用差别显示法寻找细胞凋亡的相关基因
作者：王广庆 李学义 陈玉林 夏照帆 周光炎 李宁丽 方之扬
单位：200433 上海，第二军医大学长海医院烧伤中心(王广庆、李学义、陈玉林、夏照帆、方之扬)，上海市免疫学研究所(周光炎、李宁丽)
关键词：基因；U937；脱噬作用；差别显示
中华医学杂志NATIONAL MEDICAL JOURNAL OF CHINA1999年 第6期 1999 【摘要】 目的 寻找参与细胞凋亡的相关基因。方法 天花粉蛋白诱导U937细胞凋亡后，用锚定引物和随机引物进行差别显示PCR ，回收差异条带，进行RNA点杂交。用细胞凋亡时高表达的差异片段筛选胎肝cDNA库，阳性克隆测序，并与凋亡细胞RNA 行Northern 杂交。结果 用细胞凋亡时高表达的差异片段筛选胎肝cDNA文库，获得一个1.4 kb 的cDNA克隆，该cDNA序列中部分碱基与人Bruton酪氨酸激酶高度同源。用1.4 kb cDNA进行Northern杂交证实该基因在细胞中有三个转录本存在，其中0.7 kb 的mRNA 在凋亡细胞中高表达。结论 用差别显示法结合cDNA文库筛选,寻找到1.4 kb的cDNA片段，部分序列与Bruton酪氨酸激酶高度同源，是与细胞凋亡有关的新基因的部分片段。
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cDNA cloning of a novel gene related to apoptosis by differential display RT-PCR
WANG Guangqing, LI Xueyi, CHEN Yulin, et al. Burn Center,Changhai Hospital, Second Military Medical University,Shanghai 200433,China
【Abstract】 Objective To search for the novel gene related to apoptosis. Methods The mRNA expression patterns of U937 cells treated with or without trichosanthin were compared with differential display RT-PCR. The cDNA,which was highly expressed in the apoptosis cells ,was used as a probe to screen the human fetal liver cDNA library. Results A 1.4 kb cDNA segment was the partial sequence of a novel gene related to apoptosis. The result of Northern blot showed three bands in the apoptosis cells. Some sequence of the 1.4 kb cDNA was homology to Bruton's tyrosine kinase. Conclusion A partial cDNA of a new gene related to apoptosis was found.
, 百拇医药
【Key words】 Gene U937 Apoptosis Differential display
(Natl Med J China, 1999, 79：463-465)
细胞凋亡是受基因调控的。细胞凋亡的过程可以分为三个阶段:(1)外在因素(如辐射,缺血,药物等)作用于细胞启动信号转导途径;(2)信号转导过程中启动基因转录合成与细胞凋亡相关的基因;(3)导致细胞凋亡的效应分子被激活[1]。近年来,这些与细胞凋亡有关的基因不断被发现。然而，与细胞凋亡有关的问题还远没有解决，有许多基因的一级结构已经知道，但是不清楚是否与细胞凋亡有关，更不知道起什么样的作用。有许多基因的序列结构也不清楚。因此，要了解细胞凋亡的机制，必须从基因水平入手进行研究。 Liang等[2]发明的差别显示方法，分析不同状态细胞的基因表达形式有许多优越性。为了寻找与细胞凋亡有关的基因，作者以天花粉蛋白诱导U937细胞凋亡，用DDRT-PCR方法对凋亡和未凋亡细胞基因的差异表达进行了研究。
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材料和方法
一、主要菌种和试剂
大肠杆菌(DH5α，TG1，Y1090)由长海医院烧伤中心保存。限制性内切酶SacII、PstI、DNA 连接酶、DNA聚合酶、dNTP、T 载体、均购自Promega公司。缺口平移试剂盒、逆转录试剂盒为Gibco产品。RNA抽提试剂盒为Qiagen产品。
二、总RNA抽提和差异表达的cDNA片段分离
人U937细胞培养于含10%小牛血清的RPMI 1640中。凋亡组，用天花粉蛋白(50 μg/ml)刺激24小时，抽提DNA证实形成凋亡细胞特有的条带。收集天花粉蛋白处理的细胞和未处理的细胞5×106，用总RNA抽提试剂盒提取总RNA。以总RNA作为合成第一链cDNA 的模板，T11G、T11C、T11A作为锚定引物合成cDNA。然后，在6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，负压烘干，放射自显影18～24小时。从凝胶上切下表达有差异的条带，进行 PCR反应。扩增产物克隆于T载体。
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三、点杂交和cDNA文库筛选
取凋亡和未凋亡细胞RNA各5 μg点于Hybond膜，经紫外线(波长254nm)照射4分钟后固定。用PCR方法对差异条带进行标记，在甲酰胺体系中杂交 ，随后洗膜，放射自显影。稀释的胎肝cDNA文库，倍比稀释，使每块平皿的噬菌体克隆数在500～800个之间。经转膜、变性、中和、漂洗，在滤纸上凉干，80℃烤膜2小时，备用。
四、 Northern杂交分析、测序及DNA序列的同源性分析
将20 μg来源于凋亡和未凋亡细胞的总RNA，在含甲醛的1%琼脂糖凝胶上电泳，转移到Hybond膜上，经紫外线固定后备用。用缺口平移法标记从cDNA文库中得到的cDNA片段。预杂交和杂交后，按常规方法洗膜。
从文库中克隆到的噬菌体重新连接到T载体上进行自动测序。核苷酸序列经Gen-bank查新。
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结 果
一、凋亡相关基因的分离
用T11A、T11C、T11G 作为锚定引物，Ap1-Ap9 作为随机引物，进行PCR 反应，反应产物经电泳后放射自显影，将差异条带回收扩增，克隆于T载体，以回收的cDNA片段作为探针，与总RNA作点杂交。其中一条cDNA片段被证实在凋亡细胞中高表达。
二、cDNA文库的筛选，序列测定和查新分析
用差异表达的cDNA片段作探针，筛选胎肝cDNA文库获得阳性克隆，将此克隆用噬菌体扩增引物扩增后，克隆于T载体。用自动测序仪测序。此片段全长 1.4 kb 。将该cDNA序列与Genbank 中已知基因对比，未发现完全相同的序列，该片段中部分碱基与人Bruton's 酪氨酸激酶同源性达到78.2%，基因库登录号: AF035364。
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三、 点杂交、Northern 杂交结果
用1.4 kb 片段作为探针与凋亡细胞总RNA进行点杂交和Northern杂交，显示，该片段在凋亡细胞中高表达(图1)；在组织中有不同剪接方式，用天花粉蛋白处理的U937细胞共存在有三个转录本，分别是6.0 kb,2.4 kb，0.7 kb。
讨 论
差别显示是一种研究不同组织或细胞基因表达差异的有效方法。其主要优点是只需要少量模板就可以寻找到许多有差异的基因片段，为进一步寻找差异表达的基因提供依据。由于PCR反应高度敏感，用该方法得到的差异片段假阳性率比较高，用差异片段进行 Northern 杂交不容易获得阳性结果。用点杂交的方法鉴别差异片段，收到了相似的效果。用差异片段进行 cDNA库筛选获得一个阳性克隆。一般情况下用从细胞中得到的差异片段去筛选相应的cDNA 文库，由于建立文库需要一定的时间，我们用已经建立的胎肝cDNA 库进行筛选。因为，胎儿肝组织代谢旺盛，细胞发生凋亡的机率高，组织中存在着细胞凋亡的相关基因。但是，也应该认识到毕竟正常细胞生理状态下发生的凋亡与病理细胞在药物诱导下发生的凋亡存在着不同。
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1是正常U937细胞，2是用天花粉蛋白处理的U937细胞
图1 用1.4 kb cDNA片段进行点杂交的结果
天花粉蛋白是从中药栝楼中提取的有效成分，在临床上被应用于引产，抗肿瘤和爱滋病治疗，它能够抑制核糖体蛋白质的合成[3]。近来发现，天花粉蛋白可以诱发人正常淋巴细胞和肿瘤细胞发生凋亡[4，5]，用差别显示的方法证实天花粉蛋白能使U937细胞基因的表达形式发生变化。用寻找到的 1.4 kb cDNA片段与天花粉蛋白诱导 U937凋亡的细胞总RNA进行Northern杂交，发现该基因在凋亡细胞中有三个转录本，其中有一个转录本仅在凋亡细胞中高表达。将1.4 kb cDNA片段与基因库中已知基因进行比较，发现该cDNA 部分碱基与人酪氨酸激酶部分编码区基因序列高度同源。Bruton's酪氨酸激酶是蛋白质酪氨酸激酶家族的一个成员，它参与细胞凋亡的发生过程[6]，这进一步证实我们找到的cDNA 片段与细胞凋亡有关。
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注释：本课题为上海市医学领先专业专项基金资助项目
参考文献
1 Wyllie AH. Apoptosis:an overview. British Medical Bulletin ，1997，53:451-465.
2 Liang P,Pardee AB. Differntial display of eukaryotic messenger RNA by means
of the polymerase chain reaction . Science ，1992，257:967-971.
3 王庆诚，张振范，王谨，等.天花粉蛋白及其抗体复合物对蛋白质合成的抑制作用.实验生物学
, 百拇医药 报, 1987,20：515-519.
4 李宁丽，郑泽铣，沈佰华，等. 天花粉蛋白诱发人体淋巴细胞发生凋亡. 中国免疫学杂志
1995,11(增刊)：539-542.
5 王福安，张学庸，黎松.天花粉蛋白免疫毒素对靶细胞凋亡的作用.中华微生物和免疫学杂志,1995,15：131-133.
6 Uckun FM, Waddick KG, Mahajan S, et al. BTK as a mediator of radiation-mediated
apoptosis in DT-40 lymphoma B cells. Science ,1996，273:1096-1100.
收稿：1998-06-24 修回：1999-02-26, http://www.100md.com
单位：200433 上海，第二军医大学长海医院烧伤中心(王广庆、李学义、陈玉林、夏照帆、方之扬)，上海市免疫学研究所(周光炎、李宁丽)
关键词：基因；U937；脱噬作用；差别显示
中华医学杂志NATIONAL MEDICAL JOURNAL OF CHINA1999年 第6期 1999 【摘要】 目的 寻找参与细胞凋亡的相关基因。方法 天花粉蛋白诱导U937细胞凋亡后，用锚定引物和随机引物进行差别显示PCR ，回收差异条带，进行RNA点杂交。用细胞凋亡时高表达的差异片段筛选胎肝cDNA库，阳性克隆测序，并与凋亡细胞RNA 行Northern 杂交。结果 用细胞凋亡时高表达的差异片段筛选胎肝cDNA文库，获得一个1.4 kb 的cDNA克隆，该cDNA序列中部分碱基与人Bruton酪氨酸激酶高度同源。用1.4 kb cDNA进行Northern杂交证实该基因在细胞中有三个转录本存在，其中0.7 kb 的mRNA 在凋亡细胞中高表达。结论 用差别显示法结合cDNA文库筛选,寻找到1.4 kb的cDNA片段，部分序列与Bruton酪氨酸激酶高度同源，是与细胞凋亡有关的新基因的部分片段。
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cDNA cloning of a novel gene related to apoptosis by differential display RT-PCR
WANG Guangqing, LI Xueyi, CHEN Yulin, et al. Burn Center,Changhai Hospital, Second Military Medical University,Shanghai 200433,China
【Abstract】 Objective To search for the novel gene related to apoptosis. Methods The mRNA expression patterns of U937 cells treated with or without trichosanthin were compared with differential display RT-PCR. The cDNA,which was highly expressed in the apoptosis cells ,was used as a probe to screen the human fetal liver cDNA library. Results A 1.4 kb cDNA segment was the partial sequence of a novel gene related to apoptosis. The result of Northern blot showed three bands in the apoptosis cells. Some sequence of the 1.4 kb cDNA was homology to Bruton's tyrosine kinase. Conclusion A partial cDNA of a new gene related to apoptosis was found.
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【Key words】 Gene U937 Apoptosis Differential display
(Natl Med J China, 1999, 79：463-465)
细胞凋亡是受基因调控的。细胞凋亡的过程可以分为三个阶段:(1)外在因素(如辐射,缺血,药物等)作用于细胞启动信号转导途径;(2)信号转导过程中启动基因转录合成与细胞凋亡相关的基因;(3)导致细胞凋亡的效应分子被激活[1]。近年来,这些与细胞凋亡有关的基因不断被发现。然而，与细胞凋亡有关的问题还远没有解决，有许多基因的一级结构已经知道，但是不清楚是否与细胞凋亡有关，更不知道起什么样的作用。有许多基因的序列结构也不清楚。因此，要了解细胞凋亡的机制，必须从基因水平入手进行研究。 Liang等[2]发明的差别显示方法，分析不同状态细胞的基因表达形式有许多优越性。为了寻找与细胞凋亡有关的基因，作者以天花粉蛋白诱导U937细胞凋亡，用DDRT-PCR方法对凋亡和未凋亡细胞基因的差异表达进行了研究。
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材料和方法
一、主要菌种和试剂
大肠杆菌(DH5α，TG1，Y1090)由长海医院烧伤中心保存。限制性内切酶SacII、PstI、DNA 连接酶、DNA聚合酶、dNTP、T 载体、均购自Promega公司。缺口平移试剂盒、逆转录试剂盒为Gibco产品。RNA抽提试剂盒为Qiagen产品。
二、总RNA抽提和差异表达的cDNA片段分离
人U937细胞培养于含10%小牛血清的RPMI 1640中。凋亡组，用天花粉蛋白(50 μg/ml)刺激24小时，抽提DNA证实形成凋亡细胞特有的条带。收集天花粉蛋白处理的细胞和未处理的细胞5×106，用总RNA抽提试剂盒提取总RNA。以总RNA作为合成第一链cDNA 的模板，T11G、T11C、T11A作为锚定引物合成cDNA。然后，在6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，负压烘干，放射自显影18～24小时。从凝胶上切下表达有差异的条带，进行 PCR反应。扩增产物克隆于T载体。
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三、点杂交和cDNA文库筛选
取凋亡和未凋亡细胞RNA各5 μg点于Hybond膜，经紫外线(波长254nm)照射4分钟后固定。用PCR方法对差异条带进行标记，在甲酰胺体系中杂交 ，随后洗膜，放射自显影。稀释的胎肝cDNA文库，倍比稀释，使每块平皿的噬菌体克隆数在500～800个之间。经转膜、变性、中和、漂洗，在滤纸上凉干，80℃烤膜2小时，备用。
四、 Northern杂交分析、测序及DNA序列的同源性分析
将20 μg来源于凋亡和未凋亡细胞的总RNA，在含甲醛的1%琼脂糖凝胶上电泳，转移到Hybond膜上，经紫外线固定后备用。用缺口平移法标记从cDNA文库中得到的cDNA片段。预杂交和杂交后，按常规方法洗膜。
从文库中克隆到的噬菌体重新连接到T载体上进行自动测序。核苷酸序列经Gen-bank查新。
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结 果
一、凋亡相关基因的分离
用T11A、T11C、T11G 作为锚定引物，Ap1-Ap9 作为随机引物，进行PCR 反应，反应产物经电泳后放射自显影，将差异条带回收扩增，克隆于T载体，以回收的cDNA片段作为探针，与总RNA作点杂交。其中一条cDNA片段被证实在凋亡细胞中高表达。
二、cDNA文库的筛选，序列测定和查新分析
用差异表达的cDNA片段作探针，筛选胎肝cDNA文库获得阳性克隆，将此克隆用噬菌体扩增引物扩增后，克隆于T载体。用自动测序仪测序。此片段全长 1.4 kb 。将该cDNA序列与Genbank 中已知基因对比，未发现完全相同的序列，该片段中部分碱基与人Bruton's 酪氨酸激酶同源性达到78.2%，基因库登录号: AF035364。
, 百拇医药
三、 点杂交、Northern 杂交结果
用1.4 kb 片段作为探针与凋亡细胞总RNA进行点杂交和Northern杂交，显示，该片段在凋亡细胞中高表达(图1)；在组织中有不同剪接方式，用天花粉蛋白处理的U937细胞共存在有三个转录本，分别是6.0 kb,2.4 kb，0.7 kb。
讨 论
差别显示是一种研究不同组织或细胞基因表达差异的有效方法。其主要优点是只需要少量模板就可以寻找到许多有差异的基因片段，为进一步寻找差异表达的基因提供依据。由于PCR反应高度敏感，用该方法得到的差异片段假阳性率比较高，用差异片段进行 Northern 杂交不容易获得阳性结果。用点杂交的方法鉴别差异片段，收到了相似的效果。用差异片段进行 cDNA库筛选获得一个阳性克隆。一般情况下用从细胞中得到的差异片段去筛选相应的cDNA 文库，由于建立文库需要一定的时间，我们用已经建立的胎肝cDNA 库进行筛选。因为，胎儿肝组织代谢旺盛，细胞发生凋亡的机率高，组织中存在着细胞凋亡的相关基因。但是，也应该认识到毕竟正常细胞生理状态下发生的凋亡与病理细胞在药物诱导下发生的凋亡存在着不同。
, http://www.100md.com
1是正常U937细胞，2是用天花粉蛋白处理的U937细胞
图1 用1.4 kb cDNA片段进行点杂交的结果
天花粉蛋白是从中药栝楼中提取的有效成分，在临床上被应用于引产，抗肿瘤和爱滋病治疗，它能够抑制核糖体蛋白质的合成[3]。近来发现，天花粉蛋白可以诱发人正常淋巴细胞和肿瘤细胞发生凋亡[4，5]，用差别显示的方法证实天花粉蛋白能使U937细胞基因的表达形式发生变化。用寻找到的 1.4 kb cDNA片段与天花粉蛋白诱导 U937凋亡的细胞总RNA进行Northern杂交，发现该基因在凋亡细胞中有三个转录本，其中有一个转录本仅在凋亡细胞中高表达。将1.4 kb cDNA片段与基因库中已知基因进行比较，发现该cDNA 部分碱基与人酪氨酸激酶部分编码区基因序列高度同源。Bruton's酪氨酸激酶是蛋白质酪氨酸激酶家族的一个成员，它参与细胞凋亡的发生过程[6]，这进一步证实我们找到的cDNA 片段与细胞凋亡有关。
, http://www.100md.com
注释：本课题为上海市医学领先专业专项基金资助项目
参考文献
1 Wyllie AH. Apoptosis:an overview. British Medical Bulletin ，1997，53:451-465.
2 Liang P,Pardee AB. Differntial display of eukaryotic messenger RNA by means
of the polymerase chain reaction . Science ，1992，257:967-971.
3 王庆诚，张振范，王谨，等.天花粉蛋白及其抗体复合物对蛋白质合成的抑制作用.实验生物学
, 百拇医药 报, 1987,20：515-519.
4 李宁丽，郑泽铣，沈佰华，等. 天花粉蛋白诱发人体淋巴细胞发生凋亡. 中国免疫学杂志
1995,11(增刊)：539-542.
5 王福安，张学庸，黎松.天花粉蛋白免疫毒素对靶细胞凋亡的作用.中华微生物和免疫学杂志,1995,15：131-133.
6 Uckun FM, Waddick KG, Mahajan S, et al. BTK as a mediator of radiation-mediated
apoptosis in DT-40 lymphoma B cells. Science ,1996，273:1096-1100.
收稿：1998-06-24 修回：1999-02-26, http://www.100md.com