乙型肝炎病毒在 IgA 肾病患者肾组织中的感染情况
作者：马学玲 张月娥 杜卫东 郭慕依 张景红 方利君 顾建人
单位：200032 上海医科大学病理学教研室[马学玲(现在中国人民解放军第八五医院肾内科,上海200052)、张月娥、 郭慕依、杜卫东]；中国人民解放军上海八五医院肾内科(张景红); 上海医科大学附属儿科医院肾内科(方利君)； 上海肿瘤研究所(顾建人)
关键词：肝炎病毒，乙型；肾小球肾炎，IgA ；核酸杂交；免疫组织化学
中华医学杂志NATIONAL MEDICAL JOURNAL OF CHINA1999年 第6期 1999
【摘要】 目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)感染与IgA肾病的关系。方法 利用原位分子杂交、免疫组织化学及其双标记技术，部分病例辅以Southern 印迹杂交和血清学检测，对91例IgA肾病肾穿刺标本进行了系列研究。结果 肾组织内HBAg阳性率为69%(63/91)。HBV DNA原位杂交阳性率为43%(39/91)。作Southern 印迹杂交检测的27例中，18例(67%)HBV DNA阳性，均属整合型，其中的17例肾组织HBAg阳性，16例肾组织HBV DNA原位杂交阳性。肾小管上皮HBV DNA阳性病例，HBcAg及HBsAg的阳性率分别为77%(30/39)及72%(28/39)， HBV DNA阴性病例HBeAg和HBsAg阳性率分别为10%(5/52)及21%(11/52)，差别有显著意义(P<0.01)，双重标记染色显示HBV DNA阳性病例的大部分半数以上HBV DNA阳性肾小管上皮细胞同时表达HBcAg或(和)HBsAg。结论 部分IgA肾病肾组织可以直接感染HBV，并原位表达HBAg。
, 百拇医药
The reletionship between IgA nephropathy and HBV infection
MA Xueling, ZHANG Yuee, DU Weidong, et al. Department of Pathology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China
【Abstract】 Objective To clarify the correlation between hepatitis B virus (HBV) infection and the pathogenesis of IgA nephropathy. Methods Ninety-one cases of primary IgA nephropathy were investigated by using in situ hybridization(HBV DNA), immunohistochemistry (HBAg) and HBV DNA-HBAg double staining techniques. In some of the cases, Southern blot analysis and serologic HBV infectious markers were detected also. Results The positive rate of HBAg in renal tissue detected by immunohistochemistry was 69% (63/91)and that of the HBV DNA detected by in situ hybridization was 43%(39/91). Eighteen of 27 cases showed HBV DNA positive in Southern blot analysis, and all of the positive cases were identified to be the integrated form. Among them, 17 cases were HBAg detectable in renal tissue by immunohistochemistry and 16 cases were HBV DNA detectable by in situ hybridization simultaneously. The positive rate of the expression of HBcAg [77%(30/39)] and HBsAg[72%(28/39)] of the tubular epithelial cells with HBV DNA signals in nuclears by in situ hybridization was significantly higher than that of the cells without HBV DNA signals(10%, 21%). The double staining showed that most of the HBV DNA positive tubular epithelial cells coexpressed HBsAg and(or) HBcAg. Conclusion The renal tissue of some of IgA nephropathy infected with HBV directly and express HBAg in situ.
, 百拇医药
【Key words】 Hepatitis B virus Glomerulonephritis,IGA Neuleic acid hybridization Immunohistochemist
(Natl Med J China, 1999, 79：417-421)
IgA肾病在我国十分常见，其病因及发病机制目前尚不清楚。有文献报道IgA肾病的发生与乙型肝炎病毒(HBV) 感染可能有一定的关系[1-3]。 我们应用原位分子杂交、免疫组织化学以及原位杂交-免疫组织化学双染色技术，部分病例辅以Southern印迹杂交及血清学检测，对91例原发性IgA肾病肾穿刺材料进行系列研究，探讨IgA肾病与HBV感染的关系，旨在为临床防治提供理论依据。
对象和方法
一、 对象
, 百拇医药
91例IgA肾病肾穿刺组织标本选自上海医科大学附属儿科医院、华山医院和中山医院以及中国人民解放军第八五医院。选用同时期血清及肾组织HBV感染标志物阴性的30例肾小球肾炎(其中系膜增生性肾炎25例，局灶节段性肾炎3例，膜增生性肾炎2例)作为对照组。91例IgA肾病患者中男35例，女56例，男∶女为1∶1.6。儿童6例，成人85例，20～40岁之间者59例，占65%。参照朱建民[4]有关IgA肾病亚型分类标准，91例中轻微病变型11例，局灶增生型19例，系膜增生型20例，弥漫增生型9例，局灶节段硬化型27例，硬化型5例。
二、 方法
1.血清HBV感染标志检测：以ELISA双抗体夹心法检测HBsAg、HBeAg；双抗原夹心法检测抗HBs；抗体竞争法检测抗HBe、抗HBc。药盒来自上海市医药检测中心。
2.肾组织HBsAg、HBcAg免疫组织化学染色：于石蜡切片用PAP免疫酶法进行HBsAg、HBcAg染色。羊抗HBs、兔抗HBc购自丹麦DAKO公司。专一特异兔抗羊IgG、羊抗兔IgG和羊PAP及兔PAP由本教研室自制。分别以正常羊血清及兔血清代替一抗作为阴性对照。
, 百拇医药
3.肾组织HBV DNA检测：于石蜡切片上进行HBV DNA原位分子杂交以及HBV DNA-HBsAg、HBcAg双标记染色，方法见文献[5，6]。对27例作Southern印迹杂交，分析HBV DNA存在状态，方法见文献[7]。
4.统计学方法：HBV感染指标的检测以阳性率表示，差异显著性检验用χ2检验。
结果
一、HBV感染的形态学表现
免疫组织化学染色显示HBAg主要位于肾小球系膜区，少数位于毛细血管襻及肾小球球囊壁，呈细颗粒状。在肾小管则位于上皮细胞(近曲小管、远曲小管及集合管等)胞浆或(和)胞膜呈浆型、膜型或浆膜型染色，其中HBsAg在近曲小管常可局限在上皮细胞的顶端胞浆及刷状缘处，部分病例肾小管腔内蛋白管型HBsAg亦可呈阳性着色。HBcAg以浆型染色较多，顶浆型及膜型较少。少数病例HBAg亦可见于肾间质内，灶性分布，呈较弱的弥散性染色。原位杂交HBV DNA阳性信号表现为紫蓝色细小颗粒，对照HE及PASM染色发现 HBV DNA主要位于肾小球系膜细胞、内皮细胞、脏层和壁层上皮细胞以及肾小管(近曲小管、远曲小管和集合管等)上皮细胞胞核内，染色强度可深浅不一(图1，2)。部分肾间质病变明显的病例，浸润的炎症细胞亦可显示HBV DNA阳性信号。另外，同一病例不同区域或同一肾小管不同上皮细胞HBV DNA、HBAg的量有所不同。
, 百拇医药
二、 HBV感染的阳性情况
91例IgA肾病肾组织中HBAg总的阳性例数为63例，占69%(其中HBsAg 为56%，HBcAg 40%)。63例中肾小球及肾小管HBAg阳性者均为53例，占58%。其HBsAg 和HBcAg 在肾小球的阳性率分别为52%和14%，在肾小管则分别为43%和38%，换言之，HBsAg在肾小球的阳性率高于肾小管，而HBcAg则在肾小管高于肾小球。阳性病例中肾小球及肾小管HBsAg同时阳性者39例(43%)，HBcAg同时阳性者仅12例(13%)。原位杂交HBV DNA阳性者为39例(43%)。肾小管上皮HBV DNA阳性病例中HBcAg及HBsAg的阳性率分别为77%及72%，在HBV DNA阴性病例中两者阳性率分别为10%及21%，差异有显著意义(P<0.01，表1)，HBV DNA-HBAg双重标记染色显示HBV DNA阳性病例的大部分HBV DNA阳性肾小管上皮细胞内有HBcAg或(和)HBsAg表达(图3，4)。
, 百拇医药 对27例IgA肾病(1例为儿童，其余均为成人)作了Southern 印迹杂交，其中18例(67%)阳性，所有阳性病例均显示高分子DNA不均一性条带(4.2～23.7 kb)的杂交信号，属整合型(图5)。18例中有17例肾组织HBAg阳性(其中HBsAg阳性14例；HBcAg阳性12例)，对18例作了原位杂交，HBV DNA阳性者16例(16例中肾小管HBAg均阳性，其中HBsAg 13例，HBcAg 12例；肾小球HBAg阳性13例，HBsAg 12例，HBcAg 5例)。Southern 印迹杂交阳性组的肾小管、肾小球HBV DNA (原位杂交)及肾小管HBcAg的检出率较阴性组明显为高(P<0.001，表2)，其血清HBAg或(和)HBAb则可表现为阳性或阴性。在血清、Southern 印迹杂交、原位杂交及免疫组织化学检测均阳性的5例中，肾组织HBcAg阳性5例，HBsAg阳性3例。在9例Southern印迹杂交阴性的病例中，肾组织HBV DNA (原位杂交)和HBcAg均为阴性，但在肾小球HBsAg阳性6例中肾小管同时阳性4例；9例患者的血清学检测结果：1例HBsAg、抗HBc和抗HBe阳性, 1例抗HBs阳性，此2例肾组织HBsAg免疫组织化学染色均为阳性反应。
, http://www.100md.com
表1 IgA肾病肾组织HBV DNA原位杂交不同反应与HBAg的分布情况(例数) 组别
例数
肾小管
肾小球
总阳性例数
HBsAg
HBcAg
总阳性例数
HBsAg
HBcAg
HBV DNA阳性
39
, 百拇医药
39
28
30
32
26
11
HBV DNA阴性
52
14
11
5
21
21
, http://www.100md.com 2
χ2值
48.93
23.33
42.67
15.97
6.16
10.80
P值
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
, http://www.100md.com
<0.01
<0.005
表2 IgA肾病肾组织HBV DNA Southern blot不同反应与原位杂交、免疫组织化学及血清学检测结果的比较(例数) 组别
例数
HBV DNA(原位杂交)
HBAg(免疫组织化学)
血清HBAg/HBAb
肾小
管
肾小
球
, http://www.100md.com
间
质
肾小管
肾小球
总阳性
例数
HBsAg
HBeAg
抗
HBs
抗
HBe
抗
, 百拇医药 HBc
总阳性
例数
HBsAg
HBcAg
总阳性
例数
HBsAg
HBeAg
Southern阳性
18
16
13
, 百拇医药
12
17
14
12
14
12
5
6
4
0
1
4
1
Southern阴性
, 百拇医药
9
0
0
0
4
4
0
6
6
0
2
1
0
1
, 百拇医药
1
1
χ2值
69.12
12.54
10.80
8.68
3.0
10.80
0.39
0
3.07
0.36
, 百拇医药
0.49
0
0.27
0.49
0.27
P值
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
, 百拇医药
图1 微小病变型IgA肾病，肾小球系膜细胞、上皮细胞核有较强HBV DNA杂交信号，其近旁部分肾小管上皮细胞核亦呈阳性。原位杂交 ×200 图2 微小病变型IgA肾病，肾小管上皮细胞核HBV DNA杂交信号强弱不均 原位杂交×400 图3 局灶节段硬化型IgA肾病，肾小管上皮细胞核HBV DNA阳性(蓝色)，细胞浆及部分细胞的胞膜处表达HBcAg(棕色)，间质内少量炎细胞亦呈现较弱HBV DNA杂交信号。 HBV DNA原位杂交-HBcAg免疫组织化学双标记 ×500 图4 弥漫增生型IgA肾病，部分肾小管上皮细胞核内HBV DNA杂交信号阳性(蓝色)的胞浆内同时表达HBsAg(棕色)。 HBV DNA原位杂交-HBsAg免疫组织化学双标记 ×400
注：1、2、8、10及14为病例序号；R及U分别为经及未经
EcoRI酶切的HBV DNA杂交信号，CR、CU为对照病例，图左为经Hind III酶切的λDNA标准碱基对长度
, 百拇医药
图5 HBV DNA Southern印迹杂交分析
讨论
匈牙利学者Nagy等[8]首先报道了32例IgA肾病患者，血清HBsAg阳性率为16%，远高于当地正常人群 (0.99%)。香港地区Lai等[9]也作了类似报道，并在21例患者的肾组织中有12例测得HBAg，其中6例用biotin标记HBV DNA探针作原位分子杂交，证实有HBV DNA存在[1]。我们以往的研究发现本病肾组织HBAg的阳性率为18.9%，我们在5例HBAg阳性者中用Digoxigenin标记探针作原位杂交，证实4例有HBV DNA[10]。上述结果提示，HBV 感染与IgA肾病可能存在着病因学上的关系，但由于以往的观察零散，病例不多，缺乏病理、免疫病理、分子病理等多方面的横向综合研究和验证，因而尚难确切回答有些IgA肾病的发生是否的确与HBV感染有关，HBV是否直接感染肾组织，HBV DNA阳性的肾细胞能否表达相关抗原(HBAg)，亦即在肾组织能否原位合成HBAg，启动或加重免疫损伤。
, 百拇医药
在本组资料中我们发现各种亚型IgA肾病均可有HBAg的沉积，组间阳性率差异无显著意义。HBsAg的阳性率在肾小球高于肾小管。而HBcAg的阳性率则肾小管高于肾小球。理论上来讲，肾组织内HBAg的来源有3种可能性：血循环来源(肝源性)；肾组织原位合成(肾源性)；血循环来源和肾组织原位合成 (肝源性+肾源性)。由于HBcAg为细胞内抗原，一般仅在细胞受损时，才从细胞内释放出来[7]，所以，肾小管上皮细胞内HBcAg的存在难以用血循环抗原或抗原抗体免疫复合物的沉积或阳性原尿的重吸收加以解释。原位杂交结果表明IgA肾病肾组织HBV DNA阳性率达43% (39/91)，而在所有39例HBV DNA阳性病例中，肾小管均阳性(100%)，肾小球阳性为35例(90%)。肾组织HBAg的阳性率与HBV DNA的存在密切相关。应用原位杂交与免疫组织化学双标记技术发现肾组织，尤其是肾小管上皮细胞，由于胞浆丰富，易于观察，可明确看到HBV DNA阳性细胞内有HBAg的表达，表明相当一部分IgA肾病的肾组织，的确可以感染HBV并原位合成HBAg。已有的Southern印迹杂交研究发现HBV DNA的存在可以是游离型或整合型，前者又包括复制型和非复制型。游离非复制型的出现，表明HBV DNA存在于细胞染色体外，仅显示3.2 kb的单一条带[11]；游离复制型则除了有3.2 kb条带外，还伴有小于3.2 kb HBV复制中间体的多个条带。整合型由于HBV DNA整个基因或其基因片段随机整合到宿主染色体DNA内，故未经酶切时显示高相对分子质量的大片段DNA(>40kb)，经过酶切后，由于随机整合片段长短不一，故显示不均一性条带(4.3～23.7 kb)[7，10]。在我们作Southern印迹杂交检测的27例IgA肾病中，所有Southern印迹杂交阳性病例均显示为整合型，从而排除了标本中血循环HBV DNA污染的可能[7]。然而，这部分整合型HBV DNA在感染的肾细胞内能否进一步表达HBAg抑或仅呈潜隐携带状态则取决于整合后的HBV基因片段是否完整以及整合区是否能够提供与病毒基因相匹配的表达元件等。因此，本组资料部分HBV DNA原位杂交阳性的肾组织内HBcAg或(和)HBsAg免疫组织化学染色可表现为阴性反应。我们发现Southern印迹杂交阳性的病例，肾组织HBV DNA原位杂交及HBAg免疫组织化学可以是阳性或阴性，Southern印迹杂交阴性的病例，肾组织HBV DNA原位杂交及HBcAg免疫组织化学均为阴性反应，提示Southern印迹杂交能敏感地反映肾组织内HBV的有无以及HBV DNA的存在状态。HBV DNA原位杂交以及HBcAg免疫组化检测亦能较好地反映出肾组织内HBV的感染状况。至于在HBV DNA阴性组中有部分病例出现HBAg的原因，认为除了肾组织HBV DNA含量较少难以测出外，肾小球上沉积的HBAg，尤其是HBsAg很可能象传统认为的那样仍主要来源于血循环。此时，肾小管上皮内的HBsAg则可能与带有HBsAg原尿的重吸收有关，部分病例肾小管腔内蛋白管型HBsAg阳性以及近曲小管刷状缘或胞浆顶部HBsAg特深的阳性着色，为这一推测提供了间接佐证。
, 百拇医药
我们可以认为我国上海地区部分IgA肾病患者的肾组织有HBV感染，肾组织内的HBAg除来源于血循环外，也可来源于肾组织感染HBV后的原位表达。受损肾组织释出的HBsAg可以诱发以T淋巴细胞为主的单个核细胞浸润，继而导致IgA肾病明显的肾小管-间质损伤[12]，成为IgA肾病病程迁延不愈的免疫病理基础。
注释：本课题为国家自然科学基金资助项目(39770292)
参考文献
1 Lai KN, Lai FM, Tam JS, et al. Strong association between IgA nephropathy and
hepatitis B surface anti-genemia in endemic area. Clin Nephrol, 1988，29:229-234.
, http://www.100md.com
2 Lai KN, Lai FM., Tam JS. IgA nephropathy associated with chronic hepatitis B virus
infection in adults: the pathogenetic of HBsAg. J Pathol, 1989，157:321-327.
3 汪年松，吴兆龙，张月娥，等. IgA肾病是否与乙型肝炎病毒有关? 中华肾脏病杂志，1996，12:276-278.
4 朱建民. 原发性IgA肾病的现状.中华肾脏病杂志，1992，8:309-311.
5 马学玲，杜卫东，阎惠平，等. 地高辛标记HBV DNA探针原位分子杂交技术.临床实验病理学
杂志， 1996, 12:84-85.
, 百拇医药
6 马学玲，张秀荣，杜卫东，等. IgA肾病肾组织 HBV DNA和HBAg双标记技术.上海医科大学学
报，1997, 24:293-294.
7 方利君，张月娥，顾建人，等.小儿乙肝病毒相关性肾炎肾组织中乙型肝炎病毒DNA的存在状
态.中华肾脏病杂志，1992, 8:65-67.
8 Nagy J, Baitai G, Brasch H, et al. The role of hepatitis B surface antigen in the
pathogenesis of glomerulopaties. Clin Nephrology, 1979, 12:109-116.
, http://www.100md.com 9 Lai KN, Lai FM, Chan KW, et al. Clinico-pathologic features of hepatitis B
virus-associated glomerulonephritis. Q J Med, 1987, 63:323-333.
10 Zhang Yue-e, Ma Xueling, Fang Lijun, et al. The existence and significence of
hepatitis B virus DNA in glomerulonephritis. Nephrology, 1996, 2:119-125.
11 Yoffe B, Noonon CA, Melnick JL, et al. Hepatitis B virus DNA in mononuclear cells
analysis of cell subsets for presence of replicative intermediates of viral DNA.
J Infect Dis, 1986, 153:471-477.
12 马学玲，张月娥，方利君，等.HBV感染与IgA肾病肾小管-间质病变的关系.中华病理学杂志，1998，27：269-272.
收稿:1998-12-24 修回:1999-02-15, http://www.100md.com
单位：200032 上海医科大学病理学教研室[马学玲(现在中国人民解放军第八五医院肾内科,上海200052)、张月娥、 郭慕依、杜卫东]；中国人民解放军上海八五医院肾内科(张景红); 上海医科大学附属儿科医院肾内科(方利君)； 上海肿瘤研究所(顾建人)
关键词：肝炎病毒，乙型；肾小球肾炎，IgA ；核酸杂交；免疫组织化学
中华医学杂志NATIONAL MEDICAL JOURNAL OF CHINA1999年 第6期 1999
【摘要】 目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)感染与IgA肾病的关系。方法 利用原位分子杂交、免疫组织化学及其双标记技术，部分病例辅以Southern 印迹杂交和血清学检测，对91例IgA肾病肾穿刺标本进行了系列研究。结果 肾组织内HBAg阳性率为69%(63/91)。HBV DNA原位杂交阳性率为43%(39/91)。作Southern 印迹杂交检测的27例中，18例(67%)HBV DNA阳性，均属整合型，其中的17例肾组织HBAg阳性，16例肾组织HBV DNA原位杂交阳性。肾小管上皮HBV DNA阳性病例，HBcAg及HBsAg的阳性率分别为77%(30/39)及72%(28/39)， HBV DNA阴性病例HBeAg和HBsAg阳性率分别为10%(5/52)及21%(11/52)，差别有显著意义(P<0.01)，双重标记染色显示HBV DNA阳性病例的大部分半数以上HBV DNA阳性肾小管上皮细胞同时表达HBcAg或(和)HBsAg。结论 部分IgA肾病肾组织可以直接感染HBV，并原位表达HBAg。
, 百拇医药
The reletionship between IgA nephropathy and HBV infection
MA Xueling, ZHANG Yuee, DU Weidong, et al. Department of Pathology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China
【Abstract】 Objective To clarify the correlation between hepatitis B virus (HBV) infection and the pathogenesis of IgA nephropathy. Methods Ninety-one cases of primary IgA nephropathy were investigated by using in situ hybridization(HBV DNA), immunohistochemistry (HBAg) and HBV DNA-HBAg double staining techniques. In some of the cases, Southern blot analysis and serologic HBV infectious markers were detected also. Results The positive rate of HBAg in renal tissue detected by immunohistochemistry was 69% (63/91)and that of the HBV DNA detected by in situ hybridization was 43%(39/91). Eighteen of 27 cases showed HBV DNA positive in Southern blot analysis, and all of the positive cases were identified to be the integrated form. Among them, 17 cases were HBAg detectable in renal tissue by immunohistochemistry and 16 cases were HBV DNA detectable by in situ hybridization simultaneously. The positive rate of the expression of HBcAg [77%(30/39)] and HBsAg[72%(28/39)] of the tubular epithelial cells with HBV DNA signals in nuclears by in situ hybridization was significantly higher than that of the cells without HBV DNA signals(10%, 21%). The double staining showed that most of the HBV DNA positive tubular epithelial cells coexpressed HBsAg and(or) HBcAg. Conclusion The renal tissue of some of IgA nephropathy infected with HBV directly and express HBAg in situ.
, 百拇医药
【Key words】 Hepatitis B virus Glomerulonephritis,IGA Neuleic acid hybridization Immunohistochemist
(Natl Med J China, 1999, 79：417-421)
IgA肾病在我国十分常见，其病因及发病机制目前尚不清楚。有文献报道IgA肾病的发生与乙型肝炎病毒(HBV) 感染可能有一定的关系[1-3]。 我们应用原位分子杂交、免疫组织化学以及原位杂交-免疫组织化学双染色技术，部分病例辅以Southern印迹杂交及血清学检测，对91例原发性IgA肾病肾穿刺材料进行系列研究，探讨IgA肾病与HBV感染的关系，旨在为临床防治提供理论依据。
对象和方法
一、 对象
, 百拇医药
91例IgA肾病肾穿刺组织标本选自上海医科大学附属儿科医院、华山医院和中山医院以及中国人民解放军第八五医院。选用同时期血清及肾组织HBV感染标志物阴性的30例肾小球肾炎(其中系膜增生性肾炎25例，局灶节段性肾炎3例，膜增生性肾炎2例)作为对照组。91例IgA肾病患者中男35例，女56例，男∶女为1∶1.6。儿童6例，成人85例，20～40岁之间者59例，占65%。参照朱建民[4]有关IgA肾病亚型分类标准，91例中轻微病变型11例，局灶增生型19例，系膜增生型20例，弥漫增生型9例，局灶节段硬化型27例，硬化型5例。
二、 方法
1.血清HBV感染标志检测：以ELISA双抗体夹心法检测HBsAg、HBeAg；双抗原夹心法检测抗HBs；抗体竞争法检测抗HBe、抗HBc。药盒来自上海市医药检测中心。
2.肾组织HBsAg、HBcAg免疫组织化学染色：于石蜡切片用PAP免疫酶法进行HBsAg、HBcAg染色。羊抗HBs、兔抗HBc购自丹麦DAKO公司。专一特异兔抗羊IgG、羊抗兔IgG和羊PAP及兔PAP由本教研室自制。分别以正常羊血清及兔血清代替一抗作为阴性对照。
, 百拇医药
3.肾组织HBV DNA检测：于石蜡切片上进行HBV DNA原位分子杂交以及HBV DNA-HBsAg、HBcAg双标记染色，方法见文献[5，6]。对27例作Southern印迹杂交，分析HBV DNA存在状态，方法见文献[7]。
4.统计学方法：HBV感染指标的检测以阳性率表示，差异显著性检验用χ2检验。
结果
一、HBV感染的形态学表现
免疫组织化学染色显示HBAg主要位于肾小球系膜区，少数位于毛细血管襻及肾小球球囊壁，呈细颗粒状。在肾小管则位于上皮细胞(近曲小管、远曲小管及集合管等)胞浆或(和)胞膜呈浆型、膜型或浆膜型染色，其中HBsAg在近曲小管常可局限在上皮细胞的顶端胞浆及刷状缘处，部分病例肾小管腔内蛋白管型HBsAg亦可呈阳性着色。HBcAg以浆型染色较多，顶浆型及膜型较少。少数病例HBAg亦可见于肾间质内，灶性分布，呈较弱的弥散性染色。原位杂交HBV DNA阳性信号表现为紫蓝色细小颗粒，对照HE及PASM染色发现 HBV DNA主要位于肾小球系膜细胞、内皮细胞、脏层和壁层上皮细胞以及肾小管(近曲小管、远曲小管和集合管等)上皮细胞胞核内，染色强度可深浅不一(图1，2)。部分肾间质病变明显的病例，浸润的炎症细胞亦可显示HBV DNA阳性信号。另外，同一病例不同区域或同一肾小管不同上皮细胞HBV DNA、HBAg的量有所不同。
, 百拇医药
二、 HBV感染的阳性情况
91例IgA肾病肾组织中HBAg总的阳性例数为63例，占69%(其中HBsAg 为56%，HBcAg 40%)。63例中肾小球及肾小管HBAg阳性者均为53例，占58%。其HBsAg 和HBcAg 在肾小球的阳性率分别为52%和14%，在肾小管则分别为43%和38%，换言之，HBsAg在肾小球的阳性率高于肾小管，而HBcAg则在肾小管高于肾小球。阳性病例中肾小球及肾小管HBsAg同时阳性者39例(43%)，HBcAg同时阳性者仅12例(13%)。原位杂交HBV DNA阳性者为39例(43%)。肾小管上皮HBV DNA阳性病例中HBcAg及HBsAg的阳性率分别为77%及72%，在HBV DNA阴性病例中两者阳性率分别为10%及21%，差异有显著意义(P<0.01，表1)，HBV DNA-HBAg双重标记染色显示HBV DNA阳性病例的大部分HBV DNA阳性肾小管上皮细胞内有HBcAg或(和)HBsAg表达(图3，4)。
, 百拇医药 对27例IgA肾病(1例为儿童，其余均为成人)作了Southern 印迹杂交，其中18例(67%)阳性，所有阳性病例均显示高分子DNA不均一性条带(4.2～23.7 kb)的杂交信号，属整合型(图5)。18例中有17例肾组织HBAg阳性(其中HBsAg阳性14例；HBcAg阳性12例)，对18例作了原位杂交，HBV DNA阳性者16例(16例中肾小管HBAg均阳性，其中HBsAg 13例，HBcAg 12例；肾小球HBAg阳性13例，HBsAg 12例，HBcAg 5例)。Southern 印迹杂交阳性组的肾小管、肾小球HBV DNA (原位杂交)及肾小管HBcAg的检出率较阴性组明显为高(P<0.001，表2)，其血清HBAg或(和)HBAb则可表现为阳性或阴性。在血清、Southern 印迹杂交、原位杂交及免疫组织化学检测均阳性的5例中，肾组织HBcAg阳性5例，HBsAg阳性3例。在9例Southern印迹杂交阴性的病例中，肾组织HBV DNA (原位杂交)和HBcAg均为阴性，但在肾小球HBsAg阳性6例中肾小管同时阳性4例；9例患者的血清学检测结果：1例HBsAg、抗HBc和抗HBe阳性, 1例抗HBs阳性，此2例肾组织HBsAg免疫组织化学染色均为阳性反应。
, http://www.100md.com
表1 IgA肾病肾组织HBV DNA原位杂交不同反应与HBAg的分布情况(例数) 组别
例数
肾小管
肾小球
总阳性例数
HBsAg
HBcAg
总阳性例数
HBsAg
HBcAg
HBV DNA阳性
39
, 百拇医药
39
28
30
32
26
11
HBV DNA阴性
52
14
11
5
21
21
, http://www.100md.com 2
χ2值
48.93
23.33
42.67
15.97
6.16
10.80
P值
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
, http://www.100md.com
<0.01
<0.005
表2 IgA肾病肾组织HBV DNA Southern blot不同反应与原位杂交、免疫组织化学及血清学检测结果的比较(例数) 组别
例数
HBV DNA(原位杂交)
HBAg(免疫组织化学)
血清HBAg/HBAb
肾小
管
肾小
球
, http://www.100md.com
间
质
肾小管
肾小球
总阳性
例数
HBsAg
HBeAg
抗
HBs
抗
HBe
抗
, 百拇医药 HBc
总阳性
例数
HBsAg
HBcAg
总阳性
例数
HBsAg
HBeAg
Southern阳性
18
16
13
, 百拇医药
12
17
14
12
14
12
5
6
4
0
1
4
1
Southern阴性
, 百拇医药
9
0
0
0
4
4
0
6
6
0
2
1
0
1
, 百拇医药
1
1
χ2值
69.12
12.54
10.80
8.68
3.0
10.80
0.39
0
3.07
0.36
, 百拇医药
0.49
0
0.27
0.49
0.27
P值
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
, 百拇医药
图1 微小病变型IgA肾病，肾小球系膜细胞、上皮细胞核有较强HBV DNA杂交信号，其近旁部分肾小管上皮细胞核亦呈阳性。原位杂交 ×200 图2 微小病变型IgA肾病，肾小管上皮细胞核HBV DNA杂交信号强弱不均 原位杂交×400 图3 局灶节段硬化型IgA肾病，肾小管上皮细胞核HBV DNA阳性(蓝色)，细胞浆及部分细胞的胞膜处表达HBcAg(棕色)，间质内少量炎细胞亦呈现较弱HBV DNA杂交信号。 HBV DNA原位杂交-HBcAg免疫组织化学双标记 ×500 图4 弥漫增生型IgA肾病，部分肾小管上皮细胞核内HBV DNA杂交信号阳性(蓝色)的胞浆内同时表达HBsAg(棕色)。 HBV DNA原位杂交-HBsAg免疫组织化学双标记 ×400
注：1、2、8、10及14为病例序号；R及U分别为经及未经
EcoRI酶切的HBV DNA杂交信号，CR、CU为对照病例，图左为经Hind III酶切的λDNA标准碱基对长度
, 百拇医药
图5 HBV DNA Southern印迹杂交分析
讨论
匈牙利学者Nagy等[8]首先报道了32例IgA肾病患者，血清HBsAg阳性率为16%，远高于当地正常人群 (0.99%)。香港地区Lai等[9]也作了类似报道，并在21例患者的肾组织中有12例测得HBAg，其中6例用biotin标记HBV DNA探针作原位分子杂交，证实有HBV DNA存在[1]。我们以往的研究发现本病肾组织HBAg的阳性率为18.9%，我们在5例HBAg阳性者中用Digoxigenin标记探针作原位杂交，证实4例有HBV DNA[10]。上述结果提示，HBV 感染与IgA肾病可能存在着病因学上的关系，但由于以往的观察零散，病例不多，缺乏病理、免疫病理、分子病理等多方面的横向综合研究和验证，因而尚难确切回答有些IgA肾病的发生是否的确与HBV感染有关，HBV是否直接感染肾组织，HBV DNA阳性的肾细胞能否表达相关抗原(HBAg)，亦即在肾组织能否原位合成HBAg，启动或加重免疫损伤。
, 百拇医药
在本组资料中我们发现各种亚型IgA肾病均可有HBAg的沉积，组间阳性率差异无显著意义。HBsAg的阳性率在肾小球高于肾小管。而HBcAg的阳性率则肾小管高于肾小球。理论上来讲，肾组织内HBAg的来源有3种可能性：血循环来源(肝源性)；肾组织原位合成(肾源性)；血循环来源和肾组织原位合成 (肝源性+肾源性)。由于HBcAg为细胞内抗原，一般仅在细胞受损时，才从细胞内释放出来[7]，所以，肾小管上皮细胞内HBcAg的存在难以用血循环抗原或抗原抗体免疫复合物的沉积或阳性原尿的重吸收加以解释。原位杂交结果表明IgA肾病肾组织HBV DNA阳性率达43% (39/91)，而在所有39例HBV DNA阳性病例中，肾小管均阳性(100%)，肾小球阳性为35例(90%)。肾组织HBAg的阳性率与HBV DNA的存在密切相关。应用原位杂交与免疫组织化学双标记技术发现肾组织，尤其是肾小管上皮细胞，由于胞浆丰富，易于观察，可明确看到HBV DNA阳性细胞内有HBAg的表达，表明相当一部分IgA肾病的肾组织，的确可以感染HBV并原位合成HBAg。已有的Southern印迹杂交研究发现HBV DNA的存在可以是游离型或整合型，前者又包括复制型和非复制型。游离非复制型的出现，表明HBV DNA存在于细胞染色体外，仅显示3.2 kb的单一条带[11]；游离复制型则除了有3.2 kb条带外，还伴有小于3.2 kb HBV复制中间体的多个条带。整合型由于HBV DNA整个基因或其基因片段随机整合到宿主染色体DNA内，故未经酶切时显示高相对分子质量的大片段DNA(>40kb)，经过酶切后，由于随机整合片段长短不一，故显示不均一性条带(4.3～23.7 kb)[7，10]。在我们作Southern印迹杂交检测的27例IgA肾病中，所有Southern印迹杂交阳性病例均显示为整合型，从而排除了标本中血循环HBV DNA污染的可能[7]。然而，这部分整合型HBV DNA在感染的肾细胞内能否进一步表达HBAg抑或仅呈潜隐携带状态则取决于整合后的HBV基因片段是否完整以及整合区是否能够提供与病毒基因相匹配的表达元件等。因此，本组资料部分HBV DNA原位杂交阳性的肾组织内HBcAg或(和)HBsAg免疫组织化学染色可表现为阴性反应。我们发现Southern印迹杂交阳性的病例，肾组织HBV DNA原位杂交及HBAg免疫组织化学可以是阳性或阴性，Southern印迹杂交阴性的病例，肾组织HBV DNA原位杂交及HBcAg免疫组织化学均为阴性反应，提示Southern印迹杂交能敏感地反映肾组织内HBV的有无以及HBV DNA的存在状态。HBV DNA原位杂交以及HBcAg免疫组化检测亦能较好地反映出肾组织内HBV的感染状况。至于在HBV DNA阴性组中有部分病例出现HBAg的原因，认为除了肾组织HBV DNA含量较少难以测出外，肾小球上沉积的HBAg，尤其是HBsAg很可能象传统认为的那样仍主要来源于血循环。此时，肾小管上皮内的HBsAg则可能与带有HBsAg原尿的重吸收有关，部分病例肾小管腔内蛋白管型HBsAg阳性以及近曲小管刷状缘或胞浆顶部HBsAg特深的阳性着色，为这一推测提供了间接佐证。
, 百拇医药
我们可以认为我国上海地区部分IgA肾病患者的肾组织有HBV感染，肾组织内的HBAg除来源于血循环外，也可来源于肾组织感染HBV后的原位表达。受损肾组织释出的HBsAg可以诱发以T淋巴细胞为主的单个核细胞浸润，继而导致IgA肾病明显的肾小管-间质损伤[12]，成为IgA肾病病程迁延不愈的免疫病理基础。
注释：本课题为国家自然科学基金资助项目(39770292)
参考文献
1 Lai KN, Lai FM, Tam JS, et al. Strong association between IgA nephropathy and
hepatitis B surface anti-genemia in endemic area. Clin Nephrol, 1988，29:229-234.
, http://www.100md.com
2 Lai KN, Lai FM., Tam JS. IgA nephropathy associated with chronic hepatitis B virus
infection in adults: the pathogenetic of HBsAg. J Pathol, 1989，157:321-327.
3 汪年松，吴兆龙，张月娥，等. IgA肾病是否与乙型肝炎病毒有关? 中华肾脏病杂志，1996，12:276-278.
4 朱建民. 原发性IgA肾病的现状.中华肾脏病杂志，1992，8:309-311.
5 马学玲，杜卫东，阎惠平，等. 地高辛标记HBV DNA探针原位分子杂交技术.临床实验病理学
杂志， 1996, 12:84-85.
, 百拇医药
6 马学玲，张秀荣，杜卫东，等. IgA肾病肾组织 HBV DNA和HBAg双标记技术.上海医科大学学
报，1997, 24:293-294.
7 方利君，张月娥，顾建人，等.小儿乙肝病毒相关性肾炎肾组织中乙型肝炎病毒DNA的存在状
态.中华肾脏病杂志，1992, 8:65-67.
8 Nagy J, Baitai G, Brasch H, et al. The role of hepatitis B surface antigen in the
pathogenesis of glomerulopaties. Clin Nephrology, 1979, 12:109-116.
, http://www.100md.com 9 Lai KN, Lai FM, Chan KW, et al. Clinico-pathologic features of hepatitis B
virus-associated glomerulonephritis. Q J Med, 1987, 63:323-333.
10 Zhang Yue-e, Ma Xueling, Fang Lijun, et al. The existence and significence of
hepatitis B virus DNA in glomerulonephritis. Nephrology, 1996, 2:119-125.
11 Yoffe B, Noonon CA, Melnick JL, et al. Hepatitis B virus DNA in mononuclear cells
analysis of cell subsets for presence of replicative intermediates of viral DNA.
J Infect Dis, 1986, 153:471-477.
12 马学玲，张月娥，方利君，等.HBV感染与IgA肾病肾小管-间质病变的关系.中华病理学杂志，1998，27：269-272.
收稿:1998-12-24 修回:1999-02-15, http://www.100md.com