非霍奇金氏淋巴瘤骨髓微小病灶检测的临床意义
作者：肖若芝，周宇麒
单位：中山医科大学附属第三医院内科(广州，510630)
关键词：非霍奇金氏淋巴瘤；基因重排；微小病灶
癌症990623 【摘要】目的：探讨微小病灶在非霍奇金氏淋巴瘤中的检测对病人疗效、预后的影响。方法：采用PCR方法扩增T细胞受体γ链(TCRγ)和免疫球蛋白重链(IgH)基因重排，对13例骨髓形态学检查正常的T细胞非霍奇金氏淋巴瘤(T-NHL)和17例B细胞非霍奇金氏淋巴瘤(B-NHL)病人治疗前骨髓标本进行微小病灶(MRD)检测。结果：其中7例T-NHL病人发生TCRγ基因重排，检出率为53.8%，11例B-NHL病人发生IgH基因重排，检出率为64.8%。检出阳性的病人生存期明显低于检出阴性的病人(P<0.05)。结论：骨髓中微小病灶检测可以协助估计病人预后、指导治疗及判断疗效。
, http://www.100md.com
中图分类号：R557 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)06-0705-03
The clinical significance of detecting minimal residual disease in
non-Hodgkin’s lymphoma
XIAO Ruo-zhi，ZHOU Yu-qi
Department of Internal Medicine，Third Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University of Medical Sciences，Guangzhou 510630,P.R.China
【Abstract】 Objective：To analyze the significance of detecting minimal residual disease (MRD) in non-Hodgkin’s lymphoma. Methods：polymerase chain reaction (PCR) was used to amplify the T-cell receptor γ chain gene (TCRγ) in T cell non-Hodgkin’s lymphoma (T-NHL) and immunoglobulin gene rearrangements (IgH) in B cell non-Hodgkin’s lymphoma(B-NHL). Bone marrow specimens from 13 untreated patients of T-NHL with normal morphology and 17 patients of B-NHL were detected for MRD.Results：TCR γ rearrangement was shown in 7 patients with T-NHL and IgH rearrangement was shown in 11 patients with B-NHL.The incidence of MRD in bone marrow with T-NHL and B-NHL was 53.8% (7/13) and 64.8% (11/17) respectively. Patients with MRD had a shorter survival time than those without (P<0.05). Conclusion： The results showed that detection of MRD in bone marrow may provide some important information for assessing prognosis，directing treatment and judging curative effect.
, 百拇医药
Key words：non-Hodgkin’s lymphoma；Gene rearrangement；Minimal residual disease
在非霍奇金氏淋巴瘤中，骨髓细胞形态学检查正常并不能代表骨髓不含肿瘤细胞。常规形态学检查不能够发现的那部分微量肿瘤细胞被称作微小病灶(MRD)〔1〕。以往有不少技术用于MRD检测，但由于存在敏感性差和特异性不强等方面的缺陷，限制了它们的临床应用。本文应用敏感性和特异性均高的PCR方法扩增T细胞性非霍奇金氏淋巴瘤(T-NHL)病人T细胞受体γ链(TCRγ)基因重排V9区序列和B细胞性非霍奇金氏淋巴瘤(B-NHL)病人免疫球蛋白重链(IgH)基因CDR-Ⅲ区序列，对骨髓形态学检查正常的病人骨髓标本进行MRD检测，以研究其应用于协助估计病人预后、指导治疗及判断疗效等方面的意义，现报道如下：
1材料与方法
, 百拇医药
1.1检查材料
13例T-NHL病人，其中男10例，女3例，年龄18～70岁，17例B-NHL病人，年龄13～64岁。所有病例均经临床、病理活检确诊。T-NHL免疫分型为CD3+，CD20-，CD45RO+；B-NHL免疫分型为CD20+，CD3-。另选6例正常人骨髓标本作为对照组。治疗方案主要包括化疗、化疗加放疗。
1.2方法
1.2.1试剂：TagDNA聚合酶购自Promega公司，4种dNTP购自Sigma公司，蛋白酶K购自Amresc公司。引物由上海生工生物工程公司合成，其序列如下：
IgH：V：5′-CTGTCGACACGGCCGTGTATTACT-G-3′
J：5′-AACTGCAGAGGAGACGGTGACC-3′
, 百拇医药
用于扩增IgH基因CDR-Ⅲ区序列，所得扩增产物为70-140bp的DNA片段。
TGRγ：V：5′-GAAAGGAATCTGGCATTCCG-3′
J：5′-CCTGTGACAACAAGTGTTGT-3′
用于扩增TCRγV9区序列，所得扩增产物为170-230bp的DNA片段。
1.2.2DNA制备〔2〕：取肝素抗凝骨髓5ml，用淋巴细胞分离液分离出有核细胞层，经8000r/min离心15分钟，使有核细胞沉淀于下层，弃上清，加消化液50μl(含10mmol/LTris-HCl缓冲液，1mmol/LEDTA，0.1%吐温-20)，加蛋白酶K至终浓度100μg/ml，置52℃温箱2小时，95℃水浴20分钟，灭活蛋白酶K。之后分别经苯酚、苯酚-氯仿和氯仿-异戊醇抽提3次，用无水乙醇沉淀DNA，真空干燥，最后加TE液溶解备用。
, 百拇医药
1.2.3PCR扩增：参照Saiki〔3〕等的方法，于50μl的反应体系(其中4×dNTP的浓度为200μmol/L，引物的浓度为50pmol/L)中加1～2μg的DNA样本。在95℃预变性5分钟后，加入TagDNA聚合酶1.5u，再加50μl液体石蜡，之后于93℃变性、55℃退火和72℃延伸反复循环30周期，控制时间分别为60秒、60秒、120秒。扩增完毕，取扩增产物10μl经琼脂糖电泳，用溴乙锭染色10～15分钟后，在紫外透视下观察，并照相记录结果。
2结果
2.1骨髓中MRD检测
13例形态学检查正常的初治T-NHL病人骨髓标本经PCR检测，7例发现有MRD存在，检出率为53.8%(7/13)。17例初治B-NHL病人中，11例有MRD存在，检出率为64.8%(11/17)。6例正常人骨髓标本MRD检测均为阴性(见图1、2)。
, 百拇医药
图1 PCR-TCR基因重排检测电泳结果注：1-5
正常对照DNA；6-8T-NHL，PCR-TCRγ
扩增阳性；9阳性对照；10-12阴性患者标本；13MarkerDNA
图2 PCR-IgH基因重排检测电泳结果注：3，5，6
正常对照DNA；2，4，9，10B-NHL，PCR-IgH扩增阳性；7
阳性对照；8，11阴性患者标本；1MarkerDNA
2.2骨髓中MRD检测与生存期的关系
, http://www.100md.com 13例T-NHL中7例MRD阳性病人3.5年以上的生存率为28.6%(2/7)，6例MRD阴性病人3.5年以上的生存率为67%(4/6)，两者生存率相比有显著差异(P<0.05)。17例B-NHL中11例MRD阳性病人3.5年以上的生存率为36%(4/11)，6例MRD阴性病人3.5年以上的生存率为67%(4/6)，两者生存率相比有显著差异(P<0.05)。
3讨论
淋巴瘤目前主要依靠组织学、细胞学方法来判断骨髓是否被肿瘤细胞累及，但因受检测敏感性限制，骨髓细胞形态学检查仅能发现比例占5%以上的肿瘤细胞。近年来随着分子生物学发展，已发现淋巴系统恶性肿瘤具有某些特异性基因标志，通过对这些基因标志的检测可以发现骨髓中的MRD。IgH和TCRγ基因重排可以作为B、T淋巴细胞起源的一种标记〔4，5〕。近年来建立起的PCR技术检测T-NHL的TCRγ单克隆性基因重排和B-NHL的IgH基因重排，具有高度的敏感性和特异性，使MRD的早期诊断成为可能〔6～8〕。我们用此方法分别对骨髓形态学检查正常的13例初治T-NHL和17例初治B-NHL病人骨髓进行MRD检测，T-NHL中7例发现MRD存在，检出率为53.8%；B-NHL中11例发现MRD存在，检出率为64.8%。骨髓中MRD阳性病人生存期明显低于MRD阴性病人，表明骨髓中MRD检测可以协助估计NHL病人预后，判断疗效，还可以监测复发，NHL病人经治疗达临床完全缓解继续行巩固、强化治疗使骨髓中MRD达到阴性是延长病人无病生存期的必要条件。另外，临床Ⅰ、Ⅱ期的NHL病人骨髓标本中发现MRD，则表明肿瘤细胞已发生全身播散可能，在治疗原则上应由局部放射治疗为主改为以化疗为主的全身性治疗，以彻底清除全身播散的肿瘤细胞，提高治愈率。
, http://www.100md.com
PCR技术为NHL病人骨髓中MRD检测提供了一种新的手段，在指导治疗、判断疗效、预后估计等方面有重要意义。
〔参考文献〕
〔1〕Potter MN. The detection of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia 〔J〕.Blood Rev，1992，6：68～82.
〔2〕McCarthy KP，Sloane JP，Kabarouski JH，et al.The rapid detection of clonal T-cell proliferations in patients with lymphoid disorders 〔J〕.Am J Pathol，1991， 138：821～826.
〔3〕Saiki RK，Scharf S，Faloona F，et al. Enzymatic amplification of β -globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia 〔J〕.Science，1985，230：1350～1354.
, 百拇医药
〔4〕Jonsson OG，Kitchens RL， Scott FC， et al. Detection of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia using immunoglobulin hypervariable region specific oligonucleotide probes 〔J〕. Blood, 1990， 76： 2072～2079.
〔5〕Trainor KJ，Brisco MJ，Wan JH，et al.Gene rearrangement in B-and T-lymphoproliferative disease detected by polymerase chain reaction 〔J〕. Blood， 1991，78：192～196.
〔6〕van Dongen JJ，Wolvers-Tettero IL. Analysis of immunoglobulin and T cell receptor genes. Part Ⅱ：Possibilities and limi tati ons in the diagnosis and management of lymphoproliferative diseases and related disorders 〔J〕. Clin Chim Acta，1991，198 ：93～174.
, http://www.100md.com
〔7〕赵洪宁，黄志光，朱梅刚，等.PCR扩增IgH和TCRβ基因重排在检测淋巴细胞白血病微小残留病中的应用〔J〕.第一军医大学学报，1995，15(2)：124～126.
〔8〕Potter MN，Steward CG，Maitland NJ，et al.Detection of clonality in childhood B-lineage acute lymphoblastic leukemia by the polymerase chain reaction〔J〕. Leukemia，1992，6： 289～294.
收稿日期：1999-04-07；修回日期：1999-05-21, 百拇医药
单位：中山医科大学附属第三医院内科(广州，510630)
关键词：非霍奇金氏淋巴瘤；基因重排；微小病灶
癌症990623 【摘要】目的：探讨微小病灶在非霍奇金氏淋巴瘤中的检测对病人疗效、预后的影响。方法：采用PCR方法扩增T细胞受体γ链(TCRγ)和免疫球蛋白重链(IgH)基因重排，对13例骨髓形态学检查正常的T细胞非霍奇金氏淋巴瘤(T-NHL)和17例B细胞非霍奇金氏淋巴瘤(B-NHL)病人治疗前骨髓标本进行微小病灶(MRD)检测。结果：其中7例T-NHL病人发生TCRγ基因重排，检出率为53.8%，11例B-NHL病人发生IgH基因重排，检出率为64.8%。检出阳性的病人生存期明显低于检出阴性的病人(P<0.05)。结论：骨髓中微小病灶检测可以协助估计病人预后、指导治疗及判断疗效。
, http://www.100md.com
中图分类号：R557 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)06-0705-03
The clinical significance of detecting minimal residual disease in
non-Hodgkin’s lymphoma
XIAO Ruo-zhi，ZHOU Yu-qi
Department of Internal Medicine，Third Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University of Medical Sciences，Guangzhou 510630,P.R.China
【Abstract】 Objective：To analyze the significance of detecting minimal residual disease (MRD) in non-Hodgkin’s lymphoma. Methods：polymerase chain reaction (PCR) was used to amplify the T-cell receptor γ chain gene (TCRγ) in T cell non-Hodgkin’s lymphoma (T-NHL) and immunoglobulin gene rearrangements (IgH) in B cell non-Hodgkin’s lymphoma(B-NHL). Bone marrow specimens from 13 untreated patients of T-NHL with normal morphology and 17 patients of B-NHL were detected for MRD.Results：TCR γ rearrangement was shown in 7 patients with T-NHL and IgH rearrangement was shown in 11 patients with B-NHL.The incidence of MRD in bone marrow with T-NHL and B-NHL was 53.8% (7/13) and 64.8% (11/17) respectively. Patients with MRD had a shorter survival time than those without (P<0.05). Conclusion： The results showed that detection of MRD in bone marrow may provide some important information for assessing prognosis，directing treatment and judging curative effect.
, 百拇医药
Key words：non-Hodgkin’s lymphoma；Gene rearrangement；Minimal residual disease
在非霍奇金氏淋巴瘤中，骨髓细胞形态学检查正常并不能代表骨髓不含肿瘤细胞。常规形态学检查不能够发现的那部分微量肿瘤细胞被称作微小病灶(MRD)〔1〕。以往有不少技术用于MRD检测，但由于存在敏感性差和特异性不强等方面的缺陷，限制了它们的临床应用。本文应用敏感性和特异性均高的PCR方法扩增T细胞性非霍奇金氏淋巴瘤(T-NHL)病人T细胞受体γ链(TCRγ)基因重排V9区序列和B细胞性非霍奇金氏淋巴瘤(B-NHL)病人免疫球蛋白重链(IgH)基因CDR-Ⅲ区序列，对骨髓形态学检查正常的病人骨髓标本进行MRD检测，以研究其应用于协助估计病人预后、指导治疗及判断疗效等方面的意义，现报道如下：
1材料与方法
, 百拇医药
1.1检查材料
13例T-NHL病人，其中男10例，女3例，年龄18～70岁，17例B-NHL病人，年龄13～64岁。所有病例均经临床、病理活检确诊。T-NHL免疫分型为CD3+，CD20-，CD45RO+；B-NHL免疫分型为CD20+，CD3-。另选6例正常人骨髓标本作为对照组。治疗方案主要包括化疗、化疗加放疗。
1.2方法
1.2.1试剂：TagDNA聚合酶购自Promega公司，4种dNTP购自Sigma公司，蛋白酶K购自Amresc公司。引物由上海生工生物工程公司合成，其序列如下：
IgH：V：5′-CTGTCGACACGGCCGTGTATTACT-G-3′
J：5′-AACTGCAGAGGAGACGGTGACC-3′
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用于扩增IgH基因CDR-Ⅲ区序列，所得扩增产物为70-140bp的DNA片段。
TGRγ：V：5′-GAAAGGAATCTGGCATTCCG-3′
J：5′-CCTGTGACAACAAGTGTTGT-3′
用于扩增TCRγV9区序列，所得扩增产物为170-230bp的DNA片段。
1.2.2DNA制备〔2〕：取肝素抗凝骨髓5ml，用淋巴细胞分离液分离出有核细胞层，经8000r/min离心15分钟，使有核细胞沉淀于下层，弃上清，加消化液50μl(含10mmol/LTris-HCl缓冲液，1mmol/LEDTA，0.1%吐温-20)，加蛋白酶K至终浓度100μg/ml，置52℃温箱2小时，95℃水浴20分钟，灭活蛋白酶K。之后分别经苯酚、苯酚-氯仿和氯仿-异戊醇抽提3次，用无水乙醇沉淀DNA，真空干燥，最后加TE液溶解备用。
, 百拇医药
1.2.3PCR扩增：参照Saiki〔3〕等的方法，于50μl的反应体系(其中4×dNTP的浓度为200μmol/L，引物的浓度为50pmol/L)中加1～2μg的DNA样本。在95℃预变性5分钟后，加入TagDNA聚合酶1.5u，再加50μl液体石蜡，之后于93℃变性、55℃退火和72℃延伸反复循环30周期，控制时间分别为60秒、60秒、120秒。扩增完毕，取扩增产物10μl经琼脂糖电泳，用溴乙锭染色10～15分钟后，在紫外透视下观察，并照相记录结果。
2结果
2.1骨髓中MRD检测
13例形态学检查正常的初治T-NHL病人骨髓标本经PCR检测，7例发现有MRD存在，检出率为53.8%(7/13)。17例初治B-NHL病人中，11例有MRD存在，检出率为64.8%(11/17)。6例正常人骨髓标本MRD检测均为阴性(见图1、2)。
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图1 PCR-TCR基因重排检测电泳结果注：1-5
正常对照DNA；6-8T-NHL，PCR-TCRγ
扩增阳性；9阳性对照；10-12阴性患者标本；13MarkerDNA
图2 PCR-IgH基因重排检测电泳结果注：3，5，6
正常对照DNA；2，4，9，10B-NHL，PCR-IgH扩增阳性；7
阳性对照；8，11阴性患者标本；1MarkerDNA
2.2骨髓中MRD检测与生存期的关系
, http://www.100md.com 13例T-NHL中7例MRD阳性病人3.5年以上的生存率为28.6%(2/7)，6例MRD阴性病人3.5年以上的生存率为67%(4/6)，两者生存率相比有显著差异(P<0.05)。17例B-NHL中11例MRD阳性病人3.5年以上的生存率为36%(4/11)，6例MRD阴性病人3.5年以上的生存率为67%(4/6)，两者生存率相比有显著差异(P<0.05)。
3讨论
淋巴瘤目前主要依靠组织学、细胞学方法来判断骨髓是否被肿瘤细胞累及，但因受检测敏感性限制，骨髓细胞形态学检查仅能发现比例占5%以上的肿瘤细胞。近年来随着分子生物学发展，已发现淋巴系统恶性肿瘤具有某些特异性基因标志，通过对这些基因标志的检测可以发现骨髓中的MRD。IgH和TCRγ基因重排可以作为B、T淋巴细胞起源的一种标记〔4，5〕。近年来建立起的PCR技术检测T-NHL的TCRγ单克隆性基因重排和B-NHL的IgH基因重排，具有高度的敏感性和特异性，使MRD的早期诊断成为可能〔6～8〕。我们用此方法分别对骨髓形态学检查正常的13例初治T-NHL和17例初治B-NHL病人骨髓进行MRD检测，T-NHL中7例发现MRD存在，检出率为53.8%；B-NHL中11例发现MRD存在，检出率为64.8%。骨髓中MRD阳性病人生存期明显低于MRD阴性病人，表明骨髓中MRD检测可以协助估计NHL病人预后，判断疗效，还可以监测复发，NHL病人经治疗达临床完全缓解继续行巩固、强化治疗使骨髓中MRD达到阴性是延长病人无病生存期的必要条件。另外，临床Ⅰ、Ⅱ期的NHL病人骨髓标本中发现MRD，则表明肿瘤细胞已发生全身播散可能，在治疗原则上应由局部放射治疗为主改为以化疗为主的全身性治疗，以彻底清除全身播散的肿瘤细胞，提高治愈率。
, http://www.100md.com
PCR技术为NHL病人骨髓中MRD检测提供了一种新的手段，在指导治疗、判断疗效、预后估计等方面有重要意义。
〔参考文献〕
〔1〕Potter MN. The detection of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia 〔J〕.Blood Rev，1992，6：68～82.
〔2〕McCarthy KP，Sloane JP，Kabarouski JH，et al.The rapid detection of clonal T-cell proliferations in patients with lymphoid disorders 〔J〕.Am J Pathol，1991， 138：821～826.
〔3〕Saiki RK，Scharf S，Faloona F，et al. Enzymatic amplification of β -globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia 〔J〕.Science，1985，230：1350～1354.
, 百拇医药
〔4〕Jonsson OG，Kitchens RL， Scott FC， et al. Detection of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia using immunoglobulin hypervariable region specific oligonucleotide probes 〔J〕. Blood, 1990， 76： 2072～2079.
〔5〕Trainor KJ，Brisco MJ，Wan JH，et al.Gene rearrangement in B-and T-lymphoproliferative disease detected by polymerase chain reaction 〔J〕. Blood， 1991，78：192～196.
〔6〕van Dongen JJ，Wolvers-Tettero IL. Analysis of immunoglobulin and T cell receptor genes. Part Ⅱ：Possibilities and limi tati ons in the diagnosis and management of lymphoproliferative diseases and related disorders 〔J〕. Clin Chim Acta，1991，198 ：93～174.
, http://www.100md.com
〔7〕赵洪宁，黄志光，朱梅刚，等.PCR扩增IgH和TCRβ基因重排在检测淋巴细胞白血病微小残留病中的应用〔J〕.第一军医大学学报，1995，15(2)：124～126.
〔8〕Potter MN，Steward CG，Maitland NJ，et al.Detection of clonality in childhood B-lineage acute lymphoblastic leukemia by the polymerase chain reaction〔J〕. Leukemia，1992，6： 289～294.
收稿日期：1999-04-07；修回日期：1999-05-21, 百拇医药