三氧化二砷诱导血液肿瘤细胞凋亡的机制研究
作者：蔡循 陈国强 贾培敏 沈玉雷 黄莺 陈赛娟 王振义 陈竺
单位：200025 上海第二医科大学附属瑞金医院上海血液学研究所(蔡循、 陈国强、 贾培敏、 沈玉雷、 陈赛娟、 王振义、 陈竺)；上海第二医科大学生物学教研室(黄莺)
关键词：氧化砷；细胞脱噬；白血病；线粒体
中华医学杂志NATIONAL MEDICAL JOURNAL OF CHINA1999年 第6期 1999 【摘要】 目的 了解三氧化二砷(As2O3)诱导的细胞凋亡是否与线粒体跨膜电位(ΔΨm)改变有关及其可能机制。方法 以急性早幼粒细胞性白血病(APL)细胞系NB4、慢性淋巴细胞性白血病细胞系SKW-3、Burkitt's 淋巴瘤细胞系Namalwa及其它2个急性髓性白血病细胞系HL-60和U937为体外模型,应用碘化丙啶(PI)/Rhodamine123(Rh123)双重染色检测ΔΨm，通过测定细胞活力、亚G1期细胞含量和基因组DNA凝胶电泳及形态学观察等鉴定细胞凋亡。此外，还测定了细胞内丙二醛(MDA)的含量。结果 As2O3可明显诱导线粒体ΔΨm下降。巯基还原剂—二巯基苏糖醇(DTT)显著抑制As2O3诱导的ΔΨm 下降。在1 μmol/L As2O3处理48小时的NB4细胞，PI-Rh123-细胞达(16.0±2.5)%，当DTT同时处理时，PI-Rh123-细胞和凋亡细胞数分别降至(2.9±0.2)%和(1.8±0.3)%。As2O3也明显诱导NB4细胞和SKW-3细胞产生MDA[分别为(0.479±0.044) nmol/106,(0.168±0.018) nmol/105]，但该效应不被DTT抑制。结论 线粒体ΔΨm下降是As2O3诱导细胞凋亡的关键环节,而其机制可能与巯基氧化有关；活性氧类参与As2O3诱导的细胞凋亡，但不是主要环节。
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The mechanisms of arsenic trioxide-induced apoptosis in hematopoietic malignant cells CAI Xun, CHEN Guoqiang, JIA Peimin, et al. Shanghai Institute of Hematology, Rui-Jin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025
【Abstract】 Objective To understand if arsenic trioxide (As2O3) is related to the alteration of mitochondrial transmembrane potentials (ΔΨm) and its possible mechanisms. Methods Acute promyelocytic leukemia (APL) cell line NB4、 chronic lymphoblastic leukemia (CLL) cell line SKW-3、Burkitt's lymphoma cell line Namalwa and other acute myeloid leukemia cell lines HL-60 and U937 were used as in vitro models. The ΔΨm was detected by the double staining of propidium iodide (PI) and Rhodamine 123(Rh123), while apoptosis was confirmed by cell viability, sub-G1 cell content as well as gel electrophoresis of genomic DNA and morphological observation . In addition, cellular content of malondialdehyde (MDA) was detected. Results In the cells sensitive to As2O3-induced apoptosis, the ΔΨm was disrupted with As2O3 treatment. The disulfide-bond reducing agent dithiothreitol (DTT) significantly blocked As2O3-induced ΔΨm collapse and apoptosis. For example, with 1 μmol/L As2O3 treatment for 48 hours, PI-Rh123- cells was increased to (16.0±2.5)%, and DTT simultaneous treatment reduced PI-Rh123- cells and apoptotic cells to (2.9±0.2)%, and (1.8±0.3)%, respectively. On the other hand, As2O3 also significantly induced MDA production in NB4(0.479±0.044, P<0.01) and SKW-3 (0.168±0.018) nmol/L, P<0.01)cells, whereas the effect could not be blocked by DTT. Conclusions The disruption of the ΔΨm is the key event of As2O3-induced apoptosis, and the essential mechanisms may be related to the oxidation of thiols; the reactive oxygen species are involved with apoptosis induced by As2O3, but they are not the main points.
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【Key words】 Arsenic trioxide Apoptosis Leukemia Mitochondrium
(Natl Med J China, 1999, 79：452-455)
近几年来，我国学者报道持续静脉输注三氧化二砷As2O3可诱导急性早幼粒细胞性白血病(APL)病人达完全缓解[1] 。体内外研究显示As2O3能诱导APL细胞凋亡和部分分化[2，3]。最近研究，发现药理浓度的As2O3也能在一定程度上诱导某些恶性淋巴细胞和多发性骨髓瘤细胞凋亡，说明As2O3诱导凋亡的效应并不仅仅局限于APL细胞[4，5]。然而，有关As2O3诱导APL细胞凋亡的确切机制尚不清楚。
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最近的研究显示线粒体功能紊乱，尤其是线粒体跨膜电位(mitochondrial transmembrane potentials, ΔΨm)下降和/或线粒体膜通透性转运孔(mitochondrial permeability transition pores，MPT)开放是细胞凋亡发生的重要环节[6]。为了了解As2O3的诱导凋亡效应是否涉及线粒体ΔΨm的改变及其机制，本研究以APL细胞系NB4细胞和某些恶性淋巴细胞包括慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞系SKW-3、Burkitt's淋巴瘤细胞系Namalwa,以及HL-60与U937细胞系为体外模型，发现As2O3诱导细胞凋亡的同时也诱导线粒体ΔΨm下降，而二硫键还原剂二巯基苏糖醇(DTT)明显拮抗以上两种效应。同时，As2O3也明显诱导NB4细胞和SKW-3细胞产生丙二醛(MDA)，但该效应不被DTT抑制。
材料和方法
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1.制剂： 0.1% As2O3 (哈尔滨医科大学附属第一医院制备)以磷酸盐缓冲液(PBS)配制成浓度为50 μmol/L的储存液。DTT以乙酸钠配制成1 mol/L,于-20℃ 保存。
2.细胞培养、细胞活力和形态学观察： 本实验中所用细胞系均以2～3×105/ml的起始浓度接种于含10%的小牛血清的RPMI 1640 培养液中常规培养(37℃，5% CO2),并分别在处理后不同时间收集细胞用台盼蓝拒染法测定活细胞率。细胞经涂片仪(shandon)离心(800 r/min,5分钟)后瑞士蓝染色，光镜下观察。
3.流式细胞仪检测细胞ΔΨm和细胞DNA含量分布：106个细胞经PBS清洗两次，与10 μg/ml Rhodamine(Rh123) 在37℃共同孵育30分钟。PBS清洗两次, 加碘化丙啶(PI，10 μg/ml)染色后，经流式细胞仪检测其荧光强度。为检测细胞DNA含量分布，106细胞经质量浓度70%冷乙醇固定24小时以上，PBS清洗，加1%RNA酶37℃消化30分钟。 随后，加入PI(50μg/ml)染色，流式细胞仪测定DNA含量。
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4.基因组DNA凝胶电泳： 按文献[2]方法进行。
5.丙二醛(MDA)检测： 按文献[7]方法进行。
6.统计学分析：所有资料经LYSIS II软件(BECKON DICKSON产品)收集处理。 采用两组均数t检验。
结 果
1.As2O3诱导细胞线粒体跨膜电位下降：细胞以荧光染料PI和Rh123双重染色。其中，PI为膜非通透性DNA结合染料， Rh123是由线粒体吸收的阳离子亲脂染料，其摄取量与线粒体ΔΨm呈正相关。经流式细胞仪分析，可见3群细胞：即呈现完整细胞膜和“稳态” ΔΨm的活细胞(PI-Rh123+)、细胞膜完整但线粒体ΔΨm下降的凋亡细胞 (PI-Rh123-)和细胞膜与线粒体ΔΨm均受损的坏死细胞 (PI+Rh123-)。大多数未经As2O3处理的NB4细胞属于PI-Rh123+细胞， 即具有完整的细胞膜和“稳态” ΔΨm。然而，经1μmol/L As2O3处理48小时后，表现为 PI-Rh123-的细胞明显增加，提示在不影响细胞膜完整性的情况下，As2O3诱导NB4细胞线粒体ΔΨm下降。相应地，在1μmol/L As2O3处理的NB4细胞，细胞活力和亚G1期细胞也分别下降和增加(表1)，形态学观察可见凋亡细胞。
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同时测定了1～2 μmol/L As2O3处理的SKW-3、Namalwa、HL-60和U937细胞的ΔΨm和亚G1期细胞百分比，并观察形态学改变。 结果：(1)1 μmol/L As2O3不诱导HL-60和U937细胞的ΔΨm改变。相应地，也不诱导这些细胞凋亡；(2)0.1 μmol/L As2O3也不诱导NB4细胞ΔΨm下降和凋亡；(3)分别经2 μmol/L和1～2 μmol/L As2O3处理的Namalwa和SKW-3细胞呈现ΔΨm显著下降和细胞凋亡。
2. DTT对As2O3诱导的ΔΨm下降和凋亡的影响：0.2 mmol/L的DTT单独处理并不明显影响NB4细胞的ΔΨm和膜通透性，但它显著拮抗As2O3诱导的ΔΨm下降(表1)。相应地，DTT也明显抑制As2O3引起的细胞活力下降、sub-G1细胞增多(表1)及“梯子”样DNA电泳图谱的出现，提示DTT也抑制As2O3对这些细胞的诱导凋亡效应。相似的结果也在2 μmol/L As2O3处理的Namalwa细胞和1～2 μmol/L As2O3处理的SKW-3细胞中得到证实。
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表1 As2O3 (1 μmol/L)和DTT (0.2 mmol/L)对NB4细胞的影响(%，
±s) 组别
48小时
72小时
PIRh123细胞
活细胞率
亚G1期细胞
PIRh123细胞
活细胞率
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亚G1期细胞
对照
2.4±0.4
94.6±0.6
1.6±0.1
1.9±0.2
96.0±0.6
3.2±0.3
As2O3
16.0±2.5*
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68.9±3.9*
15.0±0.9*
16.3±0.2*
51.3±3.8*
22.0±0.9*
DTT
2.0±0.4
93.3±2.0
1.9±0.2
1.8±0.1
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91.6±0.6
3.1±0.3
As2O3+DTT
2.9±0.2△
90.7±1.7△
1.8±0.3△
2.2±0.2△
90.5±2.0△
3.1±0.4△
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与对照组比较* P<0.01；As2O3+DTT与As2O3组比较△P<0.01表2 As2O3(1 μmol/L)和DTT(0.2 mmol/L)诱导NB4细胞对MDA含量的影响(nmol/106,±s) 组别
MDA含量
6h
12h
24h
48h
对照组
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0.182±0.004
0.186±0.006
0.176±0.021
0.158±0.006
As2O3
0.205±0.001*
0.243±0.032*
0.406±0.019*
0.479±0.044*
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DTT
0.176±0.010
0.157±0.008*
0.173±0.007
0.145±0.048
As2O3+DTT
0.418±0.020*△
0.601±0.040*△
0.643±0.008*△
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注：与对照组比较*P<0.01；与As2O3组比较△ P<0.01
3.As2O3诱导MDA产生但不被DTT抑制：As2O3明显诱导NB4细胞产生MDA，并呈时间依赖性。MDA产生出现于As2O3处理后6小时，明显早于ΔΨm下降和凋亡(表2)。在2 μmol/L As2O3处理的SKW-3细胞， MDA的生成也明显增加。但是， 与NB4细胞比较，其出现的时间滞后(表3)。另一方面，无论在NB4或SKW-3细胞，0.2 mmol/L DTT不能阻抑As2O3诱导的MDA生成。
表3 As2O3(2 μmol/L)和DTT(0.2 mmol/L)诱导SKW-3细胞
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对MDA含量的影响(nmol/105,±s) 组别
MDA含量
12h
24h
48h
对照组
0.082±0.001
0.087±0.001
0.088±0.001
As2O3
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0.088±0.005*
0.099±0.004**
0.168±0.018**
DTT
0.080±0.007
0.076±0.011
0.081±0.002**
As2O3+DTT
0.089±0.006*
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0.120±0.004(**)/(△)
0.141±0.016**
与对照组比较*P<0.05，**P<0.01;与As2O3比较△P<0.05
讨 论
日益增加的资料表明，无论诱导因素和细胞类型，线粒体ΔΨm下降是细胞发生凋亡的重要机制。本组实验发现在1或2 μmol/L As2O3的处理下，NB4、Namalwa和SKW-3细胞均出现线粒体ΔΨm下降。与此同时，这些细胞也出现凋亡细胞的形态学和生物化学特点，如亚二倍体细胞和梯形DNA降解等。相反，1 μmol/L As2O3处理的HL-60与U937细胞与0.1 μmol/L As2O3处理的NB4细胞的线粒体ΔΨm不下降。正如我们和其他作者报道的，1或2 μmol/L As2O3并不能诱导这些细胞凋亡[2-5]。这些结果可能提示和其它凋亡刺激因子一样，线粒体ΔΨm下降是As2O3诱导细胞凋亡的重要环节。需指出的是，最近有作者报道As2O3也能诱导HL-60与U937细胞凋亡[8]。造成这种差异的原因可能与药物浓度和/或细胞株的变异有关。
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那么，As2O3是如何诱导细胞的ΔΨm下降的呢？早期研究认为，三价砷的主要毒性机制为它可以与蛋白巯基发生交联。本研究发现，二硫键还原剂DTT单独使用并不影响线粒体ΔΨm与细胞膜完整性，但它明显阻止As2O3诱导的细胞线粒体ΔΨm下降和细胞凋亡。据此，推测As2O3的诱导凋亡效应可能与巯基，尤其是二硫键的形成有关。另一方面，线粒体膜通透性转运孔，即位于线粒体内、外膜间的多蛋白复合体是形成线粒体ΔΨm主要因素，它的开放导致ΔΨm下降[6]。我们推测As2O3至少可能通过如下机制诱导线粒体ΔΨm下降和细胞凋亡：(1)诱导活性氧的产生。已知H2O2或某些诱导活性氧产生的氧应激剂如紫外线和X射线等可诱导细胞凋亡， 而抗氧化剂可拮抗多种刺激剂如HIV感染、生长因子剔除、无血清培养等诱导的细胞凋亡。大量事实表明活性氧是影响MPT开关的重要参数之一，而MPT开放也可促进活性氧生成[9]。Wang等[10]提出亚砷酸钠触发中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1凋亡的重要机制是诱导过氧化氢的生成和催化羟产生自由基。但是，DTT虽能拮抗氧化砷诱导的线粒体ΔΨm下降和细胞凋亡，但它并不能阻止As2O3诱导的MDA生成，这提示活性氧并不是As2O3诱导细胞凋亡的主要原因。(2)许多实验证明作为线粒体膜通透性转运孔的重要成员之一，腺苷酸转运蛋白分子中包含的两个相邻巯基对于控制线粒体膜通透性转运孔的开关十分重要。当它们以还原形式即游离状态存在时关闭。 反之，因二硫键的形成，PT孔开放。我们推测与腺苷酸转运蛋白结合， 并导致其结构中二硫键的形成可能是As2O3诱导急性白血病细胞线粒体ΔΨm下降和细胞凋亡的重要机制，但这有待于进一步证实。
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注释：本课题为国家杰出青年科学基金(39725011)、国家自然科学基金资助项目(39670329)和重点项目(39730270)、上海市青年科技启明星计划(96QB14021)和上海血液学研究所胡应洲基金部分资助项目
参考文献
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2 Chen GQ, Zhu J,Shi XG, et al. In vitro studies on cellular and mokcular
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10 Wang TS, Kuo CF, Jan KY, et al. Arsemite induces apoptosis in chinese hamster
ovary cells by generation of reactive oxygen species. J Cell Physio, 1996,169:256-268
收稿：1998-11-10 修回：1999-02-05), http://www.100md.com
单位：200025 上海第二医科大学附属瑞金医院上海血液学研究所(蔡循、 陈国强、 贾培敏、 沈玉雷、 陈赛娟、 王振义、 陈竺)；上海第二医科大学生物学教研室(黄莺)
关键词：氧化砷；细胞脱噬；白血病；线粒体
中华医学杂志NATIONAL MEDICAL JOURNAL OF CHINA1999年 第6期 1999 【摘要】 目的 了解三氧化二砷(As2O3)诱导的细胞凋亡是否与线粒体跨膜电位(ΔΨm)改变有关及其可能机制。方法 以急性早幼粒细胞性白血病(APL)细胞系NB4、慢性淋巴细胞性白血病细胞系SKW-3、Burkitt's 淋巴瘤细胞系Namalwa及其它2个急性髓性白血病细胞系HL-60和U937为体外模型,应用碘化丙啶(PI)/Rhodamine123(Rh123)双重染色检测ΔΨm，通过测定细胞活力、亚G1期细胞含量和基因组DNA凝胶电泳及形态学观察等鉴定细胞凋亡。此外，还测定了细胞内丙二醛(MDA)的含量。结果 As2O3可明显诱导线粒体ΔΨm下降。巯基还原剂—二巯基苏糖醇(DTT)显著抑制As2O3诱导的ΔΨm 下降。在1 μmol/L As2O3处理48小时的NB4细胞，PI-Rh123-细胞达(16.0±2.5)%，当DTT同时处理时，PI-Rh123-细胞和凋亡细胞数分别降至(2.9±0.2)%和(1.8±0.3)%。As2O3也明显诱导NB4细胞和SKW-3细胞产生MDA[分别为(0.479±0.044) nmol/106,(0.168±0.018) nmol/105]，但该效应不被DTT抑制。结论 线粒体ΔΨm下降是As2O3诱导细胞凋亡的关键环节,而其机制可能与巯基氧化有关；活性氧类参与As2O3诱导的细胞凋亡，但不是主要环节。
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【Abstract】 Objective To understand if arsenic trioxide (As2O3) is related to the alteration of mitochondrial transmembrane potentials (ΔΨm) and its possible mechanisms. Methods Acute promyelocytic leukemia (APL) cell line NB4、 chronic lymphoblastic leukemia (CLL) cell line SKW-3、Burkitt's lymphoma cell line Namalwa and other acute myeloid leukemia cell lines HL-60 and U937 were used as in vitro models. The ΔΨm was detected by the double staining of propidium iodide (PI) and Rhodamine 123(Rh123), while apoptosis was confirmed by cell viability, sub-G1 cell content as well as gel electrophoresis of genomic DNA and morphological observation . In addition, cellular content of malondialdehyde (MDA) was detected. Results In the cells sensitive to As2O3-induced apoptosis, the ΔΨm was disrupted with As2O3 treatment. The disulfide-bond reducing agent dithiothreitol (DTT) significantly blocked As2O3-induced ΔΨm collapse and apoptosis. For example, with 1 μmol/L As2O3 treatment for 48 hours, PI-Rh123- cells was increased to (16.0±2.5)%, and DTT simultaneous treatment reduced PI-Rh123- cells and apoptotic cells to (2.9±0.2)%, and (1.8±0.3)%, respectively. On the other hand, As2O3 also significantly induced MDA production in NB4(0.479±0.044, P<0.01) and SKW-3 (0.168±0.018) nmol/L, P<0.01)cells, whereas the effect could not be blocked by DTT. Conclusions The disruption of the ΔΨm is the key event of As2O3-induced apoptosis, and the essential mechanisms may be related to the oxidation of thiols; the reactive oxygen species are involved with apoptosis induced by As2O3, but they are not the main points.
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【Key words】 Arsenic trioxide Apoptosis Leukemia Mitochondrium
(Natl Med J China, 1999, 79：452-455)
近几年来，我国学者报道持续静脉输注三氧化二砷As2O3可诱导急性早幼粒细胞性白血病(APL)病人达完全缓解[1] 。体内外研究显示As2O3能诱导APL细胞凋亡和部分分化[2，3]。最近研究，发现药理浓度的As2O3也能在一定程度上诱导某些恶性淋巴细胞和多发性骨髓瘤细胞凋亡，说明As2O3诱导凋亡的效应并不仅仅局限于APL细胞[4，5]。然而，有关As2O3诱导APL细胞凋亡的确切机制尚不清楚。
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最近的研究显示线粒体功能紊乱，尤其是线粒体跨膜电位(mitochondrial transmembrane potentials, ΔΨm)下降和/或线粒体膜通透性转运孔(mitochondrial permeability transition pores，MPT)开放是细胞凋亡发生的重要环节[6]。为了了解As2O3的诱导凋亡效应是否涉及线粒体ΔΨm的改变及其机制，本研究以APL细胞系NB4细胞和某些恶性淋巴细胞包括慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞系SKW-3、Burkitt's淋巴瘤细胞系Namalwa,以及HL-60与U937细胞系为体外模型，发现As2O3诱导细胞凋亡的同时也诱导线粒体ΔΨm下降，而二硫键还原剂二巯基苏糖醇(DTT)明显拮抗以上两种效应。同时，As2O3也明显诱导NB4细胞和SKW-3细胞产生丙二醛(MDA)，但该效应不被DTT抑制。
材料和方法
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1.制剂： 0.1% As2O3 (哈尔滨医科大学附属第一医院制备)以磷酸盐缓冲液(PBS)配制成浓度为50 μmol/L的储存液。DTT以乙酸钠配制成1 mol/L,于-20℃ 保存。
2.细胞培养、细胞活力和形态学观察： 本实验中所用细胞系均以2～3×105/ml的起始浓度接种于含10%的小牛血清的RPMI 1640 培养液中常规培养(37℃，5% CO2),并分别在处理后不同时间收集细胞用台盼蓝拒染法测定活细胞率。细胞经涂片仪(shandon)离心(800 r/min,5分钟)后瑞士蓝染色，光镜下观察。
3.流式细胞仪检测细胞ΔΨm和细胞DNA含量分布：106个细胞经PBS清洗两次，与10 μg/ml Rhodamine(Rh123) 在37℃共同孵育30分钟。PBS清洗两次, 加碘化丙啶(PI，10 μg/ml)染色后，经流式细胞仪检测其荧光强度。为检测细胞DNA含量分布，106细胞经质量浓度70%冷乙醇固定24小时以上，PBS清洗，加1%RNA酶37℃消化30分钟。 随后，加入PI(50μg/ml)染色，流式细胞仪测定DNA含量。
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4.基因组DNA凝胶电泳： 按文献[2]方法进行。
5.丙二醛(MDA)检测： 按文献[7]方法进行。
6.统计学分析：所有资料经LYSIS II软件(BECKON DICKSON产品)收集处理。 采用两组均数t检验。
结 果
1.As2O3诱导细胞线粒体跨膜电位下降：细胞以荧光染料PI和Rh123双重染色。其中，PI为膜非通透性DNA结合染料， Rh123是由线粒体吸收的阳离子亲脂染料，其摄取量与线粒体ΔΨm呈正相关。经流式细胞仪分析，可见3群细胞：即呈现完整细胞膜和“稳态” ΔΨm的活细胞(PI-Rh123+)、细胞膜完整但线粒体ΔΨm下降的凋亡细胞 (PI-Rh123-)和细胞膜与线粒体ΔΨm均受损的坏死细胞 (PI+Rh123-)。大多数未经As2O3处理的NB4细胞属于PI-Rh123+细胞， 即具有完整的细胞膜和“稳态” ΔΨm。然而，经1μmol/L As2O3处理48小时后，表现为 PI-Rh123-的细胞明显增加，提示在不影响细胞膜完整性的情况下，As2O3诱导NB4细胞线粒体ΔΨm下降。相应地，在1μmol/L As2O3处理的NB4细胞，细胞活力和亚G1期细胞也分别下降和增加(表1)，形态学观察可见凋亡细胞。
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同时测定了1～2 μmol/L As2O3处理的SKW-3、Namalwa、HL-60和U937细胞的ΔΨm和亚G1期细胞百分比，并观察形态学改变。 结果：(1)1 μmol/L As2O3不诱导HL-60和U937细胞的ΔΨm改变。相应地，也不诱导这些细胞凋亡；(2)0.1 μmol/L As2O3也不诱导NB4细胞ΔΨm下降和凋亡；(3)分别经2 μmol/L和1～2 μmol/L As2O3处理的Namalwa和SKW-3细胞呈现ΔΨm显著下降和细胞凋亡。
2. DTT对As2O3诱导的ΔΨm下降和凋亡的影响：0.2 mmol/L的DTT单独处理并不明显影响NB4细胞的ΔΨm和膜通透性，但它显著拮抗As2O3诱导的ΔΨm下降(表1)。相应地，DTT也明显抑制As2O3引起的细胞活力下降、sub-G1细胞增多(表1)及“梯子”样DNA电泳图谱的出现，提示DTT也抑制As2O3对这些细胞的诱导凋亡效应。相似的结果也在2 μmol/L As2O3处理的Namalwa细胞和1～2 μmol/L As2O3处理的SKW-3细胞中得到证实。
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表1 As2O3 (1 μmol/L)和DTT (0.2 mmol/L)对NB4细胞的影响(%，
±s) 组别48小时
72小时
PIRh123细胞
活细胞率
亚G1期细胞
PIRh123细胞
活细胞率
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亚G1期细胞
对照
2.4±0.4
94.6±0.6
1.6±0.1
1.9±0.2
96.0±0.6
3.2±0.3
As2O3
16.0±2.5*
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68.9±3.9*
15.0±0.9*
16.3±0.2*
51.3±3.8*
22.0±0.9*
DTT
2.0±0.4
93.3±2.0
1.9±0.2
1.8±0.1
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91.6±0.6
3.1±0.3
As2O3+DTT
2.9±0.2△
90.7±1.7△
1.8±0.3△
2.2±0.2△
90.5±2.0△
3.1±0.4△
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与对照组比较* P<0.01；As2O3+DTT与As2O3组比较△P<0.01表2 As2O3(1 μmol/L)和DTT(0.2 mmol/L)诱导NB4细胞对MDA含量的影响(nmol/106,
±s) 组别MDA含量
6h
12h
24h
48h
对照组
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0.182±0.004
0.186±0.006
0.176±0.021
0.158±0.006
As2O3
0.205±0.001*
0.243±0.032*
0.406±0.019*
0.479±0.044*
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DTT
0.176±0.010
0.157±0.008*
0.173±0.007
0.145±0.048
As2O3+DTT
0.418±0.020*△
0.601±0.040*△
0.643±0.008*△
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注：与对照组比较*P<0.01；与As2O3组比较△ P<0.01
3.As2O3诱导MDA产生但不被DTT抑制：As2O3明显诱导NB4细胞产生MDA，并呈时间依赖性。MDA产生出现于As2O3处理后6小时，明显早于ΔΨm下降和凋亡(表2)。在2 μmol/L As2O3处理的SKW-3细胞， MDA的生成也明显增加。但是， 与NB4细胞比较，其出现的时间滞后(表3)。另一方面，无论在NB4或SKW-3细胞，0.2 mmol/L DTT不能阻抑As2O3诱导的MDA生成。
表3 As2O3(2 μmol/L)和DTT(0.2 mmol/L)诱导SKW-3细胞
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对MDA含量的影响(nmol/105,
±s) 组别MDA含量
12h
24h
48h
对照组
0.082±0.001
0.087±0.001
0.088±0.001
As2O3
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0.088±0.005*
0.099±0.004**
0.168±0.018**
DTT
0.080±0.007
0.076±0.011
0.081±0.002**
As2O3+DTT
0.089±0.006*
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0.120±0.004(**)/(△)
0.141±0.016**
与对照组比较*P<0.05，**P<0.01;与As2O3比较△P<0.05
讨 论
日益增加的资料表明，无论诱导因素和细胞类型，线粒体ΔΨm下降是细胞发生凋亡的重要机制。本组实验发现在1或2 μmol/L As2O3的处理下，NB4、Namalwa和SKW-3细胞均出现线粒体ΔΨm下降。与此同时，这些细胞也出现凋亡细胞的形态学和生物化学特点，如亚二倍体细胞和梯形DNA降解等。相反，1 μmol/L As2O3处理的HL-60与U937细胞与0.1 μmol/L As2O3处理的NB4细胞的线粒体ΔΨm不下降。正如我们和其他作者报道的，1或2 μmol/L As2O3并不能诱导这些细胞凋亡[2-5]。这些结果可能提示和其它凋亡刺激因子一样，线粒体ΔΨm下降是As2O3诱导细胞凋亡的重要环节。需指出的是，最近有作者报道As2O3也能诱导HL-60与U937细胞凋亡[8]。造成这种差异的原因可能与药物浓度和/或细胞株的变异有关。
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那么，As2O3是如何诱导细胞的ΔΨm下降的呢？早期研究认为，三价砷的主要毒性机制为它可以与蛋白巯基发生交联。本研究发现，二硫键还原剂DTT单独使用并不影响线粒体ΔΨm与细胞膜完整性，但它明显阻止As2O3诱导的细胞线粒体ΔΨm下降和细胞凋亡。据此，推测As2O3的诱导凋亡效应可能与巯基，尤其是二硫键的形成有关。另一方面，线粒体膜通透性转运孔，即位于线粒体内、外膜间的多蛋白复合体是形成线粒体ΔΨm主要因素，它的开放导致ΔΨm下降[6]。我们推测As2O3至少可能通过如下机制诱导线粒体ΔΨm下降和细胞凋亡：(1)诱导活性氧的产生。已知H2O2或某些诱导活性氧产生的氧应激剂如紫外线和X射线等可诱导细胞凋亡， 而抗氧化剂可拮抗多种刺激剂如HIV感染、生长因子剔除、无血清培养等诱导的细胞凋亡。大量事实表明活性氧是影响MPT开关的重要参数之一，而MPT开放也可促进活性氧生成[9]。Wang等[10]提出亚砷酸钠触发中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1凋亡的重要机制是诱导过氧化氢的生成和催化羟产生自由基。但是，DTT虽能拮抗氧化砷诱导的线粒体ΔΨm下降和细胞凋亡，但它并不能阻止As2O3诱导的MDA生成，这提示活性氧并不是As2O3诱导细胞凋亡的主要原因。(2)许多实验证明作为线粒体膜通透性转运孔的重要成员之一，腺苷酸转运蛋白分子中包含的两个相邻巯基对于控制线粒体膜通透性转运孔的开关十分重要。当它们以还原形式即游离状态存在时关闭。 反之，因二硫键的形成，PT孔开放。我们推测与腺苷酸转运蛋白结合， 并导致其结构中二硫键的形成可能是As2O3诱导急性白血病细胞线粒体ΔΨm下降和细胞凋亡的重要机制，但这有待于进一步证实。
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注释：本课题为国家杰出青年科学基金(39725011)、国家自然科学基金资助项目(39670329)和重点项目(39730270)、上海市青年科技启明星计划(96QB14021)和上海血液学研究所胡应洲基金部分资助项目
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收稿：1998-11-10 修回：1999-02-05), http://www.100md.com