Fas抗原在超抗原诱导T细胞凋亡中的作用*
作者：宋建勋** 朱锡华 陈克敏
单位：第三军医大学基础医学部免疫学教研室、全军免疫学研究所 重庆，400038
关键词：Fas抗原；T细胞；细胞凋亡；Ca2+；超抗原
第三军医大学学报990604 提 要 目的：研究Fas抗原介导的死亡效应在超抗原诱导T细胞凋亡中的作用。方法：SEA诱导从人外周血建立的短期SEA反应T细胞系凋亡，1.8%琼脂凝胶DNA电泳观察凋亡的特征条带；FCM检测Fas、FasL的表达量变化，Fura-2/AM荧光指示剂检测胞浆[Ca2+]i的变化。结果：使用FCM特异性检测凋亡亚G0/G1峰大小及1.8%琼脂糖凝胶电泳检测凋亡DNA梯状图谱证明，SEA能诱导短期SEA反应T细胞凋亡，其凋亡的时间与程度与SEA的使用剂量有关。SEA 1 μg/ml建立的短期SEA反应T细胞对SEA 1 μg/ml的再次刺激，凋亡量随作用时间的延长而增多，在作用的第16 h最高，达58%。FCM间接荧光染色法检测发现，Fas及FasL亦随SEA作用时间的延长而表达增多，16 h时表达最多，分别为92%和60%。用Fura-2/AM荧光指示剂检测此时细胞胞浆[Ca2+]i已从刺激前的(290±33)nmol/L上升到(680±16)nmol/L。结论：Fas抗原与SEA诱导的T细胞凋亡密切相关，换言之，Fas抗原在超抗原诱导T细胞凋亡中起作用，而胞浆[Ca2+]i升高与SEA诱导的凋亡T细胞DNA断裂及其它凋亡形态变化有关。
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中图法分类号 R329.25;R392.1
The role of Fas antigen in superantigen-induced apoptosis of T-cells*
Song Jianxun, Zhu Xihua, Chen Kemin (Institute of Immunology, Third Military Medical University, Chongqing,400038)
Abstract Objective: To study the role of Fas antigen-mediated killing effect in the superantigen-induced T-cell apoptosis. Methods: T-cell apoptosis was induced by SEA in the SEA-reactive T-cell line established from human peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The features of apoptosis were observed with optical microscope, flow cytometry (FCM) and DNA electrophoresis. The Fa/FasL ratio and cytosolic Ca2+ concentration were measured with FCM and fluorescent probe Fura-2/AM. Results： A short term SEA reactive T-cell line was established by stimulating PBMC 106 with 1 μg/ml SEA for 3 days and expanding the cells in rIL-2(200 U/ml). The cells were maintained in rIL-2 for 2 weeks before use. Both FCM and DNA electrophoresis could demonstrate that apoptosis appeared obviously by second stimulation of the SEA-reactive T-cells with SEA 1 μg/ml. Fas/FasL was substantially upregulated with an increase of cytosolic free Ca2+. Conclusion: These findings suggest that Fas antigen plays an important role in the superantigen-induced T-cell apoptosis and the increase of cytosolic Ca2+ was related to DNA fragmentation and morphological changes of T-cell apoptosis.
, 百拇医药
Key words Fas antigen; T cell; apoptosis Ca2+; superantigen
许多研究发现，超抗原(Superantigen,SAg)在激活大量特异性T细胞后，可导致激活诱导的细胞死亡(Activation-induced cell death,AICD)，即T细胞凋亡，与SAg诱导的T细胞克隆缺失有关。SAg诱导T细胞凋亡的机制比较复杂，影响因素比较多，如抗原递呈细胞(Antigen-presenting cells, APC)存在与否，细胞因子是否缺乏，T细胞所处的生长时期等等。有研究显示，Fas抗原在SAg诱导的T细胞凋亡中起重要作用[1]；也有相反的观点，认为SAg诱导体内T细胞凋亡与环境中的某些细胞因子有关(如γ-INF，IL-2)，Fas抗原在其中不起作用[2]；也有折中观点，认为Fas抗原在其中起作用，但不是唯一因素[3，4]。但无论如何，Fas抗原作为“死亡分子”在其中的作用正日益受到重视。本研究采用SAg中的金黄色葡萄球菌A型肠毒素(Staphylococcal enterotoxin A, SEA)诱导人外周血中特异性T细胞凋亡，研究Fas抗原在其中的作用，并对此凋亡过程中[Ca2+]i的变化进行了观察。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 SEA(1 mg，军事医科院产品)，白细胞成份血液标本(重庆西南医院输血科，批号971124～1538)。碘化丙啶(PI，Sigma)，非离子去污剂Triton X-100(Sigma)。荧光指示剂Fura-2/AM(BM)。DNA Marker:λDNA/EcoRI+HindⅢ(华美)。酶：蛋白酶K、RNase A(华美)。抗体：鼠抗人Fas mAb DX2、鼠抗人FasL mAb(PharMingen)，异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗鼠IgG(华美)。
1.1.2 细胞培养液 10% NCS的RPMI 1640培养液(Gib-co)，其中含100 U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，10 mmol/L HEPES， 2 mmol/L-Gln。
, 百拇医药
1.1.3 主要仪器 FACStar plus FCM(Becton-Dickinson);MPF-4荧光分光光度计(Hitachi)。
1.2 方法
1.2.1短期人外周血SEA反应T细胞系的建立 参照文献[5]进行。
1.2.2 SEA诱导短期人外周血SEA反应T细胞系凋亡收集 短期人外周血SEA反应T细胞，Hanks溶液洗涤离心，细胞用含10% NCS的RPMI1640完全培养液悬浮，调整密度为5×105/ml，加入24孔平底细胞培养板(Costar)，1 ml/孔，37°C，5% CO2的饱和湿度条件下培养2 h。细胞培养液中加入SEA 1μg/ml，继续培养。
1.2.3 短期人外周血SEA反应T细胞凋亡检测 于培养的不同时间(0、2、4、8、16、24、32 h)收集细胞检测。①用PI低渗荧光染色液染色(PI 50 μg/ml，枸椽酸钠0.1%,Triton X-100 0.1%)，参照文献[6]，FCM检测亚G0/G1峰大小(Ao)，反映已固缩和降解核DNA的细胞数，即凋亡细胞比率。实验2次，取平均值。②常规方法提取细胞DNA[7]，1.8%琼脂糖凝胶电泳，观察凋亡细胞DNA梯状电泳带。
, 百拇医药
1.2.4 SEA反应T细胞凋亡过程中Fas、FasL表达量检测 采用间接免疫荧光染色法。即于培养的不同时间(同上)收集培养细胞(5×105/孔)，用冷染色溶液PBA(PBS+2%BSA+0.1%NaN3)离心洗涤2次后加入第一抗体——鼠抗人Fas mAb或鼠抗人FasL mAb 200μl(1∶50 PBS稀释)，以等量正常小鼠IgG为对照，4°C孵育30 min。冷PBA离心洗涤2次后，加入荧光素标记的第二抗体——羊抗小鼠IgG-FITC 200μl(1∶50 PBA稀释)，4°C避光孵育30 min。冷PBS离心洗涤2次，将细胞重悬于200μl PBS中，混匀，置FACS测试管，上机FCM检测。实验2次，取平均值。
1.2.5 SEA诱导SEA反应T细胞凋亡过程中胞浆游离[Ca2+]i的变化 SEA 1μg/ml诱导SEA反应T细胞(SEA 1μg/ml刺激后建立)凋亡，于0、2、4、8、16、24、32 h，收集细胞，参照文献[7]进行Fura-2/AM负载及[Ca2+]i测定。实验2次，取平均值。
, 百拇医药
2 结果
2.1 SEA诱导人外周血短期SEA反应T细胞凋亡
短期SEA反应T细胞聚集生长，母细胞化现象多见，见图1A，SEA1μg/ml诱导同样剂量刺激建立的短期SEA反应T细胞凋亡非常明显。光镜下，作用8h可观察到部分细胞死亡，见图1B，作用16 h则出现比较明显的凋亡细胞特征，见图1C。FCM分析亚G0-G1峰(A0)显示，随着诱导时间的延长，凋亡量逐步升高，至作用的第16 h，细胞凋亡量可达52%，见图2A。SEA反应T细胞(SEA 1μg/ml使用剂量诱导建立)凋亡量随SEA再次刺激浓度(0.5～6μg/ml)的升高而增加，见图2B。
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图1 SEA诱导SEA反应T细胞凋亡的形态 (LM×100)
A：SEA反应T细胞系 B：SEA 1 μg/ml再次作用8 h C：SEA 1 μg/ml再次作用16 h
Fig 1 Morphology of apoptosis induced by SEA in SEA-reactive T cells (LM×100)
A：SEA-reactive T cell line B: 8 h treated again by SEA 1 μg/ml C:16 h treated again by SEA 1 μg/ml
图2 FCM分析SEA诱导SEA反应T细胞凋亡
, 百拇医药
A：SEA作用剂量与凋亡量的关系 B:SEA 1 μg/ml作用时间与凋亡量的关系
Fig 2 Analysis of apoptosis induced by SEA in SEA-reactive T cells by flow cytometry
A：Dose response of SEA-reactive T cells to addition of SEA for 16 h B：Kinetics of apoptosis induced by SEA 1 μg/ml in SEA-reactive T cells
1.8%琼脂糖凝胶细胞DNA电泳显示，SEA 1μg/ml诱导同样剂量刺激建立的短期SEA反应T细胞于作用的第16 h，DNA电泳成较明显梯形泳带。至作用的第24 h和32 h时，由于死亡细胞增多，DNA梯形渐弱，而近呈模糊的片状条带，见图3。
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图3 DNA琼脂糖凝胶电泳分析SEA诱导SEA反应T细胞凋亡
1. DNA标准(λ DNA/EcoRI+HindⅢ)， 2.0 h， 3.16 h， 4.12 h， 5.8 h
Fig 3 Analysis of apoptosis induced by SEA in SEA-reactive
T cells by DNA electrophoresis with 1.8% agarose gel
1. DNA Marker (λ DNA/EcoRI+HindⅢ)， 2.0 h，3.16 h，4.12 h， 5. 8 h
2.2 SEA反应T细胞凋亡过程中Fas、FasL表达量变化
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短期SEA反应T细胞Fas抗原已有较高表达，荧光密度强度(MFI)已达到近85%，当受SEA再次作用后，Fas抗原表达继续升高，至作用的第16 h时达到最高值92%，见图4A。
FasL在未受到SEA再次作用前，荧光密度强度为8%，以后逐步升高，但速度较慢，至作用的第16 h，达60%，见图4B。
2.3 SEA诱导SEA反应T细胞凋亡与Fas、FasL表达相关
SEA再次作用的第16 h，细胞凋亡量达58%的最高值，此时Fas与FasL表达亦最高，分别为92%、60%，说明Fas、FasL表达与SEA反应T细胞凋亡相关。
, 百拇医药 图4 SEA诱导SEA反应T细胞Fas、FasL表达情况
A：SEA 1 μg/ml诱导SEA反应T细胞Fas表达的动态观察 B：SEA 1 μg/ml诱导SEA反应T细胞FasL表达的动态观察
Fig 4 Functional expression of Fas, FasL induced by SEA in SEA-reactive T cells
A：Kinetics of Fas expression induced by SEA 1 μg/ml in SEA-reactive T cells B：Kinetics of FasL expression induced by SEA 1 μg/ml in SEA-reactive T cells
2.4 SEA诱导SEA反应T细胞凋亡过程中胞浆游离[Ca2+]i的变化
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SEA反应T细胞在SEA 1 μg/ml再次刺激前胞浆游离[Ca2+]i为(290±8)nmol/L，至刺激后8 h和16 h，[Ca2+]i则明显升高，分别达(330±21)nmol/L和(680±16)nmol/L，以后[Ca2+]i又下降，见图5。
图5 SEA(1 μg/ml)诱导SEA反应T细胞凋亡过程中胞浆游离[Ca2+]i的变化
Fig 5 Changes of cytosolic free [Ca2+]i during apoptosis induced by SEA (1 μg/ml) in SEA-reactive T cells
3 讨论
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SAg诱导T细胞凋亡常使机体产生免疫耐受或相关细胞克隆缺失，而对再次刺激出现无反应性，现今虽然对其作用机制的理解尚有分歧，但许多研究显示，Fas抗原可能在SAg诱导T细胞凋亡中起重要作用。体内实验发现，金黄色葡萄球菌B型肠毒素(Staphylococcal enterotoxin B, SEB)10μg注入小鼠体内后，优先激活Vβ8+ T细胞，使之数量迅速增高，随后逐渐降低，最后降至比SAg注入前还低的水平。使用FCM技术检测发现，SEB激活的Vβ8+ T细胞Fas与FasL呈高效表达。可能由于二者结合介导Vβ8+ T细胞凋亡而使Vβ8+ T细胞数量下降所致。而在FasL缺陷的gld小鼠体内，体内注射SEB并未使Vβ8+ T细胞数量明显降低。从正常小鼠外周血分离的CD4+T细胞受到SEB诱导可发生AICD，加入可溶性Fas-IgG融合蛋白则可阻止AICD，细胞数量并不减少，提示Fas/FasL的相互作用导致了SEB诱导的AICD[8，9]。而从Fas抗原缺陷的Lpr小鼠和FasL缺陷的gld小鼠外周血分离的CD4+ T细胞受到SEB同样诱导下，并不发生AICD，细胞处于增殖状态。同样，利用基因敲除技术获得的Fas抗原阴性小鼠，受到内源性SAg作用时，外周血特异性T细胞并不发生克隆缺失，而是持续大量增生，伴随淋巴细胞在肝、肺浸润[10]；SEA和小鼠腺肿瘤病毒(MMTV)编码的内源性超抗原Mtv-7-SAG在诱导外周血T细胞克隆缺失中，Fas系统亦起重要的作用[4，5]。从我们检测SEA诱导短期SEA反应T细胞凋亡过程中Fas与FasL的表达情况看，发生T细胞凋亡的最高点是 Fas与FasL表达的最多之时(SEA作用的第16 h)，此时，T细胞胞浆游离[Ca2+]i亦最高。因此，认为SAg在无APC或相关辅助分子存在情况下，刺激T细胞高效表达Fas、FasL，Fas/FasL相互交联，传导死亡信号入胞内，激活相关酶类，引起胞浆游离[Ca+]i升高，再激活Ca2+依赖的核酸内切酶等，发生T细胞凋亡。
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在有APC存在情况下，APC表面的B7分子与T细胞表面的CD28分子相互作用，提供一个共刺激信号，使SAg作用的特异性T细胞上调Bcl-2或Bcl-XL等基因，反式抑制FasL表达，从而绕过了Fas抗原死亡信号途径，T细胞增殖而不是凋亡[11]。辅助分子抗CD28 mAb可模拟APC表面上的B7分子与T细胞上CD28分子结合，而促使T细胞增殖。高浓度IL-2本身对T细胞就起增殖作用，在体内能诱导SAg作用的特异性T细胞bcl-2基因表达，拮抗Fas抗原介导的T细胞凋亡。这是移植IL-2泵能抑制SAg诱导T细胞凋亡的原因，至于SAg在体内激活大量T细胞之后出现的IL-2缺乏的原因尚不清楚[12]。PMA协助SAg诱导T细胞增殖是通过激活PKC途径而促进IL-2的高效表达来实现的。
因此，SAg在APC存在的情况下，特异性T细胞接受两个信号刺激，起始信号是通过TCR-CD3复合分子，即SAg一端与T细胞表面TCRVβ链结合和(或无)另一端与MHCⅡ类分子的非多态区结合所产生。协同刺激信号来自APC上的B7分子与T细胞上的辅助分子CD28分子相互作用。在这两信号刺激下，特异性T细胞大量增殖。而当无APC和辅助分子存在时，SAg诱导特异性 T细胞高效表达Fas与FasL，二者交联，传导死亡信号入胞内，而引起T细胞凋亡。高浓度IL-2能抑制SAg在无APC及辅助分子存在下所诱导的T细胞凋亡，而促使其增殖，原因是上调T细胞Bcl-2基因表达，抑制了Fas抗原介导的凋亡。
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*全军“九五”重点项目，No.96Z038
**宋建勋，男，31岁，讲师，博士
*This project was supported by the "Ninth five" obligatory budget of PLA,No.96L038
参考文献
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, 百拇医药
2 Cauley L S, Cauley K A, Shub F, et al. Transferable anergy:superantigen treatment induces CD4+ T cell tolerance that is reversible and requires CD4-CD8- cells and interferon gamma. J Exp Med, 1997,186(1):71
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11 Boise L H, Minn A J, Noel P J, et al. CD28 costimulation can promote T cell survival by enhancing expression of Bcl-XL. Immunity,1995,3(1):87
12 Kuroda K, Yagi J, Imanishi K, et al. Implantation of IL-2-containing osmotic pump prolongs the survival of superantingen-reactive T cells expanded in mice injected the bacterial superantigen. J Immunol,1996,157(4):1422
收稿：1998-10-30；修回：1999-01-25, 百拇医药(宋建勋** 朱锡华 陈克敏)
单位：第三军医大学基础医学部免疫学教研室、全军免疫学研究所 重庆，400038
关键词：Fas抗原；T细胞；细胞凋亡；Ca2+；超抗原
第三军医大学学报990604 提 要 目的：研究Fas抗原介导的死亡效应在超抗原诱导T细胞凋亡中的作用。方法：SEA诱导从人外周血建立的短期SEA反应T细胞系凋亡，1.8%琼脂凝胶DNA电泳观察凋亡的特征条带；FCM检测Fas、FasL的表达量变化，Fura-2/AM荧光指示剂检测胞浆[Ca2+]i的变化。结果：使用FCM特异性检测凋亡亚G0/G1峰大小及1.8%琼脂糖凝胶电泳检测凋亡DNA梯状图谱证明，SEA能诱导短期SEA反应T细胞凋亡，其凋亡的时间与程度与SEA的使用剂量有关。SEA 1 μg/ml建立的短期SEA反应T细胞对SEA 1 μg/ml的再次刺激，凋亡量随作用时间的延长而增多，在作用的第16 h最高，达58%。FCM间接荧光染色法检测发现，Fas及FasL亦随SEA作用时间的延长而表达增多，16 h时表达最多，分别为92%和60%。用Fura-2/AM荧光指示剂检测此时细胞胞浆[Ca2+]i已从刺激前的(290±33)nmol/L上升到(680±16)nmol/L。结论：Fas抗原与SEA诱导的T细胞凋亡密切相关，换言之，Fas抗原在超抗原诱导T细胞凋亡中起作用，而胞浆[Ca2+]i升高与SEA诱导的凋亡T细胞DNA断裂及其它凋亡形态变化有关。
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中图法分类号 R329.25;R392.1
The role of Fas antigen in superantigen-induced apoptosis of T-cells*
Song Jianxun, Zhu Xihua, Chen Kemin (Institute of Immunology, Third Military Medical University, Chongqing,400038)
Abstract Objective: To study the role of Fas antigen-mediated killing effect in the superantigen-induced T-cell apoptosis. Methods: T-cell apoptosis was induced by SEA in the SEA-reactive T-cell line established from human peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The features of apoptosis were observed with optical microscope, flow cytometry (FCM) and DNA electrophoresis. The Fa/FasL ratio and cytosolic Ca2+ concentration were measured with FCM and fluorescent probe Fura-2/AM. Results： A short term SEA reactive T-cell line was established by stimulating PBMC 106 with 1 μg/ml SEA for 3 days and expanding the cells in rIL-2(200 U/ml). The cells were maintained in rIL-2 for 2 weeks before use. Both FCM and DNA electrophoresis could demonstrate that apoptosis appeared obviously by second stimulation of the SEA-reactive T-cells with SEA 1 μg/ml. Fas/FasL was substantially upregulated with an increase of cytosolic free Ca2+. Conclusion: These findings suggest that Fas antigen plays an important role in the superantigen-induced T-cell apoptosis and the increase of cytosolic Ca2+ was related to DNA fragmentation and morphological changes of T-cell apoptosis.
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Key words Fas antigen; T cell; apoptosis Ca2+; superantigen
许多研究发现，超抗原(Superantigen,SAg)在激活大量特异性T细胞后，可导致激活诱导的细胞死亡(Activation-induced cell death,AICD)，即T细胞凋亡，与SAg诱导的T细胞克隆缺失有关。SAg诱导T细胞凋亡的机制比较复杂，影响因素比较多，如抗原递呈细胞(Antigen-presenting cells, APC)存在与否，细胞因子是否缺乏，T细胞所处的生长时期等等。有研究显示，Fas抗原在SAg诱导的T细胞凋亡中起重要作用[1]；也有相反的观点，认为SAg诱导体内T细胞凋亡与环境中的某些细胞因子有关(如γ-INF，IL-2)，Fas抗原在其中不起作用[2]；也有折中观点，认为Fas抗原在其中起作用，但不是唯一因素[3，4]。但无论如何，Fas抗原作为“死亡分子”在其中的作用正日益受到重视。本研究采用SAg中的金黄色葡萄球菌A型肠毒素(Staphylococcal enterotoxin A, SEA)诱导人外周血中特异性T细胞凋亡，研究Fas抗原在其中的作用，并对此凋亡过程中[Ca2+]i的变化进行了观察。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 SEA(1 mg，军事医科院产品)，白细胞成份血液标本(重庆西南医院输血科，批号971124～1538)。碘化丙啶(PI，Sigma)，非离子去污剂Triton X-100(Sigma)。荧光指示剂Fura-2/AM(BM)。DNA Marker:λDNA/EcoRI+HindⅢ(华美)。酶：蛋白酶K、RNase A(华美)。抗体：鼠抗人Fas mAb DX2、鼠抗人FasL mAb(PharMingen)，异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗鼠IgG(华美)。
1.1.2 细胞培养液 10% NCS的RPMI 1640培养液(Gib-co)，其中含100 U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，10 mmol/L HEPES， 2 mmol/L-Gln。
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1.1.3 主要仪器 FACStar plus FCM(Becton-Dickinson);MPF-4荧光分光光度计(Hitachi)。
1.2 方法
1.2.1短期人外周血SEA反应T细胞系的建立 参照文献[5]进行。
1.2.2 SEA诱导短期人外周血SEA反应T细胞系凋亡收集 短期人外周血SEA反应T细胞，Hanks溶液洗涤离心，细胞用含10% NCS的RPMI1640完全培养液悬浮，调整密度为5×105/ml，加入24孔平底细胞培养板(Costar)，1 ml/孔，37°C，5% CO2的饱和湿度条件下培养2 h。细胞培养液中加入SEA 1μg/ml，继续培养。
1.2.3 短期人外周血SEA反应T细胞凋亡检测 于培养的不同时间(0、2、4、8、16、24、32 h)收集细胞检测。①用PI低渗荧光染色液染色(PI 50 μg/ml，枸椽酸钠0.1%,Triton X-100 0.1%)，参照文献[6]，FCM检测亚G0/G1峰大小(Ao)，反映已固缩和降解核DNA的细胞数，即凋亡细胞比率。实验2次，取平均值。②常规方法提取细胞DNA[7]，1.8%琼脂糖凝胶电泳，观察凋亡细胞DNA梯状电泳带。
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1.2.4 SEA反应T细胞凋亡过程中Fas、FasL表达量检测 采用间接免疫荧光染色法。即于培养的不同时间(同上)收集培养细胞(5×105/孔)，用冷染色溶液PBA(PBS+2%BSA+0.1%NaN3)离心洗涤2次后加入第一抗体——鼠抗人Fas mAb或鼠抗人FasL mAb 200μl(1∶50 PBS稀释)，以等量正常小鼠IgG为对照，4°C孵育30 min。冷PBA离心洗涤2次后，加入荧光素标记的第二抗体——羊抗小鼠IgG-FITC 200μl(1∶50 PBA稀释)，4°C避光孵育30 min。冷PBS离心洗涤2次，将细胞重悬于200μl PBS中，混匀，置FACS测试管，上机FCM检测。实验2次，取平均值。
1.2.5 SEA诱导SEA反应T细胞凋亡过程中胞浆游离[Ca2+]i的变化 SEA 1μg/ml诱导SEA反应T细胞(SEA 1μg/ml刺激后建立)凋亡，于0、2、4、8、16、24、32 h，收集细胞，参照文献[7]进行Fura-2/AM负载及[Ca2+]i测定。实验2次，取平均值。
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2 结果
2.1 SEA诱导人外周血短期SEA反应T细胞凋亡
短期SEA反应T细胞聚集生长，母细胞化现象多见，见图1A，SEA1μg/ml诱导同样剂量刺激建立的短期SEA反应T细胞凋亡非常明显。光镜下，作用8h可观察到部分细胞死亡，见图1B，作用16 h则出现比较明显的凋亡细胞特征，见图1C。FCM分析亚G0-G1峰(A0)显示，随着诱导时间的延长，凋亡量逐步升高，至作用的第16 h，细胞凋亡量可达52%，见图2A。SEA反应T细胞(SEA 1μg/ml使用剂量诱导建立)凋亡量随SEA再次刺激浓度(0.5～6μg/ml)的升高而增加，见图2B。
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图1 SEA诱导SEA反应T细胞凋亡的形态 (LM×100)
A：SEA反应T细胞系 B：SEA 1 μg/ml再次作用8 h C：SEA 1 μg/ml再次作用16 h
Fig 1 Morphology of apoptosis induced by SEA in SEA-reactive T cells (LM×100)
A：SEA-reactive T cell line B: 8 h treated again by SEA 1 μg/ml C:16 h treated again by SEA 1 μg/ml
图2 FCM分析SEA诱导SEA反应T细胞凋亡
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A：SEA作用剂量与凋亡量的关系 B:SEA 1 μg/ml作用时间与凋亡量的关系
Fig 2 Analysis of apoptosis induced by SEA in SEA-reactive T cells by flow cytometry
A：Dose response of SEA-reactive T cells to addition of SEA for 16 h B：Kinetics of apoptosis induced by SEA 1 μg/ml in SEA-reactive T cells
1.8%琼脂糖凝胶细胞DNA电泳显示，SEA 1μg/ml诱导同样剂量刺激建立的短期SEA反应T细胞于作用的第16 h，DNA电泳成较明显梯形泳带。至作用的第24 h和32 h时，由于死亡细胞增多，DNA梯形渐弱，而近呈模糊的片状条带，见图3。
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图3 DNA琼脂糖凝胶电泳分析SEA诱导SEA反应T细胞凋亡
1. DNA标准(λ DNA/EcoRI+HindⅢ)， 2.0 h， 3.16 h， 4.12 h， 5.8 h
Fig 3 Analysis of apoptosis induced by SEA in SEA-reactive
T cells by DNA electrophoresis with 1.8% agarose gel
1. DNA Marker (λ DNA/EcoRI+HindⅢ)， 2.0 h，3.16 h，4.12 h， 5. 8 h
2.2 SEA反应T细胞凋亡过程中Fas、FasL表达量变化
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短期SEA反应T细胞Fas抗原已有较高表达，荧光密度强度(MFI)已达到近85%，当受SEA再次作用后，Fas抗原表达继续升高，至作用的第16 h时达到最高值92%，见图4A。
FasL在未受到SEA再次作用前，荧光密度强度为8%，以后逐步升高，但速度较慢，至作用的第16 h，达60%，见图4B。
2.3 SEA诱导SEA反应T细胞凋亡与Fas、FasL表达相关
SEA再次作用的第16 h，细胞凋亡量达58%的最高值，此时Fas与FasL表达亦最高，分别为92%、60%，说明Fas、FasL表达与SEA反应T细胞凋亡相关。
, 百拇医药 图4 SEA诱导SEA反应T细胞Fas、FasL表达情况
A：SEA 1 μg/ml诱导SEA反应T细胞Fas表达的动态观察 B：SEA 1 μg/ml诱导SEA反应T细胞FasL表达的动态观察
Fig 4 Functional expression of Fas, FasL induced by SEA in SEA-reactive T cells
A：Kinetics of Fas expression induced by SEA 1 μg/ml in SEA-reactive T cells B：Kinetics of FasL expression induced by SEA 1 μg/ml in SEA-reactive T cells
2.4 SEA诱导SEA反应T细胞凋亡过程中胞浆游离[Ca2+]i的变化
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SEA反应T细胞在SEA 1 μg/ml再次刺激前胞浆游离[Ca2+]i为(290±8)nmol/L，至刺激后8 h和16 h，[Ca2+]i则明显升高，分别达(330±21)nmol/L和(680±16)nmol/L，以后[Ca2+]i又下降，见图5。
图5 SEA(1 μg/ml)诱导SEA反应T细胞凋亡过程中胞浆游离[Ca2+]i的变化
Fig 5 Changes of cytosolic free [Ca2+]i during apoptosis induced by SEA (1 μg/ml) in SEA-reactive T cells
3 讨论
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SAg诱导T细胞凋亡常使机体产生免疫耐受或相关细胞克隆缺失，而对再次刺激出现无反应性，现今虽然对其作用机制的理解尚有分歧，但许多研究显示，Fas抗原可能在SAg诱导T细胞凋亡中起重要作用。体内实验发现，金黄色葡萄球菌B型肠毒素(Staphylococcal enterotoxin B, SEB)10μg注入小鼠体内后，优先激活Vβ8+ T细胞，使之数量迅速增高，随后逐渐降低，最后降至比SAg注入前还低的水平。使用FCM技术检测发现，SEB激活的Vβ8+ T细胞Fas与FasL呈高效表达。可能由于二者结合介导Vβ8+ T细胞凋亡而使Vβ8+ T细胞数量下降所致。而在FasL缺陷的gld小鼠体内，体内注射SEB并未使Vβ8+ T细胞数量明显降低。从正常小鼠外周血分离的CD4+T细胞受到SEB诱导可发生AICD，加入可溶性Fas-IgG融合蛋白则可阻止AICD，细胞数量并不减少，提示Fas/FasL的相互作用导致了SEB诱导的AICD[8，9]。而从Fas抗原缺陷的Lpr小鼠和FasL缺陷的gld小鼠外周血分离的CD4+ T细胞受到SEB同样诱导下，并不发生AICD，细胞处于增殖状态。同样，利用基因敲除技术获得的Fas抗原阴性小鼠，受到内源性SAg作用时，外周血特异性T细胞并不发生克隆缺失，而是持续大量增生，伴随淋巴细胞在肝、肺浸润[10]；SEA和小鼠腺肿瘤病毒(MMTV)编码的内源性超抗原Mtv-7-SAG在诱导外周血T细胞克隆缺失中，Fas系统亦起重要的作用[4，5]。从我们检测SEA诱导短期SEA反应T细胞凋亡过程中Fas与FasL的表达情况看，发生T细胞凋亡的最高点是 Fas与FasL表达的最多之时(SEA作用的第16 h)，此时，T细胞胞浆游离[Ca2+]i亦最高。因此，认为SAg在无APC或相关辅助分子存在情况下，刺激T细胞高效表达Fas、FasL，Fas/FasL相互交联，传导死亡信号入胞内，激活相关酶类，引起胞浆游离[Ca+]i升高，再激活Ca2+依赖的核酸内切酶等，发生T细胞凋亡。
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在有APC存在情况下，APC表面的B7分子与T细胞表面的CD28分子相互作用，提供一个共刺激信号，使SAg作用的特异性T细胞上调Bcl-2或Bcl-XL等基因，反式抑制FasL表达，从而绕过了Fas抗原死亡信号途径，T细胞增殖而不是凋亡[11]。辅助分子抗CD28 mAb可模拟APC表面上的B7分子与T细胞上CD28分子结合，而促使T细胞增殖。高浓度IL-2本身对T细胞就起增殖作用，在体内能诱导SAg作用的特异性T细胞bcl-2基因表达，拮抗Fas抗原介导的T细胞凋亡。这是移植IL-2泵能抑制SAg诱导T细胞凋亡的原因，至于SAg在体内激活大量T细胞之后出现的IL-2缺乏的原因尚不清楚[12]。PMA协助SAg诱导T细胞增殖是通过激活PKC途径而促进IL-2的高效表达来实现的。
因此，SAg在APC存在的情况下，特异性T细胞接受两个信号刺激，起始信号是通过TCR-CD3复合分子，即SAg一端与T细胞表面TCRVβ链结合和(或无)另一端与MHCⅡ类分子的非多态区结合所产生。协同刺激信号来自APC上的B7分子与T细胞上的辅助分子CD28分子相互作用。在这两信号刺激下，特异性T细胞大量增殖。而当无APC和辅助分子存在时，SAg诱导特异性 T细胞高效表达Fas与FasL，二者交联，传导死亡信号入胞内，而引起T细胞凋亡。高浓度IL-2能抑制SAg在无APC及辅助分子存在下所诱导的T细胞凋亡，而促使其增殖，原因是上调T细胞Bcl-2基因表达，抑制了Fas抗原介导的凋亡。
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*全军“九五”重点项目，No.96Z038
**宋建勋，男，31岁，讲师，博士
*This project was supported by the "Ninth five" obligatory budget of PLA,No.96L038
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收稿：1998-10-30；修回：1999-01-25, 百拇医药(宋建勋** 朱锡华 陈克敏)