灵芝提取物对DNA拓扑异构酶的抑制作用及诱导K562细胞凋亡
作者：蒋超，卿晨，蒙凌华，丁健
单位：中国科学院上海药物研究所(上海，200031)
关键词：中华灵芝宝；DNA拓扑异构酶；凋亡
癌症990611 【摘要】目的：研究中华灵芝宝的抗肿瘤作用机理。方法：DNA超螺旋解旋法检测中华灵芝宝对拓扑异构酶Ⅰ、Ⅱ(TOPOⅠ、Ⅱ)活性的影响；琼脂糖凝胶电泳检测其对DNA的直接打断作用及诱导K562细胞凋亡的能力。结果：中华灵芝宝能抑制TOPOⅠ、Ⅱ的活性，促进DNA的解旋、断裂；同时还能直接打断质粒和大分子DNA；作用于K562细胞后电泳显示有凋亡细胞特有的“梯状”条带。结论：中华灵芝宝能同时抑制TOPOⅠ、Ⅱ活性，直接打断质粒和大分子DNA，并能诱导K562细胞凋亡。
中图分类号：R979.1 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)06-0661-03
, 百拇医药
Inhibitory effects of China ganoderma lucid essence (CGLE) on DNA topoisomerases and its ability to induce apoptosis of K562 cells
JIANG Chao,QING Chen,MENG Ling-hua,et al.
Shanghai Institute of Material Medical,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 200031,P.R.China
【Abstract】 Objective：To study the anticancer mechanisms of China ganoderma lucid essence (CGLE). Methods：The effect of CGLE on topoisomerases was measured by supercoiled DNA relaxation assay;the effects of CGLE on direct breaking of DNA and inducing apoptosis ability of K562 cells were measured by agarose gel electrophoresis.Results：CGLE could markedly inhibit the activities of topoisomerase Ⅰand Ⅱ,promote the relaxing and breaking of DNA.Simultaneously dose-dependent breaks of plasmid DNA and nuclei DNA were observed.Besides it could induce apoptosis of K562 cells.Conclusions：These results suggest that CGLE can inhibit the activities of topoisomeraseⅠand Ⅱ,and directly break plasmid DNA and nuclei DNA.It can also induce the apoptosis of K562 cells.
, 百拇医药
Key words：China ganoderma lucid essence (CGLE); Topoisomerase; Apoptosis
中华灵芝宝(China ganoderma lueid essence,CGLE)的主要成分为灵芝精粉和灵芝孢子粉，富含高分子多糖体、蛋白质、氨基酸、三萜类化合物、有机锗等，具有滋补强身、扶正固体、安神止痛等功效。这种作用不仅是免疫介导的〔1,2〕，还有直接细胞毒性。我们进一步研究了中华灵芝宝抗肿瘤的作用机制，测定了其对DNA拓扑异构酶Ⅰ、Ⅱ(topoisomeraseⅠ、Ⅱ，TOPOⅠ、Ⅱ)的作用及诱导白血病细胞凋亡的能力。
1材料与方法
1.1材料
中华灵芝宝为袋装深褐色粉剂，由上海绿谷(集团)有限公司提供(批号：970312)，实验前用生理盐水溶解；人红白血病K562细胞、小鼠肝癌EC腹水瘤细胞由我室传代培养；其它一般试剂为分析纯。
, http://www.100md.com
1.2实验方法
1.2.1 pBR322 DNA的提取：质粒pBR322转化到大肠杆菌E.coli中，摇床培养，按常规方法提取超螺旋pBR322 DNA〔3〕。
1.2.2EC腹水癌细胞DNA拓扑异构酶的提取：EC腹水瘤细胞离心后用PBS洗涤，离心弃上清加TMN(Tris-HCl 1.0mmol/L pH7.5,MgCl2 1.5mmol/L，NaCl10mmol/L)计数，调整细胞为1×107/ml。取10ml细胞悬液加入1ml10%月桂酰基肌氨酸钠(Sarcosyl)，离心弃上清；加入2ml Buffer A(50mmol/L Tris-Cl pH7.5,0.25mmol/L蔗糖，25mmol/L KCl,3mmol/L MgCl2，2mmol/LCaCl2)，轻摇；加0.6ml Buffer B(同A，但蔗糖为0.6mol/L)，离心弃上清；加2ml Buffer C(同A，但MgCl2为5mmol/L，无CaCl2)，离心弃上清；加0.15ml Buffer D(同A，但无蔗糖)，8μl0.5mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)和0.33ml Buffer E(80mmol/LTris-HClpH7.5,2mmol/L EDTA,1mmol/L二硫苏糖(DTT)，0.53mmol/L NaCl,20%甘油)。置4℃30分钟，离心取上清；加等体积甘油、牛血清白蛋白(BSA终浓度1mg/ml)和苯*****(PMSF终浓度0.5mmol/L)，分装后置-20℃保存〔4〕。
, http://www.100md.com
1.2.3拓扑异构酶活性测定：5μl4×缓冲液(200mmol/L Tris-HCl pH7.5,340mmol/LKCI,40mmol/L MgCl2，20mmol/LDTT，120μg/mlBSA,5mmol/L EDTA)中加入0.5μg超螺旋pBR322DNA及不同量的酶提取液，并加蒸馏水至20μl，置37℃反应30分钟。加1μl混合液(10% SDS10μl+1μl蛋白酶K10mg/ml)终止反应，继续温育半小时，加2μl上样Buffer,1%琼脂糖电泳，TAE缓冲液，40～50V电压，电泳1.5小时，溴化乙锭(EB)染色，紫外灯观察。
1.2.4中华灵芝宝对拓扑异构酶活性的影响：选取使50%超螺旋DNA解旋的TOPO酶量，测定中华灵芝宝对其的影响。实验过程同上述拓扑异构酶活性测定，反应液中加入不同浓度的中华灵芝宝，作用30分钟；反应体系中加入1mmol/L三磷酸腺苷(ATP)测其对TOPOⅡ的作用。反应体系不含ATP主要测其对TOPOⅠ的作用，应用UVPGS8000凝胶图象分析仪的GelWorks 1Dintermediate Version2.01软件对电泳凝胶图像做半定量分析。
, 百拇医药
1.2.5中华灵芝宝对DNA的直接作用：(1)对质粒DNA的作用：0.3μg超螺旋pBR322DNA加5μl缓冲液及不同浓度的中华灵芝宝，并加蒸馏水至20μl,置37℃反应30分钟。加2μl上样Buffer,1%琼脂糖电泳，TAE缓冲液，电泳，EB染色，紫外观察。(2)对K562细胞DNA的作用：0.5μg大分子DNA(K562细胞中提取)与不同浓度的中华灵芝宝直接反应，步骤同上。
1.2.6中华灵芝宝对凋亡的影响：根据文献〔6〕稍加改进：不同浓度的中华灵芝宝加入到生长良好的人急性红白血病K562细胞中，37℃5%CO2条件下共同培养24小时。然后PBS洗涤，加0.5ml裂解液(10mmol/L Tris-HCl pH7.9,10mmol/LEDTA,150mmol/L NaCl,0.4%SDS)，37℃反应过夜。次日加0.5ml饱和酚，离心取上层；加等体积氯仿再抽一次，离心吸上清；加2.5倍体积的预冻的冰无水乙醇，内含0.2mmol/LNaCl,-20℃放30分钟；离心，用70%乙醇洗一次，TE溶解，加RNA酶(终浓度1mg/ml)37℃作用30分钟；1.7%琼脂糖电泳，TBEBuffer,EB染色，紫外观察。
, http://www.100md.com
2结果
2.1对TOPOⅠ、TOPOⅡ酶活性的影响：
中华灵芝宝对TOPOⅠ、Ⅱ酶活性的影响见图1。上排为中华灵芝宝对TOPOⅠ的作用，反应体系不含ATP；下排为对TOPOⅡ的影响，反应体系中加入了1mmol/LATP，因为TOPOⅡ的催化需要ATP提供能量，并且生理浓度的ATP能抑制TOPOⅠ的酶反应。结果中华灵芝宝对TOPOⅠ、Ⅱ的作用形式基本相同。随着中华灵芝宝浓度的提高，超螺旋DNA逐渐减少至完全消失，缺口、线性DNA逐渐增多，说明它能促进酶介导的DNA解旋或断裂反应。中华灵芝宝在0.156mg/ml浓度下就能明显抑制酶的活性，2.5～5.0mg/ml浓度下超螺旋完全解旋，且呈很好的量效关系。
图1 中华灵芝宝对拓扑异构酶的作用
, http://www.100md.com
上排：中华灵芝宝对TOPOⅠ的作用
下排：中华灵芝宝对TOPOⅡ的作用
用凝胶图像分析仪对中华灵芝宝的酶抑制半数作用剂量(IC50)进行了计算分析，结果中华灵芝宝对TOPOⅠ的IC50值为0.51mg/ml;对TOPOⅡ的IC50值为0.57mg/ml。
2.2中华灵芝宝对DNA的直接作用：
2.2.1中华灵芝宝对质粒DNA的作用：随着中华灵芝宝浓度的提高，超螺旋DNA逐渐减少至消失，线性DNA逐渐增多，最后呈弥散型(图2)，说明中华灵芝宝能直接打断DNA链。
图2 中华灵芝宝对pBR322DNA的直接作用
, http://www.100md.com
2.2.2中华灵芝宝对K562细胞的DNA的作用：随着中华灵芝宝浓度的增加，K562细胞大分子DNA呈弥散型打断(图3)，具有明显的量-效关系。
图3 中华灵芝宝对K562DNA的作用
2.3中华灵芝宝诱导人红白血病K562细胞凋亡
中华灵芝宝在5mg/ml浓度下，作用24小时，琼脂糖电泳就显示典型的180～200bp左右的凋亡梯度状条带，随着作用剂量的增大，梯度状条带更明显；另外中华灵芝宝10mg/ml浓度作用8小时，清晰的梯度状条带就出现(图4)，以上实验表明中华灵芝宝能诱导人红白血病K562细胞凋亡。
3讨论
中华灵芝宝是破壁灵芝孢子粉、灵芝精粉及辅料制成的散剂，含有多种组分。以往的研究表明灵芝能提高机体的特异和非特异免疫功能，促进免疫细胞因子的产生，并能明显抑制小鼠肿瘤生长〔1，2〕，因此被认为是一种免疫调节剂，其抑瘤作用主要是由免疫介导的。为进一步确证中华灵芝宝的直接抑瘤作用，我们选择了几个抗肿瘤作用靶点，研究其作用机理。
, 百拇医药
DNA拓扑异构酶是一种调节DNA空间构型的重要核酶，与DNA的代谢包括复制、转录、重组等密切相关，根据其瞬间断裂DNA单、双链的不同，分为TOPOⅠ和Ⅱ。由于DNA的超螺旋程度影响着机体的活动，而拓扑异构酶的作用正是调控DNA的空间构型，由此DNA拓扑异构酶已成为抗肿瘤药物作用的重要靶点。现已知许多临床上广泛使用的抗癌药都能作用于拓扑异构酶，如喜树碱类抗癌药特异性地作用于TOPOⅠ〔6〕，VP-16、阿霉素、柔红霉素等选择性作用于TOPOⅡ〔7，8〕，也有一些抗癌药物能同时抑制TOPOⅠ和Ⅱ，如蒽类氨基酸偶合物等〔9〕。我们检测了中华灵芝宝对拓扑异构酶的影响，结果显示中华灵芝宝能同时抑制DNATOPOⅠ和Ⅱ的活性，促进DNA断裂；随着浓度的提高，这种作用愈趋明显，且呈现较好的量-效关系。另外我们还采用0.35mmol/LNaCl直接抽提拓扑异构酶，测试得到相同的结果(资料未显示)。中华灵芝宝作为拓扑异构酶抑制剂，可能一方面通过稳定可切割复合物，造成DNA的异常重组，从而激发细胞内一系列可导致细胞死亡的生化过程；另一方面干扰基因的转录，从而影响癌基因的表达〔10，11〕。
, http://www.100md.com
图4 中华灵芝宝诱导K562细胞凋亡
本研究还发现中灵芝宝不仅能促进拓扑异构酶介导的DNA断裂，本身还能直接作用于DNA，非特异性打断DNA链，影响肿瘤细胞的生长。这一点与阿霉素、柔红霉素作用相似，它们也既能直接作用DNA，又能通过拓扑异构酶促使DNA断裂〔4〕。
凋亡是细胞在基因调控下的一种主动死亡。大多数抗癌药物都可引起肿瘤细胞的凋亡；诱导细胞凋亡可能是不同机制抗癌药物发挥作用的共同通路，所以细胞凋亡成为评估抗癌药物作用能力的一项新指标。据文献报道，拓扑异构酶抑制剂往往可诱导肿瘤细胞的凋亡〔12～14〕，我们的实验也印证了这一点。由于中华灵芝宝水溶液呈棕色混悬，进行凋亡细胞的形态观察和流式细胞仪测定凋亡细胞百分率比较困难，因此我们根据凋亡细胞的生化特征，选择琼脂糖凝胶电泳观察中华灵芝宝诱导K562细胞凋亡的能力。结果中华灵芝宝在浓度大于5mg/ml剂量作用24小时后，就能诱导人红白血病K562细胞的凋亡。K562细胞对多种化疗药物高度耐受，不易引起凋亡；中华灵芝宝是混合物能显示作用更证明其具有直接细胞毒作用。
, 百拇医药
以上实验揭示了中华灵芝宝抗肿瘤的部分作用机制，表明灵芝类物质除免疫调节作用外，对肿瘤细胞有直接作用。由于中华灵芝宝成分众多，究竟是何种成分起主要作用，以及是否还有其它的作用机理，尚须做进一步的深入探讨和研究。
〔参考文献〕
〔1〕谭允育，崔德玉.灵芝水煎剂免疫药理作用的研究〔J〕.北京中医药大学，1996，19(5)：61.
〔2〕余素清，吴树勋，刘京生，等.灵芝孢子粉对小鼠免疫功能的影响及抗60Co辐射效应〔J〕.中国中药杂志，1997，22(10)：625.
〔3〕萨姆布鲁克，弗里奇，曼尼阿斯蒂.分子克隆实验指南〔M〕.第二版.科学出版社，1992：17，55，19.
〔4〕刘晓梅，王龙贵，籍秀娟.以DNA拓扑异构酶Ⅱ为靶点的一种抗癌筛选新的方法〔J〕.癌症，1991，10(3)：220.
, 百拇医药
〔5〕韩锐.抗癌药物研究与实验技术〔M〕.北京：北京医科大学与中国协和医科大学联合出版社，1997：397.
〔6〕Eng WK,Faucette L,Johnson RK,et al.Evidence that DNA topoisomerase Ⅰ is necessary for the cytotoxic effects of camptothecin〔J〕.Mol Pharmacol,1988,34： 755～760.
〔7〕Pommier Y.DNA topoisomerase Ⅰand Ⅱ in cancer chemotherapy：update and perspectives〔J〕.Cancer Chemother Pharmacol,1993,32：103～108.
〔8〕Liu LF.DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs〔J〕.Annu Rev Biochem,1989,58：351～375.
, http://www.100md.com
〔9〕Cummings J,Macpherson J S,Meikle Ⅰ,et al.Development of anthraceny-amino conjugates as topoisomerase Ⅰand Ⅱ inhibitors that circumvent drug resistance 〔J〕. Biochem. Pharmacol,1996,52：979～990.
〔10〕Pommier Y,Schwartz RE,Zwelling LA,et al. Effects of DNA intercalating agents on topoisomerase Ⅱ induced DNA strand cleavage in isolated mammalian cell nuclei〔J〕.Biochemistry,1985,24：6406～6410.
〔11〕Riou JF, Multon E,Vilarem MJ,et al. In vivo stimulation by antitumor drugs of the topoisomerase Ⅱ induced cleavage sites in c-myc protooncogene〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,1986,137：154～160.
, 百拇医药
〔12〕Del Bino G,Skierski J,Darzynkiewicz Z,et al.Diverse effects of camptothecin,an inhibitor of topoisomerase Ⅰ on the cell cycle of lymphocytinc (L1210,MOLT-4)and myelogenous (HL-60,KGl)leukemic cells〔J〕.Cancer Res,1990,50：5746～5750.
〔13〕Del Bino G,Darzynkiewicz Z.Camptothecin,teniposide or 4'-(9-acridinylamino)-3-methanesulfon-m-anisidide, but not mitoxantrone or doxorubicin,induced degradation of nuclear DNA in the S phase of HL-60 cells〔J〕.Cancer Res,1991,51：1165.
〔14〕Del Bino G,Bruno S,Yi P-N, et al.Apoptotic cell death triggered by camptothecin or teniposide.The cell cycle specificity and ionizing radiation〔J〕.Cell Prolif,1992,25：537～548.
收稿日期：1999-03-18；修回日期：1999-04-20, 百拇医药
单位：中国科学院上海药物研究所(上海，200031)
关键词：中华灵芝宝；DNA拓扑异构酶；凋亡
癌症990611 【摘要】目的：研究中华灵芝宝的抗肿瘤作用机理。方法：DNA超螺旋解旋法检测中华灵芝宝对拓扑异构酶Ⅰ、Ⅱ(TOPOⅠ、Ⅱ)活性的影响；琼脂糖凝胶电泳检测其对DNA的直接打断作用及诱导K562细胞凋亡的能力。结果：中华灵芝宝能抑制TOPOⅠ、Ⅱ的活性，促进DNA的解旋、断裂；同时还能直接打断质粒和大分子DNA；作用于K562细胞后电泳显示有凋亡细胞特有的“梯状”条带。结论：中华灵芝宝能同时抑制TOPOⅠ、Ⅱ活性，直接打断质粒和大分子DNA，并能诱导K562细胞凋亡。
中图分类号：R979.1 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)06-0661-03
, 百拇医药
Inhibitory effects of China ganoderma lucid essence (CGLE) on DNA topoisomerases and its ability to induce apoptosis of K562 cells
JIANG Chao,QING Chen,MENG Ling-hua,et al.
Shanghai Institute of Material Medical,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 200031,P.R.China
【Abstract】 Objective：To study the anticancer mechanisms of China ganoderma lucid essence (CGLE). Methods：The effect of CGLE on topoisomerases was measured by supercoiled DNA relaxation assay;the effects of CGLE on direct breaking of DNA and inducing apoptosis ability of K562 cells were measured by agarose gel electrophoresis.Results：CGLE could markedly inhibit the activities of topoisomerase Ⅰand Ⅱ,promote the relaxing and breaking of DNA.Simultaneously dose-dependent breaks of plasmid DNA and nuclei DNA were observed.Besides it could induce apoptosis of K562 cells.Conclusions：These results suggest that CGLE can inhibit the activities of topoisomeraseⅠand Ⅱ,and directly break plasmid DNA and nuclei DNA.It can also induce the apoptosis of K562 cells.
, 百拇医药
Key words：China ganoderma lucid essence (CGLE); Topoisomerase; Apoptosis
中华灵芝宝(China ganoderma lueid essence,CGLE)的主要成分为灵芝精粉和灵芝孢子粉，富含高分子多糖体、蛋白质、氨基酸、三萜类化合物、有机锗等，具有滋补强身、扶正固体、安神止痛等功效。这种作用不仅是免疫介导的〔1,2〕，还有直接细胞毒性。我们进一步研究了中华灵芝宝抗肿瘤的作用机制，测定了其对DNA拓扑异构酶Ⅰ、Ⅱ(topoisomeraseⅠ、Ⅱ，TOPOⅠ、Ⅱ)的作用及诱导白血病细胞凋亡的能力。
1材料与方法
1.1材料
中华灵芝宝为袋装深褐色粉剂，由上海绿谷(集团)有限公司提供(批号：970312)，实验前用生理盐水溶解；人红白血病K562细胞、小鼠肝癌EC腹水瘤细胞由我室传代培养；其它一般试剂为分析纯。
, http://www.100md.com
1.2实验方法
1.2.1 pBR322 DNA的提取：质粒pBR322转化到大肠杆菌E.coli中，摇床培养，按常规方法提取超螺旋pBR322 DNA〔3〕。
1.2.2EC腹水癌细胞DNA拓扑异构酶的提取：EC腹水瘤细胞离心后用PBS洗涤，离心弃上清加TMN(Tris-HCl 1.0mmol/L pH7.5,MgCl2 1.5mmol/L，NaCl10mmol/L)计数，调整细胞为1×107/ml。取10ml细胞悬液加入1ml10%月桂酰基肌氨酸钠(Sarcosyl)，离心弃上清；加入2ml Buffer A(50mmol/L Tris-Cl pH7.5,0.25mmol/L蔗糖，25mmol/L KCl,3mmol/L MgCl2，2mmol/LCaCl2)，轻摇；加0.6ml Buffer B(同A，但蔗糖为0.6mol/L)，离心弃上清；加2ml Buffer C(同A，但MgCl2为5mmol/L，无CaCl2)，离心弃上清；加0.15ml Buffer D(同A，但无蔗糖)，8μl0.5mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)和0.33ml Buffer E(80mmol/LTris-HClpH7.5,2mmol/L EDTA,1mmol/L二硫苏糖(DTT)，0.53mmol/L NaCl,20%甘油)。置4℃30分钟，离心取上清；加等体积甘油、牛血清白蛋白(BSA终浓度1mg/ml)和苯*****(PMSF终浓度0.5mmol/L)，分装后置-20℃保存〔4〕。
, http://www.100md.com
1.2.3拓扑异构酶活性测定：5μl4×缓冲液(200mmol/L Tris-HCl pH7.5,340mmol/LKCI,40mmol/L MgCl2，20mmol/LDTT，120μg/mlBSA,5mmol/L EDTA)中加入0.5μg超螺旋pBR322DNA及不同量的酶提取液，并加蒸馏水至20μl，置37℃反应30分钟。加1μl混合液(10% SDS10μl+1μl蛋白酶K10mg/ml)终止反应，继续温育半小时，加2μl上样Buffer,1%琼脂糖电泳，TAE缓冲液，40～50V电压，电泳1.5小时，溴化乙锭(EB)染色，紫外灯观察。
1.2.4中华灵芝宝对拓扑异构酶活性的影响：选取使50%超螺旋DNA解旋的TOPO酶量，测定中华灵芝宝对其的影响。实验过程同上述拓扑异构酶活性测定，反应液中加入不同浓度的中华灵芝宝，作用30分钟；反应体系中加入1mmol/L三磷酸腺苷(ATP)测其对TOPOⅡ的作用。反应体系不含ATP主要测其对TOPOⅠ的作用，应用UVPGS8000凝胶图象分析仪的GelWorks 1Dintermediate Version2.01软件对电泳凝胶图像做半定量分析。
, 百拇医药
1.2.5中华灵芝宝对DNA的直接作用：(1)对质粒DNA的作用：0.3μg超螺旋pBR322DNA加5μl缓冲液及不同浓度的中华灵芝宝，并加蒸馏水至20μl,置37℃反应30分钟。加2μl上样Buffer,1%琼脂糖电泳，TAE缓冲液，电泳，EB染色，紫外观察。(2)对K562细胞DNA的作用：0.5μg大分子DNA(K562细胞中提取)与不同浓度的中华灵芝宝直接反应，步骤同上。
1.2.6中华灵芝宝对凋亡的影响：根据文献〔6〕稍加改进：不同浓度的中华灵芝宝加入到生长良好的人急性红白血病K562细胞中，37℃5%CO2条件下共同培养24小时。然后PBS洗涤，加0.5ml裂解液(10mmol/L Tris-HCl pH7.9,10mmol/LEDTA,150mmol/L NaCl,0.4%SDS)，37℃反应过夜。次日加0.5ml饱和酚，离心取上层；加等体积氯仿再抽一次，离心吸上清；加2.5倍体积的预冻的冰无水乙醇，内含0.2mmol/LNaCl,-20℃放30分钟；离心，用70%乙醇洗一次，TE溶解，加RNA酶(终浓度1mg/ml)37℃作用30分钟；1.7%琼脂糖电泳，TBEBuffer,EB染色，紫外观察。
, http://www.100md.com
2结果
2.1对TOPOⅠ、TOPOⅡ酶活性的影响：
中华灵芝宝对TOPOⅠ、Ⅱ酶活性的影响见图1。上排为中华灵芝宝对TOPOⅠ的作用，反应体系不含ATP；下排为对TOPOⅡ的影响，反应体系中加入了1mmol/LATP，因为TOPOⅡ的催化需要ATP提供能量，并且生理浓度的ATP能抑制TOPOⅠ的酶反应。结果中华灵芝宝对TOPOⅠ、Ⅱ的作用形式基本相同。随着中华灵芝宝浓度的提高，超螺旋DNA逐渐减少至完全消失，缺口、线性DNA逐渐增多，说明它能促进酶介导的DNA解旋或断裂反应。中华灵芝宝在0.156mg/ml浓度下就能明显抑制酶的活性，2.5～5.0mg/ml浓度下超螺旋完全解旋，且呈很好的量效关系。
图1 中华灵芝宝对拓扑异构酶的作用
, http://www.100md.com
上排：中华灵芝宝对TOPOⅠ的作用
下排：中华灵芝宝对TOPOⅡ的作用
用凝胶图像分析仪对中华灵芝宝的酶抑制半数作用剂量(IC50)进行了计算分析，结果中华灵芝宝对TOPOⅠ的IC50值为0.51mg/ml;对TOPOⅡ的IC50值为0.57mg/ml。
2.2中华灵芝宝对DNA的直接作用：
2.2.1中华灵芝宝对质粒DNA的作用：随着中华灵芝宝浓度的提高，超螺旋DNA逐渐减少至消失，线性DNA逐渐增多，最后呈弥散型(图2)，说明中华灵芝宝能直接打断DNA链。
图2 中华灵芝宝对pBR322DNA的直接作用
, http://www.100md.com
2.2.2中华灵芝宝对K562细胞的DNA的作用：随着中华灵芝宝浓度的增加，K562细胞大分子DNA呈弥散型打断(图3)，具有明显的量-效关系。
图3 中华灵芝宝对K562DNA的作用
2.3中华灵芝宝诱导人红白血病K562细胞凋亡
中华灵芝宝在5mg/ml浓度下，作用24小时，琼脂糖电泳就显示典型的180～200bp左右的凋亡梯度状条带，随着作用剂量的增大，梯度状条带更明显；另外中华灵芝宝10mg/ml浓度作用8小时，清晰的梯度状条带就出现(图4)，以上实验表明中华灵芝宝能诱导人红白血病K562细胞凋亡。
3讨论
中华灵芝宝是破壁灵芝孢子粉、灵芝精粉及辅料制成的散剂，含有多种组分。以往的研究表明灵芝能提高机体的特异和非特异免疫功能，促进免疫细胞因子的产生，并能明显抑制小鼠肿瘤生长〔1，2〕，因此被认为是一种免疫调节剂，其抑瘤作用主要是由免疫介导的。为进一步确证中华灵芝宝的直接抑瘤作用，我们选择了几个抗肿瘤作用靶点，研究其作用机理。
, 百拇医药
DNA拓扑异构酶是一种调节DNA空间构型的重要核酶，与DNA的代谢包括复制、转录、重组等密切相关，根据其瞬间断裂DNA单、双链的不同，分为TOPOⅠ和Ⅱ。由于DNA的超螺旋程度影响着机体的活动，而拓扑异构酶的作用正是调控DNA的空间构型，由此DNA拓扑异构酶已成为抗肿瘤药物作用的重要靶点。现已知许多临床上广泛使用的抗癌药都能作用于拓扑异构酶，如喜树碱类抗癌药特异性地作用于TOPOⅠ〔6〕，VP-16、阿霉素、柔红霉素等选择性作用于TOPOⅡ〔7，8〕，也有一些抗癌药物能同时抑制TOPOⅠ和Ⅱ，如蒽类氨基酸偶合物等〔9〕。我们检测了中华灵芝宝对拓扑异构酶的影响，结果显示中华灵芝宝能同时抑制DNATOPOⅠ和Ⅱ的活性，促进DNA断裂；随着浓度的提高，这种作用愈趋明显，且呈现较好的量-效关系。另外我们还采用0.35mmol/LNaCl直接抽提拓扑异构酶，测试得到相同的结果(资料未显示)。中华灵芝宝作为拓扑异构酶抑制剂，可能一方面通过稳定可切割复合物，造成DNA的异常重组，从而激发细胞内一系列可导致细胞死亡的生化过程；另一方面干扰基因的转录，从而影响癌基因的表达〔10，11〕。
, http://www.100md.com
图4 中华灵芝宝诱导K562细胞凋亡
本研究还发现中灵芝宝不仅能促进拓扑异构酶介导的DNA断裂，本身还能直接作用于DNA，非特异性打断DNA链，影响肿瘤细胞的生长。这一点与阿霉素、柔红霉素作用相似，它们也既能直接作用DNA，又能通过拓扑异构酶促使DNA断裂〔4〕。
凋亡是细胞在基因调控下的一种主动死亡。大多数抗癌药物都可引起肿瘤细胞的凋亡；诱导细胞凋亡可能是不同机制抗癌药物发挥作用的共同通路，所以细胞凋亡成为评估抗癌药物作用能力的一项新指标。据文献报道，拓扑异构酶抑制剂往往可诱导肿瘤细胞的凋亡〔12～14〕，我们的实验也印证了这一点。由于中华灵芝宝水溶液呈棕色混悬，进行凋亡细胞的形态观察和流式细胞仪测定凋亡细胞百分率比较困难，因此我们根据凋亡细胞的生化特征，选择琼脂糖凝胶电泳观察中华灵芝宝诱导K562细胞凋亡的能力。结果中华灵芝宝在浓度大于5mg/ml剂量作用24小时后，就能诱导人红白血病K562细胞的凋亡。K562细胞对多种化疗药物高度耐受，不易引起凋亡；中华灵芝宝是混合物能显示作用更证明其具有直接细胞毒作用。
, 百拇医药
以上实验揭示了中华灵芝宝抗肿瘤的部分作用机制，表明灵芝类物质除免疫调节作用外，对肿瘤细胞有直接作用。由于中华灵芝宝成分众多，究竟是何种成分起主要作用，以及是否还有其它的作用机理，尚须做进一步的深入探讨和研究。
〔参考文献〕
〔1〕谭允育，崔德玉.灵芝水煎剂免疫药理作用的研究〔J〕.北京中医药大学，1996，19(5)：61.
〔2〕余素清，吴树勋，刘京生，等.灵芝孢子粉对小鼠免疫功能的影响及抗60Co辐射效应〔J〕.中国中药杂志，1997，22(10)：625.
〔3〕萨姆布鲁克，弗里奇，曼尼阿斯蒂.分子克隆实验指南〔M〕.第二版.科学出版社，1992：17，55，19.
〔4〕刘晓梅，王龙贵，籍秀娟.以DNA拓扑异构酶Ⅱ为靶点的一种抗癌筛选新的方法〔J〕.癌症，1991，10(3)：220.
, 百拇医药
〔5〕韩锐.抗癌药物研究与实验技术〔M〕.北京：北京医科大学与中国协和医科大学联合出版社，1997：397.
〔6〕Eng WK,Faucette L,Johnson RK,et al.Evidence that DNA topoisomerase Ⅰ is necessary for the cytotoxic effects of camptothecin〔J〕.Mol Pharmacol,1988,34： 755～760.
〔7〕Pommier Y.DNA topoisomerase Ⅰand Ⅱ in cancer chemotherapy：update and perspectives〔J〕.Cancer Chemother Pharmacol,1993,32：103～108.
〔8〕Liu LF.DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs〔J〕.Annu Rev Biochem,1989,58：351～375.
, http://www.100md.com
〔9〕Cummings J,Macpherson J S,Meikle Ⅰ,et al.Development of anthraceny-amino conjugates as topoisomerase Ⅰand Ⅱ inhibitors that circumvent drug resistance 〔J〕. Biochem. Pharmacol,1996,52：979～990.
〔10〕Pommier Y,Schwartz RE,Zwelling LA,et al. Effects of DNA intercalating agents on topoisomerase Ⅱ induced DNA strand cleavage in isolated mammalian cell nuclei〔J〕.Biochemistry,1985,24：6406～6410.
〔11〕Riou JF, Multon E,Vilarem MJ,et al. In vivo stimulation by antitumor drugs of the topoisomerase Ⅱ induced cleavage sites in c-myc protooncogene〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,1986,137：154～160.
, 百拇医药
〔12〕Del Bino G,Skierski J,Darzynkiewicz Z,et al.Diverse effects of camptothecin,an inhibitor of topoisomerase Ⅰ on the cell cycle of lymphocytinc (L1210,MOLT-4)and myelogenous (HL-60,KGl)leukemic cells〔J〕.Cancer Res,1990,50：5746～5750.
〔13〕Del Bino G,Darzynkiewicz Z.Camptothecin,teniposide or 4'-(9-acridinylamino)-3-methanesulfon-m-anisidide, but not mitoxantrone or doxorubicin,induced degradation of nuclear DNA in the S phase of HL-60 cells〔J〕.Cancer Res,1991,51：1165.
〔14〕Del Bino G,Bruno S,Yi P-N, et al.Apoptotic cell death triggered by camptothecin or teniposide.The cell cycle specificity and ionizing radiation〔J〕.Cell Prolif,1992,25：537～548.
收稿日期：1999-03-18；修回日期：1999-04-20, 百拇医药