中国人Peutz-Jeghers综合征STK11基因突变的研究
作者：李宜雄 吕新生 夏家辉 汤熙翔 刘春宇 施小六
单位：
关键词：Peutz-Jeghers综合征；STK11基因；聚合酶链反应；基因转变
中华医学杂志NATIONAL MEDICAL JOURNAL OF CHINA1999年 第6期 1999
【摘要】 目的 对中国人Peutz-Jeghers(PJ)综合征患者STK11基因进行突变分析，确定其特征，为基因诊断奠定基础。方法 应用聚合酶链反应-单链构象多肽分析(PCR-SSCP)和DNA测序的方法，对8个中国人PJS家系STK11基因进行研究。结果 在两个家系中分别新发现一个终止突变和剪接位点突变，推测最终导致产生截短型蛋白。结论 STK11基因在中国人PJS患者中可能以点突变为主，突变发生率较国外报道低。提示，PJS可能有遗传异质性。
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STK11 Gene Mutation in Chinese with PJS
LI Yixiong, LU Xinsheng, XIA Jiahui, et al. *Affiliated Xiangya Hospital, National Laboratory of Medical Genetics, Hunan Medical University. Changsha 410078，China
【Abstract】 Objectives To understand the mutation characteristic of STK11 gene in Chinese with Peutz-Jeghers syndrome and establish the gene diagnosis of PJS. Methods STK11 gene was analysed by PCR-SSCP and DNA sequencing in 8 Chinese pedigrees with PJS. Results Two novel point mutations of STK11 gene were detected in two pedigrees: one was nonsense in exon1, and another mutation occurred in splice spot in the donor site of intron 1. It was estimated that these mutations would lead to produce truncated protein. Conclusion Point mutation in STK11 may be chief in Chinese with PJS and the frequency of mutation was fewer than that in previous reports. It suggested that there may be genetic heterogeneity in PJS.
, 百拇医药
【Key words】 Peutz-Jeghers syndrome STK11 gene PCR Gene Conversion
(Natl Med J China, 1999, 79：425-427)
Peutz-Jeghers sysdrome (PJS)是一种常染色体显性遗传性疾病，发病率为1/25 000。PJS是一种肿瘤易感综合征，患者常伴发消化系肿瘤和生殖腺肿瘤，如：胃癌、肠癌、胰腺癌以及卵巢癌和睾丸肿瘤等，约48%的受累者在57岁后死于肿瘤[1]。最近，Jennd DE等[2]和Hemminki A等[3]人在距D19S886 190 kb的近端克隆了PJS致病基因STK11。为了研究STK11基因在中国人PJS中的突变情况，为以后的基因诊断和基因治疗奠定基础，我们收集了8个中国人PJS家系，采用聚合酶链反应-单链构象多肽分析(PCR-SSCP)和DNA测序的方法，对STK11基因的突变形式和位点进行了初步研究，报道如下。
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资料和方法
一、资料
1.病例选择及样品采集：同时具备下列两条者作为诊断PJS的标准：(1)口周唇和(或)颊粘膜以及指(趾)部咖啡色素斑块(点)；(2)肠道多发性息肉，经手术或肠镜证实，病理检查为错构性息肉或腺瘤性息肉。通过湖南医科大学附属湘雅医院、附属第二医院普外科，在住院或门诊病例中，采集到符合上述诊断标准的8个PJS家系，共56个成员，其中18人为患者。抽取患者、家系内同代未患病者之一或双亲的外周静脉血、肝素抗凝，4℃保存，12小时内提取DNA。
二、方法
1.DNA的制备：按医学遗传学国家重点实验室外周血DNA提取方法制备。DNA溶于四氰基乙烯(TE)中，取适量经紫外光度计进行定量和纯度检测，其余于-70℃保存备用。
2.引物设计与合成：STK11基因有9个外显子，第一号外显子基因片段较大，设计了3对引物，其余外显子分别设计一对引物，共11对引物(见表1)。所有引物均在医学遗传学国家重点实验室Beckman Oligol 1 000 mol/L DNA合成仪上合成。
, 百拇医药
表1 STK11基因PCR-SSCP分析引物序列 扩增片段
位 置
引物代号
序 列
大小(bp)
退火温度(℃)
exon 1a
339～ 628
1aU
tgg cgg cgg gac tcc agg ac
171
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64
1aL
cga tga gct tgg ccc gct tg
1bU
cac cgc atc gac tcc acc ga
163
64
1bL
ctt ctt gag gat ctt gac ggc
1cU
gag gtg ctg gac tcg gag ac
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154
64
1cL
acc atc agc acc gtg act gg
2b
457～ 540
2U
ata cac ccc tgt cct ctc tg
142
62
2L
agg ccc cgc ggt ccc aac
, 百拇医药
3b
1 364～1 453
3U
ctg agc tgt gtg tcc tta gcg
195
63
3L
gtg tgg cct cac gga aag gag
4b
2 413～2 545
4U
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cag gac tgg tgt gtg ctg c
229
63
4L
cgg tgc cgt gca gcc ctc
5b
2 621～2 757
5U
gag ggc tgc acg gca ccg c
203
64
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5L
gag tgt gcg tgt ggt gag tg
6b
3 253～3 380
6U
gcc ttt ctt ccc tct cct cg
182
64
6L
tgc ggg cag agg gat gag gc
7b
, 百拇医药
3 989～4 046
7U
aca ggc tcc tcg ccg gct tc
163
64
7L
cta gcg ccc gct caa ccag
8b
5 025～5 212
8U
ggc gcc act gct tct ggg c
, 百拇医药
255
64
8L
cga gtc agc aga gcc ggg c
9c
455～ 634
9U
ctc agg cca cac ttg ccg tc
296
64
9L
gtg gca tcc agg cgt tgt cc
, 百拇医药
编码区外显子编号，按GenBank接受编号 a: AF032984 b: AF032985 c: aF032986 U为上游引物，L为下游引物。
3.PCR扩增：PCR反应体系为20 μl中进行，含1×buffer, 5 mmol/L MgCl2, 200 μmol/L dNTPs, Taq酶0.8 U, 模板gDNA 100 ng(所用试剂均为MBI公司产品)。每次反应均设正常人基因组DNA为阳性对照，同时设空白对照。取5 μl PCR产物，行6%聚丙烯酰胺凝胶(29∶1)电泳检测产物的量及特异性，二者均满意者进行SSCP分析。
4.SSCP银染分析：在PCR产物中加入等体积2×甲酰胺变性载样缓冲液，在PE9600型PCR仪上96℃，10分钟变性，变性结束后立即置于冰块中骤冷，上样于8% SSCP胶(含5%甘油的29∶1聚丙烯酰胺凝胶)，恒电压300V，在4℃循环水浴中电泳约20小时。凝胶经银染后，在Bio-Rad公司GS700扫描仪上记录并打印结果，再行DNA测序分析。
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5.DNA序列分析：发现异常带型的PCR产物以“压碎浸泡法”纯化。制备测序模板[5]。在ABI377自动循环测序仪上行测序分析，结果通过GCG软件进行分析。每个家系先择取一名患者做突变分析，若测序证实突变者，在家系内其它患者和未受累者中进行突变分析，以确认该突变并非是STK11基因的多态现象。
结 果
1.PCR-SSCP分析：分别在1, 2, 3, 4, 6, 8号家系的6个患者中发现6条异常带，它们分别在扩增外显子1、2、5、7、8时发现。
2.DNA测序： 分别在4号、6号家系的两个患者中发现STK11基因2个有意义的突变(表2)，并在其家系内STK11基因突变分析中得到一致证实(图1，2)。有4个内含子部分的点突变发生在另外4个患者中(无致病意义)。
表2 PJS患者STK11基因2个突变的位置及意义 患者
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突变内容
位置
密码子
次序
预期效应
Ⅱ:2 (6#家系)
C119T
exon1
37
肽链在37位氨基酸上终止
Ⅱ:4(4#家系)
G629T
intron1
, 百拇医药
97
剪接位点突变，导致阅读框向1号内含子延伸，肽链在98位氨基酸上终止
6#PJS家系患者Ⅱ:2在STK11基因外显子1中发现无义突变，119位核苷酸 C→T， 37位上编码谷氨酰胺的密码子(CAG)变为终止密码(TAG)。Ⅲ:1患者具有相同突变。4#PJS家系患者Ⅱ:4在STK11基因内含子1发现剪接位点突变，供体部位发生突变G→T ，剪接位点 消失，阅读框向内含子延伸， 98位出现终止密码。双亲无相同突变。
图1 a 6# PJS家系图； b PCR扩增外显子1a，SSCP凝胶电泳，同一家系2个患者(Ⅱ:2, Ⅲ:1)显示同一带型，与正常对照(c)相比多一条单链带。
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图2 a 4#PJS家系图； b PCR扩增外显子1C，SSCP凝胶电泳，显示患者II:4与同一家系未受累者(I：1)和正常对照(C) 不同的带型，其中一条单链带迁移至底部
讨 论
1997年Hemminki和Anderson等[1，4]提出PJS致病基因与D19S886(19p13.3)无重组。法国的Olschwang等[6] 1998年提出大部分PJS与D19S886连锁，但也有少数病例(3/20)没有连锁在19p13.3区域内，而这两类病例种族一致，临床表现无明显差异。1998年1月Jennd等[2]和Hemminki等[3]几乎同时克隆了PJS致病基因，该基因cDNA全长2 158 bp，编码区长约1 302 bp，分布在23 kb的gDNA区域上，有9个外显子。它编码一种新的丝—苏氨酸激酶(STK11)与爪蟾胞浆内丝—苏氨酸蛋白激酶(XEEK1)高度同源。同源分析表明STK11通过磷酸化作用来控制细胞分化，是一个cAMP依赖激酶，并有人推测象PTEN和APC基因一样，STK11基因是肿瘤易感基因，在散发性肿瘤的发生和发展中发挥作用[2]。
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Hemminki等[1]对12例PJS患者STK11基因进行突变分析，结果11例发现突变，突变形式有点突变5例，小片段缺失5例和单个碱基插入1例，而Jennd DE对5例患者进行突变分析则发现点突变2例，小片段缺失2例，大片段缺失和倒位同时发生1例。可以看出其突变形式以点突变和小片段缺失为主。
但是中国人PJS患者STK11基因上述突变形式及位点是否具有普遍意义以及是否存在种族差异尚不清楚。我们的研究结果发现在两例患者中有两个新的点突变，1例是1号外显子119位核苷酸出现C→T置换，相应编码天冬酰胺密码子变成终止密码，另1例是1号内含子剪接位点的供体部位出现G→T置换，阅读框向1号内含子延伸，紧接着出现终止信号，两者最终导致提前出现终止信号。我们还发现4例突变发生在内含子内部，尚未在外显子部份检测出缺失突变。我们初步研究的结果提示中国人STK11基因的突变可能以点置换突变为主，突变的位点在编码区起始部分多见。与文献相比，中国人PJS患者STK11基因的突变发生率较低，一方面可能与SSCP分析方法的敏感性不高有关，可采用DGGE(变性梯度凝胶电泳)或RT-PCR产物直接测序的方法，加大样本量以便更为完整准确分析中国人PJS患者STK11基因的突变情况，为基因诊断奠定基础，另一方面我们认为，PJS可能还存在遗传异质性，除了19p13.3外，还有其它位点与之有关，有待我们选择STK11基因无突变的大家系，作联锁定位分析，发现新的位点，克隆新的致病基因。
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参考文献
1 Hemminki A, Tomlinson I, Markie D, et al. Locatigation of a susceptibility locus for Peutg-Jeghers Syndrome to 19p using comparative genomic hybridigation and targeted linkage analysis. Nat Genet， 1997，15:5-6.
2 Jennd DE, Reimamnl H, Negu JI, et al. Peutz-Jeghers syndrome caused by mutation in a novel serine threonine kinase. Nat Genet， 1998， 1:38-44.
3 Hemminki A, Tomlinson I, Avigienyte E, et al. A serine/threonine kinase gene defectne in Peutz-Jeghers Syndrome. Nature， 1988， 391：184.
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4 Anderson JP, Seldin MF, Bail D, et al. Fine mapping of a genetic locus for Peutz-Teghers syndrome on chromosome 19p. Am J Hum Genet， 1997， 4:A265.
5 Smbrook J, Fritsch EF, Manicatis F. Molecular cloning. 北京： 科学出版社，1996, 332-333.
6 Olschwang S, Markie D, Seal S, et al. Peutz-Jeghers syndrome: most, but not all , families are compatible with linkage to 19p13.3. J Med Genet， 1998， 35:42-44.
收稿：1998-06-22 修回：1999-02-05, 百拇医药
单位：
关键词：Peutz-Jeghers综合征；STK11基因；聚合酶链反应；基因转变
中华医学杂志NATIONAL MEDICAL JOURNAL OF CHINA1999年 第6期 1999
【摘要】 目的 对中国人Peutz-Jeghers(PJ)综合征患者STK11基因进行突变分析，确定其特征，为基因诊断奠定基础。方法 应用聚合酶链反应-单链构象多肽分析(PCR-SSCP)和DNA测序的方法，对8个中国人PJS家系STK11基因进行研究。结果 在两个家系中分别新发现一个终止突变和剪接位点突变，推测最终导致产生截短型蛋白。结论 STK11基因在中国人PJS患者中可能以点突变为主，突变发生率较国外报道低。提示，PJS可能有遗传异质性。
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STK11 Gene Mutation in Chinese with PJS
LI Yixiong, LU Xinsheng, XIA Jiahui, et al. *Affiliated Xiangya Hospital, National Laboratory of Medical Genetics, Hunan Medical University. Changsha 410078，China
【Abstract】 Objectives To understand the mutation characteristic of STK11 gene in Chinese with Peutz-Jeghers syndrome and establish the gene diagnosis of PJS. Methods STK11 gene was analysed by PCR-SSCP and DNA sequencing in 8 Chinese pedigrees with PJS. Results Two novel point mutations of STK11 gene were detected in two pedigrees: one was nonsense in exon1, and another mutation occurred in splice spot in the donor site of intron 1. It was estimated that these mutations would lead to produce truncated protein. Conclusion Point mutation in STK11 may be chief in Chinese with PJS and the frequency of mutation was fewer than that in previous reports. It suggested that there may be genetic heterogeneity in PJS.
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【Key words】 Peutz-Jeghers syndrome STK11 gene PCR Gene Conversion
(Natl Med J China, 1999, 79：425-427)
Peutz-Jeghers sysdrome (PJS)是一种常染色体显性遗传性疾病，发病率为1/25 000。PJS是一种肿瘤易感综合征，患者常伴发消化系肿瘤和生殖腺肿瘤，如：胃癌、肠癌、胰腺癌以及卵巢癌和睾丸肿瘤等，约48%的受累者在57岁后死于肿瘤[1]。最近，Jennd DE等[2]和Hemminki A等[3]人在距D19S886 190 kb的近端克隆了PJS致病基因STK11。为了研究STK11基因在中国人PJS中的突变情况，为以后的基因诊断和基因治疗奠定基础，我们收集了8个中国人PJS家系，采用聚合酶链反应-单链构象多肽分析(PCR-SSCP)和DNA测序的方法，对STK11基因的突变形式和位点进行了初步研究，报道如下。
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资料和方法
一、资料
1.病例选择及样品采集：同时具备下列两条者作为诊断PJS的标准：(1)口周唇和(或)颊粘膜以及指(趾)部咖啡色素斑块(点)；(2)肠道多发性息肉，经手术或肠镜证实，病理检查为错构性息肉或腺瘤性息肉。通过湖南医科大学附属湘雅医院、附属第二医院普外科，在住院或门诊病例中，采集到符合上述诊断标准的8个PJS家系，共56个成员，其中18人为患者。抽取患者、家系内同代未患病者之一或双亲的外周静脉血、肝素抗凝，4℃保存，12小时内提取DNA。
二、方法
1.DNA的制备：按医学遗传学国家重点实验室外周血DNA提取方法制备。DNA溶于四氰基乙烯(TE)中，取适量经紫外光度计进行定量和纯度检测，其余于-70℃保存备用。
2.引物设计与合成：STK11基因有9个外显子，第一号外显子基因片段较大，设计了3对引物，其余外显子分别设计一对引物，共11对引物(见表1)。所有引物均在医学遗传学国家重点实验室Beckman Oligol 1 000 mol/L DNA合成仪上合成。
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表1 STK11基因PCR-SSCP分析引物序列 扩增片段
位 置
引物代号
序 列
大小(bp)
退火温度(℃)
exon 1a
339～ 628
1aU
tgg cgg cgg gac tcc agg ac
171
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1aL
cga tga gct tgg ccc gct tg
1bU
cac cgc atc gac tcc acc ga
163
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1bL
ctt ctt gag gat ctt gac ggc
1cU
gag gtg ctg gac tcg gag ac
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154
64
1cL
acc atc agc acc gtg act gg
2b
457～ 540
2U
ata cac ccc tgt cct ctc tg
142
62
2L
agg ccc cgc ggt ccc aac
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3b
1 364～1 453
3U
ctg agc tgt gtg tcc tta gcg
195
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3L
gtg tgg cct cac gga aag gag
4b
2 413～2 545
4U
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cag gac tgg tgt gtg ctg c
229
63
4L
cgg tgc cgt gca gcc ctc
5b
2 621～2 757
5U
gag ggc tgc acg gca ccg c
203
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gag tgt gcg tgt ggt gag tg
6b
3 253～3 380
6U
gcc ttt ctt ccc tct cct cg
182
64
6L
tgc ggg cag agg gat gag gc
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3 989～4 046
7U
aca ggc tcc tcg ccg gct tc
163
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cta gcg ccc gct caa ccag
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8U
ggc gcc act gct tct ggg c
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255
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cga gtc agc aga gcc ggg c
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455～ 634
9U
ctc agg cca cac ttg ccg tc
296
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9L
gtg gca tcc agg cgt tgt cc
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编码区外显子编号，按GenBank接受编号 a: AF032984 b: AF032985 c: aF032986 U为上游引物，L为下游引物。
3.PCR扩增：PCR反应体系为20 μl中进行，含1×buffer, 5 mmol/L MgCl2, 200 μmol/L dNTPs, Taq酶0.8 U, 模板gDNA 100 ng(所用试剂均为MBI公司产品)。每次反应均设正常人基因组DNA为阳性对照，同时设空白对照。取5 μl PCR产物，行6%聚丙烯酰胺凝胶(29∶1)电泳检测产物的量及特异性，二者均满意者进行SSCP分析。
4.SSCP银染分析：在PCR产物中加入等体积2×甲酰胺变性载样缓冲液，在PE9600型PCR仪上96℃，10分钟变性，变性结束后立即置于冰块中骤冷，上样于8% SSCP胶(含5%甘油的29∶1聚丙烯酰胺凝胶)，恒电压300V，在4℃循环水浴中电泳约20小时。凝胶经银染后，在Bio-Rad公司GS700扫描仪上记录并打印结果，再行DNA测序分析。
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5.DNA序列分析：发现异常带型的PCR产物以“压碎浸泡法”纯化。制备测序模板[5]。在ABI377自动循环测序仪上行测序分析，结果通过GCG软件进行分析。每个家系先择取一名患者做突变分析，若测序证实突变者，在家系内其它患者和未受累者中进行突变分析，以确认该突变并非是STK11基因的多态现象。
结 果
1.PCR-SSCP分析：分别在1, 2, 3, 4, 6, 8号家系的6个患者中发现6条异常带，它们分别在扩增外显子1、2、5、7、8时发现。
2.DNA测序： 分别在4号、6号家系的两个患者中发现STK11基因2个有意义的突变(表2)，并在其家系内STK11基因突变分析中得到一致证实(图1，2)。有4个内含子部分的点突变发生在另外4个患者中(无致病意义)。
表2 PJS患者STK11基因2个突变的位置及意义 患者
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突变内容
位置
密码子
次序
预期效应
Ⅱ:2 (6#家系)
C119T
exon1
37
肽链在37位氨基酸上终止
Ⅱ:4(4#家系)
G629T
intron1
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97
剪接位点突变，导致阅读框向1号内含子延伸，肽链在98位氨基酸上终止
6#PJS家系患者Ⅱ:2在STK11基因外显子1中发现无义突变，119位核苷酸 C→T， 37位上编码谷氨酰胺的密码子(CAG)变为终止密码(TAG)。Ⅲ:1患者具有相同突变。4#PJS家系患者Ⅱ:4在STK11基因内含子1发现剪接位点突变，供体部位发生突变G→T ，剪接位点 消失，阅读框向内含子延伸， 98位出现终止密码。双亲无相同突变。
图1 a 6# PJS家系图； b PCR扩增外显子1a，SSCP凝胶电泳，同一家系2个患者(Ⅱ:2, Ⅲ:1)显示同一带型，与正常对照(c)相比多一条单链带。
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图2 a 4#PJS家系图； b PCR扩增外显子1C，SSCP凝胶电泳，显示患者II:4与同一家系未受累者(I：1)和正常对照(C) 不同的带型，其中一条单链带迁移至底部
讨 论
1997年Hemminki和Anderson等[1，4]提出PJS致病基因与D19S886(19p13.3)无重组。法国的Olschwang等[6] 1998年提出大部分PJS与D19S886连锁，但也有少数病例(3/20)没有连锁在19p13.3区域内，而这两类病例种族一致，临床表现无明显差异。1998年1月Jennd等[2]和Hemminki等[3]几乎同时克隆了PJS致病基因，该基因cDNA全长2 158 bp，编码区长约1 302 bp，分布在23 kb的gDNA区域上，有9个外显子。它编码一种新的丝—苏氨酸激酶(STK11)与爪蟾胞浆内丝—苏氨酸蛋白激酶(XEEK1)高度同源。同源分析表明STK11通过磷酸化作用来控制细胞分化，是一个cAMP依赖激酶，并有人推测象PTEN和APC基因一样，STK11基因是肿瘤易感基因，在散发性肿瘤的发生和发展中发挥作用[2]。
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Hemminki等[1]对12例PJS患者STK11基因进行突变分析，结果11例发现突变，突变形式有点突变5例，小片段缺失5例和单个碱基插入1例，而Jennd DE对5例患者进行突变分析则发现点突变2例，小片段缺失2例，大片段缺失和倒位同时发生1例。可以看出其突变形式以点突变和小片段缺失为主。
但是中国人PJS患者STK11基因上述突变形式及位点是否具有普遍意义以及是否存在种族差异尚不清楚。我们的研究结果发现在两例患者中有两个新的点突变，1例是1号外显子119位核苷酸出现C→T置换，相应编码天冬酰胺密码子变成终止密码，另1例是1号内含子剪接位点的供体部位出现G→T置换，阅读框向1号内含子延伸，紧接着出现终止信号，两者最终导致提前出现终止信号。我们还发现4例突变发生在内含子内部，尚未在外显子部份检测出缺失突变。我们初步研究的结果提示中国人STK11基因的突变可能以点置换突变为主，突变的位点在编码区起始部分多见。与文献相比，中国人PJS患者STK11基因的突变发生率较低，一方面可能与SSCP分析方法的敏感性不高有关，可采用DGGE(变性梯度凝胶电泳)或RT-PCR产物直接测序的方法，加大样本量以便更为完整准确分析中国人PJS患者STK11基因的突变情况，为基因诊断奠定基础，另一方面我们认为，PJS可能还存在遗传异质性，除了19p13.3外，还有其它位点与之有关，有待我们选择STK11基因无突变的大家系，作联锁定位分析，发现新的位点，克隆新的致病基因。
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参考文献
1 Hemminki A, Tomlinson I, Markie D, et al. Locatigation of a susceptibility locus for Peutg-Jeghers Syndrome to 19p using comparative genomic hybridigation and targeted linkage analysis. Nat Genet， 1997，15:5-6.
2 Jennd DE, Reimamnl H, Negu JI, et al. Peutz-Jeghers syndrome caused by mutation in a novel serine threonine kinase. Nat Genet， 1998， 1:38-44.
3 Hemminki A, Tomlinson I, Avigienyte E, et al. A serine/threonine kinase gene defectne in Peutz-Jeghers Syndrome. Nature， 1988， 391：184.
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4 Anderson JP, Seldin MF, Bail D, et al. Fine mapping of a genetic locus for Peutz-Teghers syndrome on chromosome 19p. Am J Hum Genet， 1997， 4:A265.
5 Smbrook J, Fritsch EF, Manicatis F. Molecular cloning. 北京： 科学出版社，1996, 332-333.
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收稿：1998-06-22 修回：1999-02-05, 百拇医药