早发性糖尿病患者HNF-1α基因P291fsinsC突变热点的检测
作者：项坤三 郑泰山 浦鎏 方启晨
单位：200233 上海市第六人民医院内分泌科
关键词：
中华医学杂志NATIONAL MEDICAL JOURNAL OF CHINA1999年 第6期 1999 器官正常发育及正常生理功能有赖于选择性有序地激活基因转录，后者则与细胞内各种转录调节蛋白基因群有序表达有关。转录因子基因突变糖尿病，是糖尿病研究的重要进展之一[1-4] 。其中最多见的是位于染色体12q24.2的肝细胞核因子-1α[HNF-1α又称转录因子1(TCF1)]基因突变糖尿病[1-5] 。位于外显子4的P291fsinsC突变，在糖尿病筛查中反复见到，该突变即脯氨酸密码子291间插入一个碱基C致阅读框架位移，过早出现中止密码，形成中断的HNF-1α蛋白。在不同种群研究中，HNF1α-P291fsinsC突变糖尿病已见于白种人[1，6-10] 。HNF-1α基因中该突变是致糖尿病突变的热点。为此，我们对起病≤40岁的中国人糖尿病患者进行了HNF-1α基因P291fsinsC突变的筛查。
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一、对象与方法
1.对象：164例非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)患者，年龄36±8岁，男91例，女73例。糖尿病诊断按WHO标准。糖尿病确诊年龄32±7(10～40)岁，其中确诊年龄≤25岁者占15.2%(25/164例)，有一级亲属糖尿病家族史者占71.3%(117/164例)，确诊年龄≤25岁、至少两代一级亲属有糖尿病且不用胰岛素者占9.2%(11/120例)。后一种情况提示可能为MODY亚型。
2.HNF-1α基因P291fsinsC突变检测：用PCR扩增HNF-1α基因外显子4后行DNA序列分析。引物为自行设计，上游引物(HNF-1α-F)位于内含子 nt 3116-nt3134(nt序号按文献[7]进行:5′-CAGGACAGGGTTCCTCTGA-3′;下游反义引物(HNF1-α-R)位于内含子4 nt 3540-nt3523:5′-TGTCCCTTGTCCCCACAT-3′。PCR初期变性后行变性94 ℃ 30秒、退火62 ℃ 30秒及延伸72 ℃ 45秒，共35个周期。PCR产物片段为325 bp。经非变性聚丙烯胺凝胶电泳确认后，用低溶点琼脂糖电泳或Wizard DNA纯化系统(美国Promega公司)纯化片段作为测序模板。以γ-32P-ATP(美国Amershan公司)标记引物，与模板各1 pmol行热循环DNA序列分析(美国Amershan公司)。
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二、结果
HNF-1α基因288～292号密码子分别为甘- 脯-脯-脯-甘氨酸(288 289 290 291 292、GGG CCC CCC CCA GGG)密码。P291fsinsC突变时则呈甘- 脯- 脯- 脯- 精氨酸(288 289 290 291 292、GGG CCC CCC CCC AGG)密码，插入的C位于序列中连续8个C之间而呈连续9个C以致阅读框架位移。本组中，亦见1例一个等位基因呈连续9个C者，但 却是288号甘氨酸密码子静止突变杂合子，即甘- 脯- 脯- 脯- 甘(288 289 290 291 292、GGC CCC CCC CCA GGG)。本组164例起病年龄≤40岁的中国人糖尿病患者中，未见HNF-1α基因P291fsinsC突变者，与欧洲人结果比较差异有显著意义，Fisher确切概率检测P=0.0001。
三、讨论
尽管在多个种族及群体糖尿病筛查中见到HNF-1α基因P291fsinsC突变，但在本组中国人糖尿病患者中未见到该突变。文献报道中与本组相似的研究对象，即起病早且可能部分为MODY的糖尿病，在白种人中P291 fsinsC突变检出率显著高于本组及日本人(0%～1.8%)[9,10] ，尤其在英国及德国白种人中可达6.3%～12.0%[7,8] ，表明P291fsinsC虽是突变热点，但仍存在种族异质性。此外，MODY患者中各已知致病基因频率在种群间存在明显差异。例如英国白种人MODY者中约65%为HNF-1α基因突变所致，而法国白种人MODY者中，主要致病基因却是葡萄糖激酶基因，占56%，而HNF-1α基因突变估计仅占25%，日本人MODY者中HNF-1α基因突变占10%左右[5] ，提示本组未检得P291fsinsC突变的另一个可能是，HNF-1α基因突变糖尿病患病率的种族差异。因此，本研究的结论认为，HNF-1α基因P291fsinsC虽然是某些种群糖尿病突变热点，但亦存在种族异质性，该突变不是中国人早发糖尿病的重要致病原因。
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注释：本课题为上海市领先专业重点学科基金资助项目(96-Ⅲ-004)
参考文献
1 Yamagata K, Oda N, Kaisaki PJ, et al. Mutations in the hepatocyte nuclear factor
-1 alpha gene in maturity-onset diabetes of the young.Nature, 1996, 384:455-458.
2 Yamagata K, Furuta H, Oda N, et al. Mutations in the hepatocyte nuclear-4 alpha
gene in maturity-onset diabetes of the young .Nature,1996,384:458-460.
, http://www.100md.com
3 Stoffers DA, Ferrer J,Clarke WL, et al.Early-onsettype-Ⅱ diabetes mellitus
linked to IPF1. Nat Genetics, 1997,17:138-139.
4 Horikawa Y, Iwasaki N, Hara M, et al. Mutation in hepatocyte nuclear factor-1
beta gene (TCF2) associated with MODY. Nat Genetics,1997, 17:384-388.
5 Hattersley AT. Maturity-onset diabetes of the young: clinical heterogeneity
, 百拇医药
explained by genetic heterogeneity. Diabetic Med, 1998,15:15-24.
6 Glucksmann MA, Lehto M, Tayber O, et al. Novel mutations and mutational hotspot
in the MODY3 gene. Diabetes,1997,46:1081-1086.
7 Kaisaki PJ, Menzel S, Lindner T, et al. Mutations in the hepatocyte nuclear
factor-1 alpha gene in MODY and early-onset NIDDM. Evidence for a mutational
, http://www.100md.com
hotspot in exon 4. Diabetes,1997, 46: 528-531.
8 Frayling TM, Bulman MP, Ellard S,et al.Mutations in thehepatocyte nuclear factor
-1 alpha gene are a common cause of maturity-onset diabetes of the young in the
U.K. Diabetes, 1997, 46:720-724.
9 Yamada S, Nishgori H, Onda H, et al.Identification ofmutations in the hepatocyte
, http://www.100md.com nuclear factor (HNF)-1 alpha gene in Japanese subjects with IDDM. Diabetes,1997, 46:1643-1646.
10 Boutin P,Chevre JC,Hani EH,et al. An automated fluorescent single-strand
conformation polymorphism technique for screeningmutations in the hepatocyte
nuclear factor-1α gene (maturity-onset diabetes of the young).
Diabetes,1997,46:2108-2112.
收稿：1998-09-29 修回：1999-02-10, 百拇医药
单位：200233 上海市第六人民医院内分泌科
关键词：
中华医学杂志NATIONAL MEDICAL JOURNAL OF CHINA1999年 第6期 1999 器官正常发育及正常生理功能有赖于选择性有序地激活基因转录，后者则与细胞内各种转录调节蛋白基因群有序表达有关。转录因子基因突变糖尿病，是糖尿病研究的重要进展之一[1-4] 。其中最多见的是位于染色体12q24.2的肝细胞核因子-1α[HNF-1α又称转录因子1(TCF1)]基因突变糖尿病[1-5] 。位于外显子4的P291fsinsC突变，在糖尿病筛查中反复见到，该突变即脯氨酸密码子291间插入一个碱基C致阅读框架位移，过早出现中止密码，形成中断的HNF-1α蛋白。在不同种群研究中，HNF1α-P291fsinsC突变糖尿病已见于白种人[1，6-10] 。HNF-1α基因中该突变是致糖尿病突变的热点。为此，我们对起病≤40岁的中国人糖尿病患者进行了HNF-1α基因P291fsinsC突变的筛查。
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一、对象与方法
1.对象：164例非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)患者，年龄36±8岁，男91例，女73例。糖尿病诊断按WHO标准。糖尿病确诊年龄32±7(10～40)岁，其中确诊年龄≤25岁者占15.2%(25/164例)，有一级亲属糖尿病家族史者占71.3%(117/164例)，确诊年龄≤25岁、至少两代一级亲属有糖尿病且不用胰岛素者占9.2%(11/120例)。后一种情况提示可能为MODY亚型。
2.HNF-1α基因P291fsinsC突变检测：用PCR扩增HNF-1α基因外显子4后行DNA序列分析。引物为自行设计，上游引物(HNF-1α-F)位于内含子 nt 3116-nt3134(nt序号按文献[7]进行:5′-CAGGACAGGGTTCCTCTGA-3′;下游反义引物(HNF1-α-R)位于内含子4 nt 3540-nt3523:5′-TGTCCCTTGTCCCCACAT-3′。PCR初期变性后行变性94 ℃ 30秒、退火62 ℃ 30秒及延伸72 ℃ 45秒，共35个周期。PCR产物片段为325 bp。经非变性聚丙烯胺凝胶电泳确认后，用低溶点琼脂糖电泳或Wizard DNA纯化系统(美国Promega公司)纯化片段作为测序模板。以γ-32P-ATP(美国Amershan公司)标记引物，与模板各1 pmol行热循环DNA序列分析(美国Amershan公司)。
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二、结果
HNF-1α基因288～292号密码子分别为甘- 脯-脯-脯-甘氨酸(288 289 290 291 292、GGG CCC CCC CCA GGG)密码。P291fsinsC突变时则呈甘- 脯- 脯- 脯- 精氨酸(288 289 290 291 292、GGG CCC CCC CCC AGG)密码，插入的C位于序列中连续8个C之间而呈连续9个C以致阅读框架位移。本组中，亦见1例一个等位基因呈连续9个C者，但 却是288号甘氨酸密码子静止突变杂合子，即甘- 脯- 脯- 脯- 甘(288 289 290 291 292、GGC CCC CCC CCA GGG)。本组164例起病年龄≤40岁的中国人糖尿病患者中，未见HNF-1α基因P291fsinsC突变者，与欧洲人结果比较差异有显著意义，Fisher确切概率检测P=0.0001。
三、讨论
尽管在多个种族及群体糖尿病筛查中见到HNF-1α基因P291fsinsC突变，但在本组中国人糖尿病患者中未见到该突变。文献报道中与本组相似的研究对象，即起病早且可能部分为MODY的糖尿病，在白种人中P291 fsinsC突变检出率显著高于本组及日本人(0%～1.8%)[9,10] ，尤其在英国及德国白种人中可达6.3%～12.0%[7,8] ，表明P291fsinsC虽是突变热点，但仍存在种族异质性。此外，MODY患者中各已知致病基因频率在种群间存在明显差异。例如英国白种人MODY者中约65%为HNF-1α基因突变所致，而法国白种人MODY者中，主要致病基因却是葡萄糖激酶基因，占56%，而HNF-1α基因突变估计仅占25%，日本人MODY者中HNF-1α基因突变占10%左右[5] ，提示本组未检得P291fsinsC突变的另一个可能是，HNF-1α基因突变糖尿病患病率的种族差异。因此，本研究的结论认为，HNF-1α基因P291fsinsC虽然是某些种群糖尿病突变热点，但亦存在种族异质性，该突变不是中国人早发糖尿病的重要致病原因。
, http://www.100md.com
注释：本课题为上海市领先专业重点学科基金资助项目(96-Ⅲ-004)
参考文献
1 Yamagata K, Oda N, Kaisaki PJ, et al. Mutations in the hepatocyte nuclear factor
-1 alpha gene in maturity-onset diabetes of the young.Nature, 1996, 384:455-458.
2 Yamagata K, Furuta H, Oda N, et al. Mutations in the hepatocyte nuclear-4 alpha
gene in maturity-onset diabetes of the young .Nature,1996,384:458-460.
, http://www.100md.com
3 Stoffers DA, Ferrer J,Clarke WL, et al.Early-onsettype-Ⅱ diabetes mellitus
linked to IPF1. Nat Genetics, 1997,17:138-139.
4 Horikawa Y, Iwasaki N, Hara M, et al. Mutation in hepatocyte nuclear factor-1
beta gene (TCF2) associated with MODY. Nat Genetics,1997, 17:384-388.
5 Hattersley AT. Maturity-onset diabetes of the young: clinical heterogeneity
, 百拇医药
explained by genetic heterogeneity. Diabetic Med, 1998,15:15-24.
6 Glucksmann MA, Lehto M, Tayber O, et al. Novel mutations and mutational hotspot
in the MODY3 gene. Diabetes,1997,46:1081-1086.
7 Kaisaki PJ, Menzel S, Lindner T, et al. Mutations in the hepatocyte nuclear
factor-1 alpha gene in MODY and early-onset NIDDM. Evidence for a mutational
, http://www.100md.com
hotspot in exon 4. Diabetes,1997, 46: 528-531.
8 Frayling TM, Bulman MP, Ellard S,et al.Mutations in thehepatocyte nuclear factor
-1 alpha gene are a common cause of maturity-onset diabetes of the young in the
U.K. Diabetes, 1997, 46:720-724.
9 Yamada S, Nishgori H, Onda H, et al.Identification ofmutations in the hepatocyte
, http://www.100md.com nuclear factor (HNF)-1 alpha gene in Japanese subjects with IDDM. Diabetes,1997, 46:1643-1646.
10 Boutin P,Chevre JC,Hani EH,et al. An automated fluorescent single-strand
conformation polymorphism technique for screeningmutations in the hepatocyte
nuclear factor-1α gene (maturity-onset diabetes of the young).
Diabetes,1997,46:2108-2112.
收稿：1998-09-29 修回：1999-02-10, 百拇医药