苦瓜蛋白体外抗柯萨奇B3病毒感染①
作者：李双杰 张宝林 邓 晖 王 佐 李湘斌 危当恒
单位：(附属湘雅医院儿科 长沙 410008)
关键词：柯萨奇病毒B；苦瓜蛋白；病毒培养
湖南医科大学学报990628 中国图书分类号 R373.23
柯萨奇病毒B组(Coxsackievirus B group, CoxB)是病 毒性心肌炎常见病原，目前尚无有效的治疗方法，近年来发现苦瓜核糖体失活蛋白(Ribosom e-inactivating protein, RIP)具有明显的抗病毒、抗肿瘤及调节免疫等多种生物活性[1]，有很高的药用价值。笔者从苦瓜果肉中分离纯化苦瓜蛋白，并进行体外抗CoxB 3病毒感染作用的研究，旨在寻找高效抗CoxB3病毒感染作用的药物，现将结果报告如下 。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病毒 CoxB3病毒购于中国预防医学科学院病毒研究所毒种室，HeLa细胞中传代扩增，病毒滴度104 TCID50.ml-1。
1.1.2 苦瓜 本地产新鲜苦瓜(Momordica Charantia L.)
1.1.3 主要纯化材料 Sepharose-CL-4B和Sephadex G-50系Pharmac ia产品，CM50系Whatman产品，无水乙醇及其他试剂均系国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 苦瓜蛋白的纯化 参照Barbieri等方法[2]，将新鲜苦瓜洗净去籽，捣碎压汁，过滤获苦瓜原汁。经无水乙醇分级沉淀、凝胶层析及离子交换层析，收集蛋白峰Ⅱ洗脱液，透析，浓缩冻干，获白色粉末状物。
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1.2.2 苦瓜蛋白对HeLa细胞毒性的测定 将苦瓜蛋白粉用RPMI-1640维持液溶解，浓度为1%，然后对倍稀释至1∶128共8个稀释度。在96孔培养板上，每孔加样本量25μl，另加25μl维持液，再加(3×105)个.ml-1HeLa细胞悬液50μl，每个稀释度3个复孔，并设正常细胞对照，37℃5%CO2培养3d，观察细胞病变孔数，根据Reed-Muench法[3]计算50%毒性剂量(CD50)。
1.2.3 苦瓜蛋白直接灭活CoxB3的作用 将上述8个稀释浓度的苦瓜蛋白液分别与等体积的病毒液混合，37℃作用1h，感染HeLa单层细胞，1.5h后换为维持液，37℃，5%CO2培养。同时设立正常细胞、病毒对照。培养15h后，采用结晶紫染色法[4]，计算抑病毒率。
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50%抑制浓度(EC50)系抑制率为50%时的药物浓度。治疗指数(TI)系评价药物临床应用前景参数，TI=CD50/EC50。
1.2.4 苦瓜蛋白对CoxB3感染的HeLa细胞的保护作用 以100TCID50CoxB3攻击HeLa细胞，1.5h后换成含不同苦瓜蛋白浓度的RPMI-1640维持液，37℃，5%CO2培养。同时设立正常细胞、病毒对照孔。培养15h后，采用结晶紫染色法，计算保护率。
2 结 果
2.1 苦瓜蛋白对HeLa细胞的毒性作用 将1%苦瓜蛋白对倍稀释至1∶8，即<625μg.ml-1，其对HeLa细胞的毒性作用消失，CD50为830μg.ml-1。
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2.2 苦瓜蛋白直接灭活CoxB3的作用 通过结晶紫染色法作为药物效果的初步筛选指标。苦瓜蛋白浓度在200～3.125μg.ml-1均对CoxB3有直接灭活作用。50%抑制浓度为9.35μg.ml-1，治疗指数为88.9。
2.3 苦瓜蛋白对CoxB3感染的Hela细胞的保护作用 如附图所示，苦瓜蛋白对已感染病毒的HeLa细胞有明显的保护作用。随药物浓度增加，保护作用越明显。
附图 苦瓜蛋白浓度对CoxB3感染HeLa细胞的保护作用
Fig. Antiviral activities of Momordica protein agai nst Cox B3 on HeLa monolayered cells
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3 讨 论
柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CV)属于微小病毒科肠道病毒属，可引起人类一系列疾病，如呼吸道感染、非细菌性脑膜炎、心肌炎、类脊髓灰质炎麻痹性疾病、流行性肌痛及糖尿病等。近年来研究发现，约50%病毒性心肌炎系CoxB所致[5]，持续性病毒感染不但可直接损伤心肌细胞，而且可引起免疫反应异常性病理损伤，形成扩张性心肌病，直接影响该病的预后。对病毒性心肌炎治疗的关键是清除心肌细胞内感染的病毒。但目前尚无有效的治疗药物，从中草药中开发研制新型有效的抗病毒药物是一条重要途径。
苦瓜系葫芦科植物，既是人们日常食用的蔬菜，也是一种常用的民间药物。其性味苦寒，具有清暑、解毒、滋养强壮等功效，常用于治疗“消渴、痢疾、赤眼肿痛、痈肿丹毒”等疾病[6]，近年来国内外学者从苦瓜果肉、种仁中分离纯化出多种水溶性蛋白质，并对其生物活性进行研究，发现其具有显著的抗病毒、抗肿瘤及调节免疫等多种作用[1]。Lee-HuangS等[7]从苦瓜子中提取一种分子量为30kD，对HIV有明显抑制作用的蛋白质(Momordica Anti-HI Vprotein of 30 kD,MAP30)，该蛋白质可抑制感染T淋巴细胞、单核细胞HIV-Ⅰ型病毒的DNA复制，而对未感染的正常细胞无毒性，对单纯疱疹病毒(Ⅰ和Ⅱ型)RNA复制亦有明显的抑制作用，对无环鸟苷耐药毒株亦有作用[8]，显示出良好的抗病毒效果。我国学者黄天明等[9]研究苦瓜果肉提取物抗乙型脑炎病毒作用时发现其对感染乙型脑炎病毒的小白鼠有明显的保护作用，平均保护率为66%，体外实验对水泡性口炎病毒亦有明显的抑制作用。本研究采用乙醇分级沉淀、凝胶层析及离子交换层析技术，从苦瓜果肉中提取一类物质，经SDS-PAGE电泳及高效液相色谱分析，初步鉴定其为一种28kD的蛋白质(数据未列出)。该蛋白质不仅具有直接灭活CoxB3病毒的作用，且对已感染的HeLa细胞有明显的保护作用。本组结果还显示，苦瓜蛋白对HeLa细胞毒性低(CD50为830μg.ml-1)，治疗指数高(88.9)，提示苦瓜蛋白是一种良好的高效低毒抗CoxB3感染药物。这一结果为深入研究开发抗CoxB3感染的药物提供了线索。但在体内是否也具有抗病毒作用，值得进一步研究。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 Ng-TB, Chang-WY, Yeung HW. Proteins with abortifacient, ribosome inactivative, immunomodutalory, antitumor, and anti-AIDS activities from cucurbitacea plants. Gen Pharmacol, 1992,23:579～584
2 Barbieri L, Stoppa C, Bolognesi A. Large scale chromatographic purification of ribosome-inactivating proteins. J Chromatog, 1987,408:235～247
3 杜平，范中善，郭葆玉.病毒在细胞上的感染性滴定.见：杜平主编.医用实验病毒学.北京：人民军医出版社，1985：107～109
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4 陈婷婷，陈曙霞，刘晶星，等.苦参总碱有效成份对柯萨奇B3m病毒性感染的HeLa细胞的保护作用.中国实验临床病毒学杂志，1997，9：18～20
5 Grist NR, Reid D. Epidemiology of viral infection of the heart. In: Banatvala JE, ed. Viral infection of the heart. London: Eward Arnold, 1993:23～31
6 江苏新医学院编.中药大辞典.上册，上海：上海科技出版社，1986：1281～1282
7 Lee-Huang S, Huang PL, Nara PL, et al. MAP30: A new inhititor of HIV-Ⅰ infection and replication. FEBS Lett, 1990,272:12～16
8 Bourinbariar AS, Lee-Huang S. The activity of plant-devired antiretroviral protein MAP30 and GAP31 against herpes simplex virus infection in vitro. Bio chem Biophy Res Communs, 1996,219:923～927
9 黄天民，许兆祥，王燕平，等.苦瓜提取物抗病毒作用及其有效成份的研究.病毒学杂志，1990，4：367～372, http://www.100md.com
单位：(附属湘雅医院儿科 长沙 410008)
关键词：柯萨奇病毒B；苦瓜蛋白；病毒培养
湖南医科大学学报990628 中国图书分类号 R373.23
柯萨奇病毒B组(Coxsackievirus B group, CoxB)是病 毒性心肌炎常见病原，目前尚无有效的治疗方法，近年来发现苦瓜核糖体失活蛋白(Ribosom e-inactivating protein, RIP)具有明显的抗病毒、抗肿瘤及调节免疫等多种生物活性[1]，有很高的药用价值。笔者从苦瓜果肉中分离纯化苦瓜蛋白，并进行体外抗CoxB 3病毒感染作用的研究，旨在寻找高效抗CoxB3病毒感染作用的药物，现将结果报告如下 。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病毒 CoxB3病毒购于中国预防医学科学院病毒研究所毒种室，HeLa细胞中传代扩增，病毒滴度104 TCID50.ml-1。
1.1.2 苦瓜 本地产新鲜苦瓜(Momordica Charantia L.)
1.1.3 主要纯化材料 Sepharose-CL-4B和Sephadex G-50系Pharmac ia产品，CM50系Whatman产品，无水乙醇及其他试剂均系国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 苦瓜蛋白的纯化 参照Barbieri等方法[2]，将新鲜苦瓜洗净去籽，捣碎压汁，过滤获苦瓜原汁。经无水乙醇分级沉淀、凝胶层析及离子交换层析，收集蛋白峰Ⅱ洗脱液，透析，浓缩冻干，获白色粉末状物。
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1.2.2 苦瓜蛋白对HeLa细胞毒性的测定 将苦瓜蛋白粉用RPMI-1640维持液溶解，浓度为1%，然后对倍稀释至1∶128共8个稀释度。在96孔培养板上，每孔加样本量25μl，另加25μl维持液，再加(3×105)个.ml-1HeLa细胞悬液50μl，每个稀释度3个复孔，并设正常细胞对照，37℃5%CO2培养3d，观察细胞病变孔数，根据Reed-Muench法[3]计算50%毒性剂量(CD50)。
1.2.3 苦瓜蛋白直接灭活CoxB3的作用 将上述8个稀释浓度的苦瓜蛋白液分别与等体积的病毒液混合，37℃作用1h，感染HeLa单层细胞，1.5h后换为维持液，37℃，5%CO2培养。同时设立正常细胞、病毒对照。培养15h后，采用结晶紫染色法[4]，计算抑病毒率。
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50%抑制浓度(EC50)系抑制率为50%时的药物浓度。治疗指数(TI)系评价药物临床应用前景参数，TI=CD50/EC50。
1.2.4 苦瓜蛋白对CoxB3感染的HeLa细胞的保护作用 以100TCID50CoxB3攻击HeLa细胞，1.5h后换成含不同苦瓜蛋白浓度的RPMI-1640维持液，37℃，5%CO2培养。同时设立正常细胞、病毒对照孔。培养15h后，采用结晶紫染色法，计算保护率。
2 结 果
2.1 苦瓜蛋白对HeLa细胞的毒性作用 将1%苦瓜蛋白对倍稀释至1∶8，即<625μg.ml-1，其对HeLa细胞的毒性作用消失，CD50为830μg.ml-1。
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2.2 苦瓜蛋白直接灭活CoxB3的作用 通过结晶紫染色法作为药物效果的初步筛选指标。苦瓜蛋白浓度在200～3.125μg.ml-1均对CoxB3有直接灭活作用。50%抑制浓度为9.35μg.ml-1，治疗指数为88.9。
2.3 苦瓜蛋白对CoxB3感染的Hela细胞的保护作用 如附图所示，苦瓜蛋白对已感染病毒的HeLa细胞有明显的保护作用。随药物浓度增加，保护作用越明显。
附图 苦瓜蛋白浓度对CoxB3感染HeLa细胞的保护作用
Fig. Antiviral activities of Momordica protein agai nst Cox B3 on HeLa monolayered cells
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3 讨 论
柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CV)属于微小病毒科肠道病毒属，可引起人类一系列疾病，如呼吸道感染、非细菌性脑膜炎、心肌炎、类脊髓灰质炎麻痹性疾病、流行性肌痛及糖尿病等。近年来研究发现，约50%病毒性心肌炎系CoxB所致[5]，持续性病毒感染不但可直接损伤心肌细胞，而且可引起免疫反应异常性病理损伤，形成扩张性心肌病，直接影响该病的预后。对病毒性心肌炎治疗的关键是清除心肌细胞内感染的病毒。但目前尚无有效的治疗药物，从中草药中开发研制新型有效的抗病毒药物是一条重要途径。
苦瓜系葫芦科植物，既是人们日常食用的蔬菜，也是一种常用的民间药物。其性味苦寒，具有清暑、解毒、滋养强壮等功效，常用于治疗“消渴、痢疾、赤眼肿痛、痈肿丹毒”等疾病[6]，近年来国内外学者从苦瓜果肉、种仁中分离纯化出多种水溶性蛋白质，并对其生物活性进行研究，发现其具有显著的抗病毒、抗肿瘤及调节免疫等多种作用[1]。Lee-HuangS等[7]从苦瓜子中提取一种分子量为30kD，对HIV有明显抑制作用的蛋白质(Momordica Anti-HI Vprotein of 30 kD,MAP30)，该蛋白质可抑制感染T淋巴细胞、单核细胞HIV-Ⅰ型病毒的DNA复制，而对未感染的正常细胞无毒性，对单纯疱疹病毒(Ⅰ和Ⅱ型)RNA复制亦有明显的抑制作用，对无环鸟苷耐药毒株亦有作用[8]，显示出良好的抗病毒效果。我国学者黄天明等[9]研究苦瓜果肉提取物抗乙型脑炎病毒作用时发现其对感染乙型脑炎病毒的小白鼠有明显的保护作用，平均保护率为66%，体外实验对水泡性口炎病毒亦有明显的抑制作用。本研究采用乙醇分级沉淀、凝胶层析及离子交换层析技术，从苦瓜果肉中提取一类物质，经SDS-PAGE电泳及高效液相色谱分析，初步鉴定其为一种28kD的蛋白质(数据未列出)。该蛋白质不仅具有直接灭活CoxB3病毒的作用，且对已感染的HeLa细胞有明显的保护作用。本组结果还显示，苦瓜蛋白对HeLa细胞毒性低(CD50为830μg.ml-1)，治疗指数高(88.9)，提示苦瓜蛋白是一种良好的高效低毒抗CoxB3感染药物。这一结果为深入研究开发抗CoxB3感染的药物提供了线索。但在体内是否也具有抗病毒作用，值得进一步研究。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 Ng-TB, Chang-WY, Yeung HW. Proteins with abortifacient, ribosome inactivative, immunomodutalory, antitumor, and anti-AIDS activities from cucurbitacea plants. Gen Pharmacol, 1992,23:579～584
2 Barbieri L, Stoppa C, Bolognesi A. Large scale chromatographic purification of ribosome-inactivating proteins. J Chromatog, 1987,408:235～247
3 杜平，范中善，郭葆玉.病毒在细胞上的感染性滴定.见：杜平主编.医用实验病毒学.北京：人民军医出版社，1985：107～109
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4 陈婷婷，陈曙霞，刘晶星，等.苦参总碱有效成份对柯萨奇B3m病毒性感染的HeLa细胞的保护作用.中国实验临床病毒学杂志，1997，9：18～20
5 Grist NR, Reid D. Epidemiology of viral infection of the heart. In: Banatvala JE, ed. Viral infection of the heart. London: Eward Arnold, 1993:23～31
6 江苏新医学院编.中药大辞典.上册，上海：上海科技出版社，1986：1281～1282
7 Lee-Huang S, Huang PL, Nara PL, et al. MAP30: A new inhititor of HIV-Ⅰ infection and replication. FEBS Lett, 1990,272:12～16
8 Bourinbariar AS, Lee-Huang S. The activity of plant-devired antiretroviral protein MAP30 and GAP31 against herpes simplex virus infection in vitro. Bio chem Biophy Res Communs, 1996,219:923～927
9 黄天民，许兆祥，王燕平，等.苦瓜提取物抗病毒作用及其有效成份的研究.病毒学杂志，1990，4：367～372, http://www.100md.com