)，而同时作为对照的常规脱落细胞学检查只在19例病人中有阳性发现，检出率为42%(19/45)。Lee等(22)测定了23例膀胱癌病人膀胱冲洗液脱落细胞端粒酶活性，显示总敏感度为95.7%(22/23)作为对照研究的冲洗液脱落细胞学检查总检出率仅为69.6%。而且，在5例细胞学分级为G1的病例冲洗液脱落细胞学的检出率仅为20%，而端粒酶活性则可在80%的标本中检出(P<0.05)。在Ta和T1期膀胱癌病人膀胱冲洗液中可检测出端粒酶活性敏感度为93.3%(14/15)，而同样的病人其膀胱冲洗液脱落细胞检出率只有60%(9/15)。Ramakumar等(23)最近比较了尿细胞学、膀胱肿瘤抗原(BTA)、FDP、NMP22、端粒酶等几项膀胱癌诊断指标的敏感度和特异度。结果发现：在兼顾敏感度和特异度上尿端粒酶是最高的，分别为70%和90%。在细胞分级为1级和非浸润性肿瘤(PTa)尤其是在原位癌病人，尿端粒酶检测在精确度上是最强的指标。总之，目前众多作者认为尿和膀胱冲洗液端粒酶活性检测可能是早期诊断初发和复发膀胱癌的更敏感的指标，尤其在低分级肿瘤，更具实用价值，它可望取代常规的尿或膀胱冲洗液脱落细胞学检查而成为膀胱癌早期诊断和术后复发监测的首选方法。
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4 结语
虽然目前对端粒酶的研究还存在许多未知领域，特别是真核生物(包括人)中发现不依赖端粒酶的端粒延长机制以及端粒序列的变化规律等有待于进一步深入探索，但端粒酶与肿瘤的发生发展密切相关已经得到肯定。通过进一步的实验与临床研究，端粒酶活性检测有望成为早期诊断膀胱癌及复发的敏感指标。
参考文献
1 Holt SE,Wright WE,Shay JW.Multiple pathways for the regutation of tel omerase activity.Eur J Cancer 1997;31:761
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10 Reddel RR,Bryan TM,Mumane JP.lmmortalozedcells with no detectable te lomerase.Biochemistry 1997;62:1254
11 Morin GB.The human telomere teminal transferase enzyme is aribonucle orotein that synthesizes TTAGGG repeats.Cell 1989;59:521
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14 Heine b,Hummel M,Muller M,et al.Nonradioactive measurement of telome rase ac tivity in human bladder cancer,bladder washings and in urine.J Pathol 1998;184: 74
15 Lin Y,Miyamoto H,Fujinami K,et al.Telomerase activity in human bladd er cancer.Clin Cancer Res 1996;2:929
16 彭钧铮，张元芳，丁 强等.膀胱癌组织中端粒酶活性研究.中华泌尿外科杂志 1994；18：601
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17 Yoshida K Sugino T,Tahara H,et al.Telomerase activity in bladder car cinoma a nd its implication for noninvasive diagnosis by detection of exfoliated cancer c ells in urine.Cancer 1997;79:362
18 Kyo S,Kunimi K,Uchibayashi T,et al.Telomerase actitivity in human ur othelial tumors.Am J Clin Pathol 1997;107～555
19 Kamata S,kageyama Y,Yonese J,et al.Significant telomere reduction in h uman superficial transitional cell carcinoma.Br J Urol 1996;78:704
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20 Kavaler E,Landman J,Chang Y,et al.Detecting human bladder carcinoma ce lls in vuided urine samples by assaying for the presence of telomerase activity.Cance r 1998;82:708
21 Kinshita,H Ogawa D,kakehi Y,et al.Detection of telomerase activity in exfoli ated cells in urine from patients with bladder cancer.J Natl Cancer Inst 1997;8 9:724
22 Lee Dh,Yang SC,Hong SJ,et al.Telomerase:A potential marker of bladder trastitonal cell carcinoma in bladder washes.Clin Cancer Res 1998;4:535
23 Ramakumars,Bhuiyan J,Besse JA,et al.Comparison of scieening methods in the detection of bladder cancer.J Urol 1999;161:388, 百拇医药