非感染引起全身炎症反应综合征及全身感染患者单核细胞内毒素耐受性的对比研究
作者：孙东旭 潘家绮 杜斌 陈德昌
单位：100730 中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院加强医疗科
关键词：
中华医学杂志NATIONAL MEDICAL JOURNAL OF CHINA1999年 第6期 1999 近年来，随着对全身感染及多器官功能障碍综合征 (MODS)发病机理研究的不断深入，人们认越来越清楚地认识到对于感染或其它的打击，机体不仅产生过度的炎症反应，同时还伴有免疫功能低下。这可能是临床抗炎措施失败的原因之一[1]。但是，判断创伤或感染引起全身性炎症反应综合征(SIRS)患者是否伴有免疫功能低下及区分SIRS和全身感染是临床经常遇到的难题。本实验通过比较非感染引起的SIRS及全身感染患者单核细胞在体外对于内毒素(LPS)的反应性，探讨单核细胞内毒素耐受现象与免疫功能低下的关系，并通过体外测定单核细胞的反应性以了解机体炎症免疫反应的总体状态。
, 百拇医药
一、对象与方法
1.对象：1998年3月至1998年6月入加强医疗科患者，其中SIRS患者15例，男7例，女8例，年龄48±11岁。全身感染患者17例，男7例，女10例，年龄58±16岁。采用1991年美国胸科医师学会 (ACCP)和危重病学会 (SCCM)联席会制定的标准[2]。SIRS：符合以下两项或两项以上指标，(1)体温>38℃或<36℃，(2)心率>90次/分，(3)呼吸>20次/分或二氧化碳分压(PaCO2)<4.27 kPa，(4)白细胞>12×109/L。全身感染：除了符合SIRS标准外，有明确感染证据。凡伴有免疫缺陷病毒血清学阳性，原发免疫缺陷，接受免疫抑制剂或抑制细胞生长制剂者均予以排除。按以下方法分4组进行观测：SIRS组：急性胰腺炎并发急性肾功能衰竭1例，颅脑外伤术后3例，腹部术后4例，骨关节置换术后合并ARDS 1例，高血压及急性心肌梗死引起心源性休克各1例，双侧甲状腺大部分切除术后2例，脑出血并发应激性溃疡失血性休克1例，肾上腺囊肿切除术后并发失血性休克1例。全身感染组：腹部术后并发腹腔感染7例，胆道感染3例，肺炎4例，病毒性脑炎2例，贲门撕裂并发胸腔感染1例；其中有6例发生感染性休克。对照组和LPS预刺激组，均取自10例健康志愿者外周血单核细胞。
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2.方法：(1)外周血单核细胞的分离和培养：SIRS和全身感染组均在患者进入病房24～48小时采集外周静脉血25 ml， 采用Ficoll-Urografin分离液密度离心分离单个核细胞。用RPMI1640培养基(含10%胎牛血清、1%青霉素、链霉素、25 mmol/L Hepes)培养。调整细胞的浓度为2×106/ml，接种24孔板，5%CO2、37℃培养1小时，洗掉未贴壁细胞继续培养24小时(采用台盼蓝排出试验检测细胞活力>95%,非特异酯酶染色鉴定单核细胞>90%)。按以下处理：对照组、SIRS组与全身感染组单核细胞均用含LPS 1000 ng/ml (0127∶B8, sigma) 的培养基培养4小时；LPS预刺激组，用100 ng/ml LPS预刺激健康人单核细胞24小时，然后换含LPS 1 000 ng/ml的培养基培养4小时[3]。培养液保存用于-80℃以备测定TNF-α及前列腺素E2(PGE2)。(2)检测外周血单核细胞表达HLA-DR抗原： PE标记抗人HLA-DR及异硫氰酸荧光素标记抗人CD14单抗双标单核细胞，用红细胞裂解法流式细胞仪 (Coulter Epics Elite Esp, USA)检测。(3)测定TNF-α及PGE2：采用ELISA法测定TNF-α、EIA法测定PGE2 (美国Cyman)，所有的标本均采用双管法，结果取其平均值。(4)统计学处理：TNF-α、PGE2及HLA-DR结果用均数±标准差表示，多个样本间均数的比较采用方差分析；两组间的病死率采用χ2检验。
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二、结果
1.临床资料：两组性别、ICU住院时间、白细胞计数及体温之间差异无统计学意义(表1)。
表1 全身炎症反应综合征与非炎症性全身 组别
例数
体温(℃)
白细胞计数
(×109/L)
住ICU时间
(天)
死亡
例数
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SIRS组
15
38.2±1.5
13±6
9.0±8.3
1
全身感染组
17
37.6±2.1
13±6
16.3±3.9
7*
注：与SIRS组比较* P<0.05
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2.单核细胞在体外对LPS耐受性：LPS预刺激组，即健康人外周血单核细胞受到小剂量LPS预刺激，当再次受到大剂量LPS攻击TNF-α分泌明显受抑制，反之PGE2分泌明显增加。全身感染组患者单核细胞受到大剂量LPS攻击后分泌TNF-α明显低于SIRS组，并且与LPS预刺激组之间无差异；SIRS组TNF-α明显高于LPS预刺激组，但与对照组无差异。相反，全身感染组PGE2平均为对照组的2.5倍及SIRS组的1.5倍，SIRS组PGE2值也明显高于对照组(约1.5倍)，均有明显的统计学意义(表2)。
表2 外周血单核细胞分泌TNF-α、PGE2及表达HLA-DR水平(
±s) 组别
例数
TNF-α(ng/L)
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PGE2 (ng/L)
HLA-DR(%)
对照组
10
2 586
±790
2 570
±441
96.4
± 1.6
LPS预刺激组
10
, http://www.100md.com
452
±174**△
6 651
±643*
69.8
±10.5*
SIRS组
15
2 289
±434
4 879
±453*
, http://www.100md.com
79.8
±16.2
全身感染组
17
423
±163**△
7 185
±649**△
58.4
±13.6**
注：与对照组比较*P<0.05,** P<0.01；与SIRS组比较△ P<0.05
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3.各组患者外周单核细胞HLA-DR抗原表达：全身感染组和LPS预刺激组表达HLA-DR明显低于对照组，两组之间无差异，其中全身感染组有3例低于30%，4例在30%～50%(表2)。
三、讨论
内源性炎症介质在感染引起的炎症反应中起着重要的作用，其中TNF-α被认为是引起这一病生理变化的重要因子。采用免疫制剂 (如内毒素单抗、TNF-α单抗等)阻断细胞因子的产生或中和循环中的细胞因子可以阻断炎症反应；虽然动物试验结果令人鼓舞，但是临床试验并未提高生存率，有的甚至起有害作用[1]。全身感染及内毒素休克的动物实验结果均来自于单次内毒素攻击模型。在临床上，全身感染患者经常受到多次的炎症打击。据报道，正常人外周血单核细胞预先受到小剂量内毒素刺激可以产生内毒素耐受现象，如果再次以大剂量的内毒素刺激，其反应性明显下降，细胞因子分泌减少；这一现象称为内毒素耐受[4](endotoxin tolerance)。本研究结果表明，健康人外周血单核细胞预先受到内毒素刺激可以产生内毒素耐受，当再次受到大剂量内毒素刺激后，分泌TNF-α明显减少。与LPS预刺激组相同，全身感染组单核细胞在体外受到大剂量内毒素刺激后，分泌TNF-α明显减少。而非感染的SIRS患者单核细胞无此现象。不但革兰阴性菌可以诱发内毒素耐受，葡萄球菌、葡萄球菌糖苷肽等也有同样的作用[5]。推测全身感染患者单核细胞在体内由于多次受到细菌内毒素或其它炎症因子的刺激已经产生了内毒素耐受。
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本实验还表明，内毒素耐受并非为普遍的低反应状态，虽然LPS预刺激组单核细胞再次受到大剂量内毒素刺激后，分泌TNF-α明显受抑制，而分泌PGE2却明显增加。全身感染组和SIRS组患者单核细胞分泌PGE2高于对照组，但以全身感染组更明显。与此相反，LPS预刺激组和全身感染组患者单核细胞表达HLA-DR明显低于对照组，而两组之间却无差异。动物及人体试验研究证实，创伤、烧伤及术后单核细胞表达HLA-DR明显下降，并且持续低表达的患者易于发生感染性并发症，它与预后明显相关[6]。因而，HLA-DR是反应免疫功能状态较敏感的指标。此外，PGE2是强的内源性免疫抑制因子，它可以使Th细胞向Th2表型转化引起IL-10分泌增加[7]，而IL-10又反过来抑制单核细胞表达HLA-DR[8]。从而提示，全身感染患者循环血中单核细胞由于多次受到内毒素等炎症因子的刺激，可能通过过度释放PGE2参与了免疫功能抑制的发生。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Baue AE. Multiple organ failure, multiple organ dysfunction sydrome, and
systemic inflammatory response syndrome. Why no magic bullets ? Arch Surg, 1997,132:703-707.
2 Bone RC, Fein AM, BalK RA, et al. The ACCP/SCCM consensus conference committee:
ACCP/SCCM consensus conference: definitive for sepsis and organ failure and
, http://www.100md.com
guidlines for the use of inovative therapies in sepsis. Chest, 1992, 101:1644-
1655.
3 Wilson CS, Seatter SC, Rodriguez JL, et al. In vivo endotoxin tolerance: impaired
LPS-stimulated TNF release of monocytes from patients with sepsis, but not SIRS.
J Surg Res, 1997, 69:101-106.
4 Li MH, Seatter SC, Manthei R, et al. Macrophage endotoxin tolerance: effect of TNF
, 百拇医药
or endotoxin pretreatment. J Surg Res, 1994, 57:85-92.
5 Mathison JC, Virca GD, Wolfson E, et al. Adaptation to bacterial lipopolysacchride
controls lipopolysacchride-induced tumor necrosis factor production in rabbits
macrophages. J Clin Invest, 1990,85:1108-1118.
6 Kox WJ, Bone RJ, Krausch D, et al. Interferon gamma-1b in the treatment of
, http://www.100md.com
compensatory anti-inflammatory response syndrome. A new approach: proof of
principle. Arch Intern Med, 1997, 157:389-393.
7 Faist E, Schinkel C, Zimmer S. Update on the methanisms of immune suppression of
injury and immune modulation. World J Surg, 1996, 20:454-459.
8 Klava A, Windsor ACJ, Farmery SM, et al. IL-10: A role in the development of
postoperative immunosuppression. Arch Surg, 1997, 132:425-439.
收稿：1998-09-02 修回；1999-03-26, http://www.100md.com
单位：100730 中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院加强医疗科
关键词：
中华医学杂志NATIONAL MEDICAL JOURNAL OF CHINA1999年 第6期 1999 近年来，随着对全身感染及多器官功能障碍综合征 (MODS)发病机理研究的不断深入，人们认越来越清楚地认识到对于感染或其它的打击，机体不仅产生过度的炎症反应，同时还伴有免疫功能低下。这可能是临床抗炎措施失败的原因之一[1]。但是，判断创伤或感染引起全身性炎症反应综合征(SIRS)患者是否伴有免疫功能低下及区分SIRS和全身感染是临床经常遇到的难题。本实验通过比较非感染引起的SIRS及全身感染患者单核细胞在体外对于内毒素(LPS)的反应性，探讨单核细胞内毒素耐受现象与免疫功能低下的关系，并通过体外测定单核细胞的反应性以了解机体炎症免疫反应的总体状态。
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一、对象与方法
1.对象：1998年3月至1998年6月入加强医疗科患者，其中SIRS患者15例，男7例，女8例，年龄48±11岁。全身感染患者17例，男7例，女10例，年龄58±16岁。采用1991年美国胸科医师学会 (ACCP)和危重病学会 (SCCM)联席会制定的标准[2]。SIRS：符合以下两项或两项以上指标，(1)体温>38℃或<36℃，(2)心率>90次/分，(3)呼吸>20次/分或二氧化碳分压(PaCO2)<4.27 kPa，(4)白细胞>12×109/L。全身感染：除了符合SIRS标准外，有明确感染证据。凡伴有免疫缺陷病毒血清学阳性，原发免疫缺陷，接受免疫抑制剂或抑制细胞生长制剂者均予以排除。按以下方法分4组进行观测：SIRS组：急性胰腺炎并发急性肾功能衰竭1例，颅脑外伤术后3例，腹部术后4例，骨关节置换术后合并ARDS 1例，高血压及急性心肌梗死引起心源性休克各1例，双侧甲状腺大部分切除术后2例，脑出血并发应激性溃疡失血性休克1例，肾上腺囊肿切除术后并发失血性休克1例。全身感染组：腹部术后并发腹腔感染7例，胆道感染3例，肺炎4例，病毒性脑炎2例，贲门撕裂并发胸腔感染1例；其中有6例发生感染性休克。对照组和LPS预刺激组，均取自10例健康志愿者外周血单核细胞。
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2.方法：(1)外周血单核细胞的分离和培养：SIRS和全身感染组均在患者进入病房24～48小时采集外周静脉血25 ml， 采用Ficoll-Urografin分离液密度离心分离单个核细胞。用RPMI1640培养基(含10%胎牛血清、1%青霉素、链霉素、25 mmol/L Hepes)培养。调整细胞的浓度为2×106/ml，接种24孔板，5%CO2、37℃培养1小时，洗掉未贴壁细胞继续培养24小时(采用台盼蓝排出试验检测细胞活力>95%,非特异酯酶染色鉴定单核细胞>90%)。按以下处理：对照组、SIRS组与全身感染组单核细胞均用含LPS 1000 ng/ml (0127∶B8, sigma) 的培养基培养4小时；LPS预刺激组，用100 ng/ml LPS预刺激健康人单核细胞24小时，然后换含LPS 1 000 ng/ml的培养基培养4小时[3]。培养液保存用于-80℃以备测定TNF-α及前列腺素E2(PGE2)。(2)检测外周血单核细胞表达HLA-DR抗原： PE标记抗人HLA-DR及异硫氰酸荧光素标记抗人CD14单抗双标单核细胞，用红细胞裂解法流式细胞仪 (Coulter Epics Elite Esp, USA)检测。(3)测定TNF-α及PGE2：采用ELISA法测定TNF-α、EIA法测定PGE2 (美国Cyman)，所有的标本均采用双管法，结果取其平均值。(4)统计学处理：TNF-α、PGE2及HLA-DR结果用均数±标准差表示，多个样本间均数的比较采用方差分析；两组间的病死率采用χ2检验。
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二、结果
1.临床资料：两组性别、ICU住院时间、白细胞计数及体温之间差异无统计学意义(表1)。
表1 全身炎症反应综合征与非炎症性全身 组别
例数
体温(℃)
白细胞计数
(×109/L)
住ICU时间
(天)
死亡
例数
, http://www.100md.com
SIRS组
15
38.2±1.5
13±6
9.0±8.3
1
全身感染组
17
37.6±2.1
13±6
16.3±3.9
7*
注：与SIRS组比较* P<0.05
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2.单核细胞在体外对LPS耐受性：LPS预刺激组，即健康人外周血单核细胞受到小剂量LPS预刺激，当再次受到大剂量LPS攻击TNF-α分泌明显受抑制，反之PGE2分泌明显增加。全身感染组患者单核细胞受到大剂量LPS攻击后分泌TNF-α明显低于SIRS组，并且与LPS预刺激组之间无差异；SIRS组TNF-α明显高于LPS预刺激组，但与对照组无差异。相反，全身感染组PGE2平均为对照组的2.5倍及SIRS组的1.5倍，SIRS组PGE2值也明显高于对照组(约1.5倍)，均有明显的统计学意义(表2)。
表2 外周血单核细胞分泌TNF-α、PGE2及表达HLA-DR水平(
±s) 组别例数
TNF-α(ng/L)
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PGE2 (ng/L)
HLA-DR(%)
对照组
10
2 586
±790
2 570
±441
96.4
± 1.6
LPS预刺激组
10
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452
±174**△
6 651
±643*
69.8
±10.5*
SIRS组
15
2 289
±434
4 879
±453*
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79.8
±16.2
全身感染组
17
423
±163**△
7 185
±649**△
58.4
±13.6**
注：与对照组比较*P<0.05,** P<0.01；与SIRS组比较△ P<0.05
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3.各组患者外周单核细胞HLA-DR抗原表达：全身感染组和LPS预刺激组表达HLA-DR明显低于对照组，两组之间无差异，其中全身感染组有3例低于30%，4例在30%～50%(表2)。
三、讨论
内源性炎症介质在感染引起的炎症反应中起着重要的作用，其中TNF-α被认为是引起这一病生理变化的重要因子。采用免疫制剂 (如内毒素单抗、TNF-α单抗等)阻断细胞因子的产生或中和循环中的细胞因子可以阻断炎症反应；虽然动物试验结果令人鼓舞，但是临床试验并未提高生存率，有的甚至起有害作用[1]。全身感染及内毒素休克的动物实验结果均来自于单次内毒素攻击模型。在临床上，全身感染患者经常受到多次的炎症打击。据报道，正常人外周血单核细胞预先受到小剂量内毒素刺激可以产生内毒素耐受现象，如果再次以大剂量的内毒素刺激，其反应性明显下降，细胞因子分泌减少；这一现象称为内毒素耐受[4](endotoxin tolerance)。本研究结果表明，健康人外周血单核细胞预先受到内毒素刺激可以产生内毒素耐受，当再次受到大剂量内毒素刺激后，分泌TNF-α明显减少。与LPS预刺激组相同，全身感染组单核细胞在体外受到大剂量内毒素刺激后，分泌TNF-α明显减少。而非感染的SIRS患者单核细胞无此现象。不但革兰阴性菌可以诱发内毒素耐受，葡萄球菌、葡萄球菌糖苷肽等也有同样的作用[5]。推测全身感染患者单核细胞在体内由于多次受到细菌内毒素或其它炎症因子的刺激已经产生了内毒素耐受。
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本实验还表明，内毒素耐受并非为普遍的低反应状态，虽然LPS预刺激组单核细胞再次受到大剂量内毒素刺激后，分泌TNF-α明显受抑制，而分泌PGE2却明显增加。全身感染组和SIRS组患者单核细胞分泌PGE2高于对照组，但以全身感染组更明显。与此相反，LPS预刺激组和全身感染组患者单核细胞表达HLA-DR明显低于对照组，而两组之间却无差异。动物及人体试验研究证实，创伤、烧伤及术后单核细胞表达HLA-DR明显下降，并且持续低表达的患者易于发生感染性并发症，它与预后明显相关[6]。因而，HLA-DR是反应免疫功能状态较敏感的指标。此外，PGE2是强的内源性免疫抑制因子，它可以使Th细胞向Th2表型转化引起IL-10分泌增加[7]，而IL-10又反过来抑制单核细胞表达HLA-DR[8]。从而提示，全身感染患者循环血中单核细胞由于多次受到内毒素等炎症因子的刺激，可能通过过度释放PGE2参与了免疫功能抑制的发生。
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参考文献
1 Baue AE. Multiple organ failure, multiple organ dysfunction sydrome, and
systemic inflammatory response syndrome. Why no magic bullets ? Arch Surg, 1997,132:703-707.
2 Bone RC, Fein AM, BalK RA, et al. The ACCP/SCCM consensus conference committee:
ACCP/SCCM consensus conference: definitive for sepsis and organ failure and
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guidlines for the use of inovative therapies in sepsis. Chest, 1992, 101:1644-
1655.
3 Wilson CS, Seatter SC, Rodriguez JL, et al. In vivo endotoxin tolerance: impaired
LPS-stimulated TNF release of monocytes from patients with sepsis, but not SIRS.
J Surg Res, 1997, 69:101-106.
4 Li MH, Seatter SC, Manthei R, et al. Macrophage endotoxin tolerance: effect of TNF
, 百拇医药
or endotoxin pretreatment. J Surg Res, 1994, 57:85-92.
5 Mathison JC, Virca GD, Wolfson E, et al. Adaptation to bacterial lipopolysacchride
controls lipopolysacchride-induced tumor necrosis factor production in rabbits
macrophages. J Clin Invest, 1990,85:1108-1118.
6 Kox WJ, Bone RJ, Krausch D, et al. Interferon gamma-1b in the treatment of
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compensatory anti-inflammatory response syndrome. A new approach: proof of
principle. Arch Intern Med, 1997, 157:389-393.
7 Faist E, Schinkel C, Zimmer S. Update on the methanisms of immune suppression of
injury and immune modulation. World J Surg, 1996, 20:454-459.
8 Klava A, Windsor ACJ, Farmery SM, et al. IL-10: A role in the development of
postoperative immunosuppression. Arch Surg, 1997, 132:425-439.
收稿：1998-09-02 修回；1999-03-26, http://www.100md.com