原发性肝癌患者17号和16号染色体等位基因杂合性丢失的研究
作者：邵建永 李晓明 刘宗石 林汉良
单位：510060广州 ,中山医科大学肿瘤医院病理科(邵建永,林汉良);香港中文大学病理解剖及细胞病理学系(李晓明,刘宗石)
关键词：癌 , 肝细胞；染色体；杂合性；基因,抑制,肿瘤
中华医学杂志NATIONAL MEDICAL JOURNAL OF CHINA1999年 第6期 1999
【摘要】 目的 研究肝癌17号和16号染色体特定区域等位基因杂合性丢失(LOH)发生情况，并探讨LOH与肝癌的临床病理和乙型、丙型肝炎病毒感染的关系。方法 用聚合酶链反应、微卫星多态性分析技术检测17号和16号染色体LOH。结果 17号染色体6个位点在至少一个位点发生LOH的有31例(82%)，其中D17S520(17p12-13.3)和TP53(17p13.1)位点LOH频率大于50%;17q所选4个位点中，仅D17S795位点LOH频率大于30%(40%)。16号染色体5个位点在至少一个位点发生LOH的有26例(72%)，所选5个位点LOH率均大于50%，其中以D16S413(16q24)位点LOH率最高(71%)。p53基因的LOH与丙型肝炎病毒感染和肿瘤的大小有关；16号染色体LOH与肝癌的临床病理改变和乙型、丙型肝炎病毒感染无明显关系。结论 17号染色体，尤其是p53基因的LOH与肝癌的发生有关，肝癌在染色体16q24区LOH率高，提示染色体17p和16q24区可能存在多个与肝癌发生、发展相关的肿瘤抑制基因。
, 百拇医药
Loss of heterozygosity on chromosomes 17 and 16 in primary hepatocellular carcinomas
SHAO Jianyong*, LI Xiaoming, LIU Zongshi, et al. *Departmant of Pathology, Cancer Center, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060
【Abstract】 Objective 38 cases of hepatocellular(HCC) carcinomas were studied to detect loss of heterozygosity(LOH) at specific areas on chromosome 17 and 16 , the possible relations were discussed between LOH and HBV/HCV infection and clinic-pathology of HCC.Methods We detected LOH on chromosome 17 and 16 by using PCR based microsatel lite polymorphism analysis. Results 31 of 38(82%) tumors were deleted for at least one locus of 6 loci on chromosome 17. Loci D17S520 (17p12-p13.3) and TP53(17p13.1) occurred more frequent LOH(>50%). But only one locus of the four loci on 17q occurred frequent LOH (40%), the other three loci occurred lower frequent LOH (<30%). 26 (72%) of detected 36 HCC were positive for at least one locus of five loci on chromosome 16, and all 5 loci occurred higher frequent LOH (>50%).The most frequent LOH(71%) occurred at D16S413(16q24). Relations were observed between LOH of p53 gene and HCV infection and tumor size, but no relations between LOH at other locus on chromosome 17 and 16 and HBV/HCV infection and clinical-pathology of HCC. Conclusion LOH on chromosome 17, especially LOH of p53 gene may play a role in the development of HCC. These results indicated that there may be more than one tumor suppressor gene related to the development and progression of HCC on chromosome 17 and 16.
, 百拇医药
【Key words】 Carcinoma, hepatocellular Chromosome Heterozygosity Gene ,suppressor,Tumor
(Natl Med J China, 1999, 79：428-430)
17号染色体等位基因杂合性丢失(loss of heterozygosity, LOH)发生于许多恶性肿瘤包括肠癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌等[1]，肿瘤抑制基因( TSG)p53基因位于染色体17p13.1，17p的LOH可能伴随p53基因的丢失。16号染色体LOH发生在许多恶性肿瘤如横纹肌肉瘤、前列腺癌和乳腺癌中[2-4]，而肝细胞癌(HCC)17号和16号染色体特定区域LOH率高[5,6]。我们对HCC的17号染色体的6个微卫星位点和16号染色体的5个微卫星位点进行PCR微卫星多态性分析，并观察了LOH与HCC的临床病理关系。
, 百拇医药
对象与方法
一、对象
共38例HCC标本, 病人年龄40～79岁，平均63岁，其中男34例，女4例。选取肝癌和癌旁肝组织蜡块，部分病例肿瘤和癌旁肝组织混杂，用显微切割技术分离切取肿瘤和癌旁肝组织。所有病人均作了乙型肝炎病毒(HBV)血清5项检查和丙型肝炎(HCV)血清抗体检测。
二、方法
1.DNA抽提：用聚合酶链反应(PCR) 模板DNA抽提试剂盒(德国宝灵曼公司产品)抽提DNA，抽提方法参照文献[7]，DNA终质量浓度稀释至0.1 g/L。
2.微卫星多态性分析：17号染色体6个微卫星标记引物和16号染色体5个微卫星标记引物购自美国Research Genetic 公司，引物包括TP53(17p13.1)、D17S520(17p12-13)、D17S950(17q)、D17S798(17q)、D17S785(17q12-q24)、MPO(17q21.3-q23)、D16S393(16q24)、D16S413(16q24)、D16S539(16q24)、 D16S2624(16q22.1、23.1)和D16S407(16p13.13)。方法及PCR条件按文献[7,8]加以改进。癌旁组织DNA为多态性杂合子时，出现2个等位基因片段，与癌旁组织对比，癌组织DNA扩增带一条消失或一条带信号减弱(>70%)时定为LOH[9](图1)。
, 百拇医药
上排图由左至右分别为例12、28及29，微卫星位点分别为D16S407、D16S2624及D16S539；下排图由左至右分别为例31、20及20，微卫星位点分别为D17S520、TP53及D17S950；T为肝癌肿瘤组织；N为癌旁肝组织；箭头示肿瘤组织发生LOH，其中一条等位基因电泳带信号较癌旁肝组织减弱(>70%)
图1 微卫星多态性分析示肝癌患者LOH同位素放射自显影结果
3.统计学处理：数据差异显著性检验采用χ2检验。
结 果
一、肝癌在17号染色体6个位点和16号染色体5个位点的LOH(表1)
表1 肝癌病人17号染色体和16号染色体等位基因杂合性丢失(LOH)情况 染色体位点
, 百拇医药
位置
例数
杂合性
丢失
杂合子
无丢失
纯合子
无信息
未扩
增
LOH率
(%)
17号染色体
, 百拇医药
D17S520
17p12-13
38
21
16
1
0
57
TP53
17p13.1
38
14
12
, 百拇医药
12
0
54
D17S950
17q
38
13
19
5
1
41
D17S798
17q12
, 百拇医药
38
7
22
9
0
24
D17S785
17q12-14
38
3
21
14
0
, 百拇医药 13
MPO
17q21-23
38
5
14
19
0
26
16号染色体
D16S407
16p13.13
36
, 百拇医药
14
12
9
1
54
D16S2624
16q21-23
36
15
10
10
1
60
, http://www.100md.com D16S393
16q24
36
12
9
13
2
57
D16S413
16q24
36
17
7
, http://www.100md.com 12
0
71
D16S539
16q24
36
20
11
5
0
65
点发生LOH者31例，占82%。其中D17S520和TP53(17p12-13.3)位点LOH率分别为57%(21/37)和54%(14/26)；D17S950位点LOH发生率为41%(13/32)。17q其它3个位点LOH发生率均低于30%。
, 百拇医药
在16号染色体，38例病人中除2例资料不完整外，其余36例中至少1个位点发生LOH有者26例，占72%。所选5个位点均LOH率高(>50%)，其中16q24区3个位点D16S393、D16S413、D16S539和16q22.1-23.1区的D16S2624位点LOH率分别为57%(12/21)、71%(17/24)、65%(20/31)和60%(15/25)，以D16S413位点LOH率最高(71%)。
二、肝癌17号和16号染色体LOH与临床病理的关系(表2)
表2 肝癌病人临床及病理改变与17号和16号染色体等位基因杂合性丢失(LOH)的关系 临床及
病理情况
例数
等位基因杂合性丢失率(%)
, http://www.100md.com
Chr17
17p
TP53
Chr16
16q
肝炎病毒感染
HBV(+)
36
83
88
56
74
83
, 百拇医药
HCV(+)
17
88
59
64
81
80
HCV(-)
21
76
62
47
65
, 百拇医药
64
HBV/HCV(+)
16
88
69
64
80
80
临床I期
10
90
50
43
, http://www.100md.com 83
50
临床II期
22
79
68
53
70
75
病理I级
11
81
83
57
, 百拇医药
67
50
病理II级
15
80
60
50
77
88
病理III级
12
69
62
, http://www.100md.com 44
64
83
肿瘤大小
<8cm
21
81
68
47
65
80
≥8cm
17
81
, 百拇医药
69
64△
81
64
注：与HCV(-)组比较*P<0.05；与肿瘤体积小于8cm组比较△P<0.05 在17号染色体，38例肝癌病人中至少1个位p53基因LOH与肿瘤的HCV感染、肿瘤大小有关(P<0.05)，与肿瘤临床分期、病理分化无显著相关性。其它位点LOH与肝癌的HBV/HCV感染及临床病理改变无显著相关。
讨 论
一、17号染色体LOH与肝癌的关系
本组资料表明，肝癌在17p上2个位点LOH发生率分别是57%(D17S520)和54%(TP53)；17q上所选的4个位点中，D17S950(17q21.3)位点LOH频率为41%，其余3个位点LOH频率均低于30%(D17S785，D17S798和MPO)，本组肝癌17p染色体LOH率与其它报道基本一致[5,10]，提示17p染色体LOH可能与肝癌的发生有关。p53基因是一个肿瘤抑制基因(TSG)，定位于17p13.1，p53基因的丢失和突变是许多肿瘤如肠癌、肺癌发生的分子基础，p53基因的突变与LOH密切相关，Naoshi等[11]认为p53基因突变可能导致残留的p53等位基因丢失，从而促进肝癌的发生、发展。本组肝癌病人p53基因LOH率为54%(TP53)，与启东地区肝癌p53基因LOH率相近[5]；其它两个位点D17S520(17p13-p12)和D17S950(17q21.3)也发生率高，提示除p53基因，17P上可能另外存在与肝癌发生、发展相关的丢失位点。
, http://www.100md.com
广东地区肝癌p53基因的LOH与肿瘤的病理分化、肿瘤的临床分期无显著相关，17号染色体其它位点的LOH与HBV/HCV感染和肝癌的临床病理改变无关。p53基因LOH与肝癌肿瘤大小和HCV感染有关，体积大于8cm的肿瘤p53基因的LOH率高于体积小于8cm者；HCV(+)或HBV/HCV(+)的肝癌LOH率高于HCV(-)的肝癌。提示，p53基因的LOH与HCV感染和肿瘤的大小有关。
本研究证实在广东地区肝癌发生过程中，肝癌p53基因LOH率高，在p53基因附近的17p13-p12区及17q21.3也同样LOH率高，提示这些位点LOH有可能是继发于p53基因位点的丢失，或者存在多个与肝癌有关的丢失位点。
二、16号染色体LOH与肝癌的关系
16号染色体5个位点中，至少1个位点发生LOH者26例(72%)，16q24区的3个位点D16S393(16q24), D16S413(16q24), D16S539(16q24)和16q22.1-23.1区D16S2 624位点LOH率均高于50%，以D16S413座位最高(70%)。本组肝癌病人16号染色体LOH率高于国外研究结果，Tsuda等[6]报道16号染色体LOH率是52%，LOH的主要区域是HP基因(16q22.1)和CTRB基因(16q22.3-q23.2)。Yeh等[12]用12个微卫星标志检测了42例台湾地区HCC，结果显示70%有16q发生LOH，其共同丢失片段是16q22-23。与上述结果不同的是，广东地区肝癌LOH率高的区域是16q24区。检测中国启东地区肝癌16q发生LOH的区域，发现启东地区90%的肝癌在TAT位点(16q22)[13]。
, 百拇医药
在本研究中我们发现肝癌在染色体16q24区发生高频率LOH，提示在该区域可能存在有与肝癌密切相关的TSG，进一步的工作可在该区选取更多的位点进行LOH分析，以确定LOH的最小区域，为克隆相关的TSG打下基础。
志谢 本研究在香港中文大学病理系肝病分子生物学实验室完成，并受到刘宗石教授指导
参考文献
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13 Fujimoto Y, Hampton LL, Wirth PJ, et al. Alterations of tumor suppressor genes
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收稿：1998-07-15 修回：1999-02-20, http://www.100md.com
单位：510060广州 ,中山医科大学肿瘤医院病理科(邵建永,林汉良);香港中文大学病理解剖及细胞病理学系(李晓明,刘宗石)
关键词：癌 , 肝细胞；染色体；杂合性；基因,抑制,肿瘤
中华医学杂志NATIONAL MEDICAL JOURNAL OF CHINA1999年 第6期 1999
【摘要】 目的 研究肝癌17号和16号染色体特定区域等位基因杂合性丢失(LOH)发生情况，并探讨LOH与肝癌的临床病理和乙型、丙型肝炎病毒感染的关系。方法 用聚合酶链反应、微卫星多态性分析技术检测17号和16号染色体LOH。结果 17号染色体6个位点在至少一个位点发生LOH的有31例(82%)，其中D17S520(17p12-13.3)和TP53(17p13.1)位点LOH频率大于50%;17q所选4个位点中，仅D17S795位点LOH频率大于30%(40%)。16号染色体5个位点在至少一个位点发生LOH的有26例(72%)，所选5个位点LOH率均大于50%，其中以D16S413(16q24)位点LOH率最高(71%)。p53基因的LOH与丙型肝炎病毒感染和肿瘤的大小有关；16号染色体LOH与肝癌的临床病理改变和乙型、丙型肝炎病毒感染无明显关系。结论 17号染色体，尤其是p53基因的LOH与肝癌的发生有关，肝癌在染色体16q24区LOH率高，提示染色体17p和16q24区可能存在多个与肝癌发生、发展相关的肿瘤抑制基因。
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Loss of heterozygosity on chromosomes 17 and 16 in primary hepatocellular carcinomas
SHAO Jianyong*, LI Xiaoming, LIU Zongshi, et al. *Departmant of Pathology, Cancer Center, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060
【Abstract】 Objective 38 cases of hepatocellular(HCC) carcinomas were studied to detect loss of heterozygosity(LOH) at specific areas on chromosome 17 and 16 , the possible relations were discussed between LOH and HBV/HCV infection and clinic-pathology of HCC.Methods We detected LOH on chromosome 17 and 16 by using PCR based microsatel lite polymorphism analysis. Results 31 of 38(82%) tumors were deleted for at least one locus of 6 loci on chromosome 17. Loci D17S520 (17p12-p13.3) and TP53(17p13.1) occurred more frequent LOH(>50%). But only one locus of the four loci on 17q occurred frequent LOH (40%), the other three loci occurred lower frequent LOH (<30%). 26 (72%) of detected 36 HCC were positive for at least one locus of five loci on chromosome 16, and all 5 loci occurred higher frequent LOH (>50%).The most frequent LOH(71%) occurred at D16S413(16q24). Relations were observed between LOH of p53 gene and HCV infection and tumor size, but no relations between LOH at other locus on chromosome 17 and 16 and HBV/HCV infection and clinical-pathology of HCC. Conclusion LOH on chromosome 17, especially LOH of p53 gene may play a role in the development of HCC. These results indicated that there may be more than one tumor suppressor gene related to the development and progression of HCC on chromosome 17 and 16.
, 百拇医药
【Key words】 Carcinoma, hepatocellular Chromosome Heterozygosity Gene ,suppressor,Tumor
(Natl Med J China, 1999, 79：428-430)
17号染色体等位基因杂合性丢失(loss of heterozygosity, LOH)发生于许多恶性肿瘤包括肠癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌等[1]，肿瘤抑制基因( TSG)p53基因位于染色体17p13.1，17p的LOH可能伴随p53基因的丢失。16号染色体LOH发生在许多恶性肿瘤如横纹肌肉瘤、前列腺癌和乳腺癌中[2-4]，而肝细胞癌(HCC)17号和16号染色体特定区域LOH率高[5,6]。我们对HCC的17号染色体的6个微卫星位点和16号染色体的5个微卫星位点进行PCR微卫星多态性分析，并观察了LOH与HCC的临床病理关系。
, 百拇医药
对象与方法
一、对象
共38例HCC标本, 病人年龄40～79岁，平均63岁，其中男34例，女4例。选取肝癌和癌旁肝组织蜡块，部分病例肿瘤和癌旁肝组织混杂，用显微切割技术分离切取肿瘤和癌旁肝组织。所有病人均作了乙型肝炎病毒(HBV)血清5项检查和丙型肝炎(HCV)血清抗体检测。
二、方法
1.DNA抽提：用聚合酶链反应(PCR) 模板DNA抽提试剂盒(德国宝灵曼公司产品)抽提DNA，抽提方法参照文献[7]，DNA终质量浓度稀释至0.1 g/L。
2.微卫星多态性分析：17号染色体6个微卫星标记引物和16号染色体5个微卫星标记引物购自美国Research Genetic 公司，引物包括TP53(17p13.1)、D17S520(17p12-13)、D17S950(17q)、D17S798(17q)、D17S785(17q12-q24)、MPO(17q21.3-q23)、D16S393(16q24)、D16S413(16q24)、D16S539(16q24)、 D16S2624(16q22.1、23.1)和D16S407(16p13.13)。方法及PCR条件按文献[7,8]加以改进。癌旁组织DNA为多态性杂合子时，出现2个等位基因片段，与癌旁组织对比，癌组织DNA扩增带一条消失或一条带信号减弱(>70%)时定为LOH[9](图1)。
, 百拇医药
上排图由左至右分别为例12、28及29，微卫星位点分别为D16S407、D16S2624及D16S539；下排图由左至右分别为例31、20及20，微卫星位点分别为D17S520、TP53及D17S950；T为肝癌肿瘤组织；N为癌旁肝组织；箭头示肿瘤组织发生LOH，其中一条等位基因电泳带信号较癌旁肝组织减弱(>70%)
图1 微卫星多态性分析示肝癌患者LOH同位素放射自显影结果
3.统计学处理：数据差异显著性检验采用χ2检验。
结 果
一、肝癌在17号染色体6个位点和16号染色体5个位点的LOH(表1)
表1 肝癌病人17号染色体和16号染色体等位基因杂合性丢失(LOH)情况 染色体位点
, 百拇医药
位置
例数
杂合性
丢失
杂合子
无丢失
纯合子
无信息
未扩
增
LOH率
(%)
17号染色体
, 百拇医药
D17S520
17p12-13
38
21
16
1
0
57
TP53
17p13.1
38
14
12
, 百拇医药
12
0
54
D17S950
17q
38
13
19
5
1
41
D17S798
17q12
, 百拇医药
38
7
22
9
0
24
D17S785
17q12-14
38
3
21
14
0
, 百拇医药 13
MPO
17q21-23
38
5
14
19
0
26
16号染色体
D16S407
16p13.13
36
, 百拇医药
14
12
9
1
54
D16S2624
16q21-23
36
15
10
10
1
60
, http://www.100md.com D16S393
16q24
36
12
9
13
2
57
D16S413
16q24
36
17
7
, http://www.100md.com 12
0
71
D16S539
16q24
36
20
11
5
0
65
点发生LOH者31例，占82%。其中D17S520和TP53(17p12-13.3)位点LOH率分别为57%(21/37)和54%(14/26)；D17S950位点LOH发生率为41%(13/32)。17q其它3个位点LOH发生率均低于30%。
, 百拇医药
在16号染色体，38例病人中除2例资料不完整外，其余36例中至少1个位点发生LOH有者26例，占72%。所选5个位点均LOH率高(>50%)，其中16q24区3个位点D16S393、D16S413、D16S539和16q22.1-23.1区的D16S2624位点LOH率分别为57%(12/21)、71%(17/24)、65%(20/31)和60%(15/25)，以D16S413位点LOH率最高(71%)。
二、肝癌17号和16号染色体LOH与临床病理的关系(表2)
表2 肝癌病人临床及病理改变与17号和16号染色体等位基因杂合性丢失(LOH)的关系 临床及
病理情况
例数
等位基因杂合性丢失率(%)
, http://www.100md.com
Chr17
17p
TP53
Chr16
16q
肝炎病毒感染
HBV(+)
36
83
88
56
74
83
, 百拇医药
HCV(+)
17
88
59
64
81
80
HCV(-)
21
76
62
47
65
, 百拇医药
64
HBV/HCV(+)
16
88
69
64
80
80
临床I期
10
90
50
43
, http://www.100md.com 83
50
临床II期
22
79
68
53
70
75
病理I级
11
81
83
57
, 百拇医药
67
50
病理II级
15
80
60
50
77
88
病理III级
12
69
62
, http://www.100md.com 44
64
83
肿瘤大小
<8cm
21
81
68
47
65
80
≥8cm
17
81
, 百拇医药
69
64△
81
64
注：与HCV(-)组比较*P<0.05；与肿瘤体积小于8cm组比较△P<0.05 在17号染色体，38例肝癌病人中至少1个位p53基因LOH与肿瘤的HCV感染、肿瘤大小有关(P<0.05)，与肿瘤临床分期、病理分化无显著相关性。其它位点LOH与肝癌的HBV/HCV感染及临床病理改变无显著相关。
讨 论
一、17号染色体LOH与肝癌的关系
本组资料表明，肝癌在17p上2个位点LOH发生率分别是57%(D17S520)和54%(TP53)；17q上所选的4个位点中，D17S950(17q21.3)位点LOH频率为41%，其余3个位点LOH频率均低于30%(D17S785，D17S798和MPO)，本组肝癌17p染色体LOH率与其它报道基本一致[5,10]，提示17p染色体LOH可能与肝癌的发生有关。p53基因是一个肿瘤抑制基因(TSG)，定位于17p13.1，p53基因的丢失和突变是许多肿瘤如肠癌、肺癌发生的分子基础，p53基因的突变与LOH密切相关，Naoshi等[11]认为p53基因突变可能导致残留的p53等位基因丢失，从而促进肝癌的发生、发展。本组肝癌病人p53基因LOH率为54%(TP53)，与启东地区肝癌p53基因LOH率相近[5]；其它两个位点D17S520(17p13-p12)和D17S950(17q21.3)也发生率高，提示除p53基因，17P上可能另外存在与肝癌发生、发展相关的丢失位点。
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广东地区肝癌p53基因的LOH与肿瘤的病理分化、肿瘤的临床分期无显著相关，17号染色体其它位点的LOH与HBV/HCV感染和肝癌的临床病理改变无关。p53基因LOH与肝癌肿瘤大小和HCV感染有关，体积大于8cm的肿瘤p53基因的LOH率高于体积小于8cm者；HCV(+)或HBV/HCV(+)的肝癌LOH率高于HCV(-)的肝癌。提示，p53基因的LOH与HCV感染和肿瘤的大小有关。
本研究证实在广东地区肝癌发生过程中，肝癌p53基因LOH率高，在p53基因附近的17p13-p12区及17q21.3也同样LOH率高，提示这些位点LOH有可能是继发于p53基因位点的丢失，或者存在多个与肝癌有关的丢失位点。
二、16号染色体LOH与肝癌的关系
16号染色体5个位点中，至少1个位点发生LOH者26例(72%)，16q24区的3个位点D16S393(16q24), D16S413(16q24), D16S539(16q24)和16q22.1-23.1区D16S2 624位点LOH率均高于50%，以D16S413座位最高(70%)。本组肝癌病人16号染色体LOH率高于国外研究结果，Tsuda等[6]报道16号染色体LOH率是52%，LOH的主要区域是HP基因(16q22.1)和CTRB基因(16q22.3-q23.2)。Yeh等[12]用12个微卫星标志检测了42例台湾地区HCC，结果显示70%有16q发生LOH，其共同丢失片段是16q22-23。与上述结果不同的是，广东地区肝癌LOH率高的区域是16q24区。检测中国启东地区肝癌16q发生LOH的区域，发现启东地区90%的肝癌在TAT位点(16q22)[13]。
, 百拇医药
在本研究中我们发现肝癌在染色体16q24区发生高频率LOH，提示在该区域可能存在有与肝癌密切相关的TSG，进一步的工作可在该区选取更多的位点进行LOH分析，以确定LOH的最小区域，为克隆相关的TSG打下基础。
志谢 本研究在香港中文大学病理系肝病分子生物学实验室完成，并受到刘宗石教授指导
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收稿：1998-07-15 修回：1999-02-20, http://www.100md.com