同型半胱氨酸代谢与神经管畸形的关系
作者：孙延芝 郑冬梅 林新梅 李克深 陈黎明 陈志辉 韩茜 杨雪松
单位：中国人民解放军211医院
关键词：
黑龙江医学990607 1 材料和方法
1.1 材料收集。
黑龙江省内多个市县医院收集到的曾生过NTD患儿的母亲的DNA标本，共27份，正常对照组为曾生过正常孩子的母亲，共24份。
1.2 方法。
1.2.1 DNA的提取：取静脉血3ml，ACD抗凝，利用常规酚/氮仿抽提法提取DNA，DNA浓度用紫外分光光度计测定。
1.2.2 PCR-RLFP分析：PCR扩增用DNA热循环仪，引物序列为：NCO-351：5′-GAA GCA GGG AGC TTT GAG GC-3′，NCO-352:5′-CCC ATG TCG GTG CAT GCC TT-3′。反应体系为30ul，包括10×Buffer3.0ul，2.5mmol 4×dNTP1.5ul,NCO1 2ul,NCO2 2ul,Taq DNA聚合酶0.4ul(5U/L)，H2O 19.1ul，基因组DNA 2ul。反应条件首先是94℃预变性5min，其后的30个循环为94℃ 30 sec,62℃ 20sec,72℃ 60sec,循环结速再72℃延伸5min。扩增后取10ulPCR产物用0.2ulTaq I(10u/L)消化过夜。
, 百拇医药
1.2.3 酶解产物的电泳分离及银染：制备12%(交联度29∶1)非变性聚丙烯酰胺凝胶，100V预电泳30min，取5ul酶解产物1ul 6×上样缓冲液(0.25%溴酚兰，40%蔗糖)混匀后上样，150V恒压电泳3～4h后揭胶。凝胶经过固定(10%乙醇+0.5%乙酸，12min)、染色(0.2%AgNO320min)、显色(1.5%NaOH+0.4%甲醛至清晰)三步处理后即可进行分析。
1.3 统计学处理。
按HALDANE调整法计算相对发病风险RR，分析NTD与可能的风险因子(基因型VV或基因V)的相关性，并进行相应的显著性x2统计检验(DF＝1)。同时用列联表方法分析标记基因V或基因型VV的关联性，对关联的显著性采用YATES校正计算或双侧FISHER确切概率法计算。以曾生过NTD患儿的母亲作为风险人群对未曾生过NTD患儿的母亲的MTHFRC677T的突变频率进行比较分析。采用PPAP软件进行计算。
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2 结果
2.1 MTHFRC677T位点电泳图谱。
MTHFR677位点C被T置换后，可产生一个Taq I限制内切酶的酶切位点，所以PCR产物酶解电泳后，可分出三种基因型：纯合型A677/A677由于序列中无Taq I切点，所以电泳后只出现一条带为134bp：纯合突变型V677/V677可见二条带，分别为75bp，59bp；杂合突变型A677/V677可见三条带，分别为134bp，75bp和59bp。
2.2 MTHFRC677T多态位点分析及统计学处理。
以曾生过NTD患儿的母亲作为风险人群对生过正常儿童的母亲的MTHFRC677T的突变频率进行分析结果(表1)为：正常对照组中VV的基因型的频率为12.5%，而NTD组中VV基因型的频率占33.3%。对VV基因型分析，计算得到VV基因型的母亲比非VV基因型的母亲生出NTD患儿的相对风险提高近3倍(RR＝3.15)，该结果具有提示性显著意义(x2＝2.95，P<0.1)。进一步对V分析，计算得到携带V的母亲比不携带V基因的母亲生出NTD患儿的相对风险提高近5倍(RR＝4.98)，结果有提示性显著意义(x2＝3.42，P<0.1)；用列联表方法作关联性分析，结果也具有提示性显著意义(x2＝2.12，P<0.1)。
, 百拇医药
附表 MTHFR677多态位点基因型及基因频率在正常对照组与NTD组之间的比较 例数
基因型频率
等位基因频率
AA
AV
VV
A
V
生过NTD患儿的母亲
27
1(3.7%)
17(63.0%)
, 百拇医药
9(33.3%)
0.352
0.648
正常对照母亲
24
5(20.8%)
11(66.7%)
3(12.5%)
0.542
0.458
3 讨论
脊柱裂、无脑儿及脑脊膜膨出是一系列由于神经管未闭合引起的新生儿出生缺陷(NTD)。有关NTD的致病因素目前仍不清楚，国内外多数学者认为NTD是遗传因素和环境因素综合作用的结果。最近，国外的研究发现，在怀有NTD患儿的妇女血中轻度高半胱氨酸(Hcy)水平上升的现象，而怀孕期间母体Hcy浓度轻度升高或蛋氨酸浓度轻度降低将会干扰神经管闭合。导致Hcy在血中贮积的关键酶主要有三个：首先是N5-甲基四氢叶酸半胱氨酸甲基转移酶，此酶可催化Hcy甲基化变成蛋氨酸，但是它与NTD的关系未见报道。第二个关键酶是胱硫醚β-合成酶(CBS)，它可催化Hcy与丝氨酸合成胱硫醚以减少Hcy的蓄积。Ramsboottcm等研究了一个严重影响CBS功能的突变G307S在正常群体和NTD群体中的出现频率，结果他发现二者间无任何差别，因此他认为CBS等位基因的功能丧失与NTD无关。第三个关键酶就是N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)，它在半胱氨酸的代谢中有非常重要的地位，它催化N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原成N5-亚甲基四氢叶酸，而后者将甲基转给Hcy使其生成蛋氨酸。MTHFR的缺陷必将导致Hcy向蛋氨酸的转化发生障碍。
, 百拇医药
自从1994年Goyette等成功地将MTHFR基因的cDNA分离出来后，对MTHFR的研究进一步深入。人们发现人群中MTHFR基因内存在一个多态位点，即C677T的改变，由于该突变会造成此酶活性下降及耐热性降低而导致叶酸代谢紊乱，被第一个认为是NTD的遗传因素。Ou等人及Whitehead等人的研究都认为MTHFR基因C677T多态是NTD的一个危险因素。本研究在选择了匹配的对照组，并排除种族，地区的影响的情况下，通过对24个生过正常孩子的母亲和27位生过NTD患儿的母亲的MTHFRC677T突变情况进行了研究，结果发现：母亲的正常对照组中的V/V基因频率为12.5%，而NTD组为33.3%，统计学处理有一定的显著性差异。V/V基因型的母亲比非V/V基因型的母亲生出NTD患儿的相对风险提高近3倍(RR＝3.15)，该结果具有提示性显著意义，反映母亲的该基因突变和NTD的发生有非随机性相关。本研究再次确认同型半胱氨酸代谢的主要酶之一-MTHFRC677T突变可导致高同型半胱氨酸血症，成为NTD出生的一个危险因素。
(收稿日期：1999-01-20), 百拇医药
单位：中国人民解放军211医院
关键词：
黑龙江医学990607 1 材料和方法
1.1 材料收集。
黑龙江省内多个市县医院收集到的曾生过NTD患儿的母亲的DNA标本，共27份，正常对照组为曾生过正常孩子的母亲，共24份。
1.2 方法。
1.2.1 DNA的提取：取静脉血3ml，ACD抗凝，利用常规酚/氮仿抽提法提取DNA，DNA浓度用紫外分光光度计测定。
1.2.2 PCR-RLFP分析：PCR扩增用DNA热循环仪，引物序列为：NCO-351：5′-GAA GCA GGG AGC TTT GAG GC-3′，NCO-352:5′-CCC ATG TCG GTG CAT GCC TT-3′。反应体系为30ul，包括10×Buffer3.0ul，2.5mmol 4×dNTP1.5ul,NCO1 2ul,NCO2 2ul,Taq DNA聚合酶0.4ul(5U/L)，H2O 19.1ul，基因组DNA 2ul。反应条件首先是94℃预变性5min，其后的30个循环为94℃ 30 sec,62℃ 20sec,72℃ 60sec,循环结速再72℃延伸5min。扩增后取10ulPCR产物用0.2ulTaq I(10u/L)消化过夜。
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1.2.3 酶解产物的电泳分离及银染：制备12%(交联度29∶1)非变性聚丙烯酰胺凝胶，100V预电泳30min，取5ul酶解产物1ul 6×上样缓冲液(0.25%溴酚兰，40%蔗糖)混匀后上样，150V恒压电泳3～4h后揭胶。凝胶经过固定(10%乙醇+0.5%乙酸，12min)、染色(0.2%AgNO320min)、显色(1.5%NaOH+0.4%甲醛至清晰)三步处理后即可进行分析。
1.3 统计学处理。
按HALDANE调整法计算相对发病风险RR，分析NTD与可能的风险因子(基因型VV或基因V)的相关性，并进行相应的显著性x2统计检验(DF＝1)。同时用列联表方法分析标记基因V或基因型VV的关联性，对关联的显著性采用YATES校正计算或双侧FISHER确切概率法计算。以曾生过NTD患儿的母亲作为风险人群对未曾生过NTD患儿的母亲的MTHFRC677T的突变频率进行比较分析。采用PPAP软件进行计算。
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2 结果
2.1 MTHFRC677T位点电泳图谱。
MTHFR677位点C被T置换后，可产生一个Taq I限制内切酶的酶切位点，所以PCR产物酶解电泳后，可分出三种基因型：纯合型A677/A677由于序列中无Taq I切点，所以电泳后只出现一条带为134bp：纯合突变型V677/V677可见二条带，分别为75bp，59bp；杂合突变型A677/V677可见三条带，分别为134bp，75bp和59bp。
2.2 MTHFRC677T多态位点分析及统计学处理。
以曾生过NTD患儿的母亲作为风险人群对生过正常儿童的母亲的MTHFRC677T的突变频率进行分析结果(表1)为：正常对照组中VV的基因型的频率为12.5%，而NTD组中VV基因型的频率占33.3%。对VV基因型分析，计算得到VV基因型的母亲比非VV基因型的母亲生出NTD患儿的相对风险提高近3倍(RR＝3.15)，该结果具有提示性显著意义(x2＝2.95，P<0.1)。进一步对V分析，计算得到携带V的母亲比不携带V基因的母亲生出NTD患儿的相对风险提高近5倍(RR＝4.98)，结果有提示性显著意义(x2＝3.42，P<0.1)；用列联表方法作关联性分析，结果也具有提示性显著意义(x2＝2.12，P<0.1)。
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附表 MTHFR677多态位点基因型及基因频率在正常对照组与NTD组之间的比较 例数
基因型频率
等位基因频率
AA
AV
VV
A
V
生过NTD患儿的母亲
27
1(3.7%)
17(63.0%)
, 百拇医药
9(33.3%)
0.352
0.648
正常对照母亲
24
5(20.8%)
11(66.7%)
3(12.5%)
0.542
0.458
3 讨论
脊柱裂、无脑儿及脑脊膜膨出是一系列由于神经管未闭合引起的新生儿出生缺陷(NTD)。有关NTD的致病因素目前仍不清楚，国内外多数学者认为NTD是遗传因素和环境因素综合作用的结果。最近，国外的研究发现，在怀有NTD患儿的妇女血中轻度高半胱氨酸(Hcy)水平上升的现象，而怀孕期间母体Hcy浓度轻度升高或蛋氨酸浓度轻度降低将会干扰神经管闭合。导致Hcy在血中贮积的关键酶主要有三个：首先是N5-甲基四氢叶酸半胱氨酸甲基转移酶，此酶可催化Hcy甲基化变成蛋氨酸，但是它与NTD的关系未见报道。第二个关键酶是胱硫醚β-合成酶(CBS)，它可催化Hcy与丝氨酸合成胱硫醚以减少Hcy的蓄积。Ramsboottcm等研究了一个严重影响CBS功能的突变G307S在正常群体和NTD群体中的出现频率，结果他发现二者间无任何差别，因此他认为CBS等位基因的功能丧失与NTD无关。第三个关键酶就是N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)，它在半胱氨酸的代谢中有非常重要的地位，它催化N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原成N5-亚甲基四氢叶酸，而后者将甲基转给Hcy使其生成蛋氨酸。MTHFR的缺陷必将导致Hcy向蛋氨酸的转化发生障碍。
, 百拇医药
自从1994年Goyette等成功地将MTHFR基因的cDNA分离出来后，对MTHFR的研究进一步深入。人们发现人群中MTHFR基因内存在一个多态位点，即C677T的改变，由于该突变会造成此酶活性下降及耐热性降低而导致叶酸代谢紊乱，被第一个认为是NTD的遗传因素。Ou等人及Whitehead等人的研究都认为MTHFR基因C677T多态是NTD的一个危险因素。本研究在选择了匹配的对照组，并排除种族，地区的影响的情况下，通过对24个生过正常孩子的母亲和27位生过NTD患儿的母亲的MTHFRC677T突变情况进行了研究，结果发现：母亲的正常对照组中的V/V基因频率为12.5%，而NTD组为33.3%，统计学处理有一定的显著性差异。V/V基因型的母亲比非V/V基因型的母亲生出NTD患儿的相对风险提高近3倍(RR＝3.15)，该结果具有提示性显著意义，反映母亲的该基因突变和NTD的发生有非随机性相关。本研究再次确认同型半胱氨酸代谢的主要酶之一-MTHFRC677T突变可导致高同型半胱氨酸血症，成为NTD出生的一个危险因素。
(收稿日期：1999-01-20), 百拇医药