全反式维甲酸和1,25-二羟维生素D3联合应用对大肠癌细胞的分化诱导作用
作者：郭俊明,何小洪,廖异平,罗超权
单位：郭俊明，罗超权 中山医科大学生物化学教研室(广州,510089)；何小洪 中山医科大学附属一院心内科实验室；廖异平 中山医科大学组胚学教研室
关键词：全反式维甲酸；1；25-二羟维生素D3；LoVo细胞；诱导分化
癌症990608 【摘要】目的：观察联合使用全反式维甲酸(all-trans-retinoicacid,ATRA)和1,25-二羟维生素D3对大肠癌细胞株LoVo的影响。方法：以MTT法测定细胞生长，碱性磷酸酶(alkaline phosphatases,ALP)比活性检测细胞分化。结果：ATAR和1,25-二羟维生素D3对LoVo生长的抑制作用在一定浓度范围内呈时间浓度依赖关系，联合用药时抑制作用增强。经药物作用细胞后肠型ALP逐渐升高。结论：联合使用ATRA和1,25-二羟维生素D3诱导LoVo细胞分化比单独用药效果更好。
, 百拇医药
中图分类号：R735.34 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)06-0649-03
Differential effects of combinative using all-trans-retinoic acid and1,25-dihydroxy vitamin D3 on large intestinal cancer cells
GUO Jun-ming,HE Xiao-hong,LIAO Yi-ping,et al.
Department of Biochemistry,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Gunagzhou 510089,P.R.China
【Abstract】 Objective：To observe the differentiation effects of combinative use of all-trans-retinoic acid (ATRA) and 1,25-dihydroxy vitamin D3 on large intestinal cancer cells. Methods： Growth inhibition was studied using MTT assay. Differentiation was assessed by alkaline phosphatases (ALP) relative activities. Results： The inhibitions of ATRA and 1,25-dihydroxy vitamin D3 on LoVo appeared in a dose and time dependent manners. The inhibition was increased as combinative use of both of them. The intestinal type of ALP was gradually increased by drug treatment. Conclusion： The differentiation effects of combinative use of ATRA and 1,25-dihydroxy vitamin D3 on LoVo cells was better than that of use of any one inducer only.
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Key words：All-trans-retinoic acid; 1,25-dihydroxy vitamin D3;LoVo cells; Differentiation
传统化学治疗是治疗恶性肿瘤的主要方法之一，但它的基本原理是干扰细胞代谢而使细胞死亡，这也会对增殖旺盛的正常细胞(如：骨髓细胞、生殖细胞等)产生杀伤作用而具有严重的副作用。另外，由于肿瘤细胞耐药现象的逐渐增多，进一步限制了化疗的应用。自从1971年Friend等发现二甲基亚砜可诱导小鼠红白血病细胞分化为成熟红细胞而产生血红蛋白以来，诱导分化作为一种有效的治疗肿瘤的方法引起了人们的普遍重视〔1,2〕。
全反式维甲酸(all-trans-retinoicacid，ATRA)是一种公认的诱导分化剂，对多种肿瘤细胞有诱导分化作用〔3〕。近年来大量实验证明，1，25-二羟维生素D3(1，25-(OH)2VD3)除了具有经典的调节钙磷代谢作用外，对许多类型细胞的生长分化过程均有明显的调节作用，显示其具有良好的抗肿瘤潜能〔4〕。但是诱导分化疗法往往需要较大剂量，从而产生较严重的毒副作用。因此，进一步研究诱导分化的作用机理和联合应用诱导剂，以提高其疗效是本研究领域的重点课题。国内外联合应用诱导剂研究白血病的文献较多，但联合应用ATRA和1，25-(OH)2VD3对大肠癌细胞进行诱导分化研究的尚未见报道。为探讨联合应用诱导剂对实体瘤(大肠癌)进行治疗的可行性，本研究联合应用ATRA和1，25-(OH)2VD3对大肠癌细胞株LoVo进行了诱导分化研究，现将实验结果报道如下。
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1材料和方法
1.1材料
ATRA(Sigma)和1,25-(OH)2VD3(Roche)用无水乙醇溶解后无菌过滤，避光保存。氮蓝四唑盐(MTT)购自华美公司，碱性磷酸酶(alkaline phosphatases,ALP)试剂盒为Unison公司产品，脱氧胆酸钠为Sigma公司产品。
1.2细胞株与细胞培养
LoVo细胞株由本校动物中心提供，常规培养于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液(Gibco)中，37℃，5%CO2培养。48小时弱光下换液一次，取对数生长期细胞进行实验。
1.3细胞增殖测定
用MTT法〔5〕。药物分为1×10-4mol/L～1×10-8mol/LATRA5组、1×10-7mol/L～1×10-9mol/L1,25-(OH)2VD33组、1×10-6mol/LATRA/1×10-7mol/L1,25-(OH)2VD3、1×10-5mol/LATRA/1×10-7mol/L1，25-(OH)2VD3和1×10-6mol/LATRA/1×10-8mol/L1,25-(OH)2VD34组共12组，另设对照组和空白组。用570nm和630nm双波长测定A值，按方差分析进行数据分析。生长抑制率(%)=(对照组A值-实验组A值)/(对照组A值-空白组A值)。
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1.4ALP比活性测定〔6〕
细胞常规消化后用0.25%脱氧胆酸钠溶解后置液氮中备测。
2结果
2.1细胞形态学变化
对照细胞呈多形性，经药物作用后细胞体积变小，核浆比例减小。
2.2MTT检测结果
ATRA对LoVo细胞有抑制作用，在一定浓度范围内(1×10-5mol/L～1×10-7mol/L)呈现时间浓度依赖关系(10-5mol/L组，P<0.01；其它组，P<0.05)；而当浓度过高(1×10-4mol/L)时，大部分细胞已死亡，ATRA表现有毒性(P<0.01)；但当浓度为1×10-8mol/L时，细胞生长反而比对照快(P<0.05)(图1)。1,25-(OH)2VD3对LoVo细胞的抑制也有明显的时间依赖关系(各组，P<0.01)，其与ATRA不同的是早期(第2天)就有抑制作用(图2)。两药物同时使用时也有明显的作用(各组，P<0.01)，当VD3浓度固定时，增加ATRA的浓度抑制率下降；但ATRA浓度不变而增加VD3浓度抑制率升高(表1)。
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图1 ATRA诱导LoVo细胞MTT测定曲线0：对照组；1～5：实验组,ATRA的浓度依次为
10-4、10-5、10-6、10-7和10-8(mol/L)
图2 1,25-(OH)2VD3诱导LoVo细胞MTT测定曲线0：对照组;1～3：实验组,1,25-(OH)2VD3的浓度次为10-7、10-8和10-9(mol/L)
表1 联合使用ATRA和1,25-(OH)2VD3对LoVo的抑制率
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组别
例数
抑制率(%)
第2天
第2天
第6天
10-6mol/LATRA/10-7mol/LVD3
12
90.34
77.64
88.40
10-5mol/LATRA/10-7mol/LVD3
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12
88.30
74.07
77.97
10-6mol/LATRA/10-8mol/LVD3
12
82.20
74.17
92.36
2.3肠型ALP比活性测定结果
在ATRA或1,25-(OH)2VD3作用下，ALP比活性随其浓度增加而逐渐升高，呈现时间浓度关系(P<0.05)。在1×10-5mol/LATRA/1×10-7mol/L1,25-(OH)2VD3联合作用下升高最明显，早期即升高(P<0.001，图3)。ALP值在65℃温育后即显著下降，这说明升高的为大肠细胞所特有的肠型ALP(热不稳定型)。
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图3 联合用药诱导LoVo细胞后ALP比活性的变化
3讨论
诱导分化的作用机理与化疗的完全相反，它不是杀死肿瘤细胞而是使肿瘤细胞向正常细胞方向转化，从而降低其恶性度，其表现为形态学改变、细胞增殖能力下降和具有正常细胞的功能。如：红白血病细胞经诱导分化后的主要生化指标是产生血红蛋白，表现为联苯胺试验阳性〔1〕。
维甲酸是一种常用的诱导分化剂，国内外研究表明它可使多种肿瘤细胞逆转〔2，3〕。单独使用ATRA具有诱导LoVo细胞分化的作用〔7〕。本实验也证实了在一定浓度范围内它对LoVo细胞的作用呈现出时间浓度依赖关系；另本实验观察到一有意义的现象：当其作用浓度过低(1×10-8mol/L)时细胞增长反而加快。其原因可能是ATRA是维生素A的衍生物，具有促进生长、调节免疫、分化等多种生理功能〔8〕。因此，选用ATRA作为诱导剂应注意合适剂量，本实验结果显示，其有效作用浓度为1×10-5mol/L～1×10-7mol/L。
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1,25-(OH)2VD3已被有效地应用于诱导分化的研究中，但其用量往往较大，因而副作用较大，若能与其它药物联合使用可降低其副作用。使用腺苷酸环化酶激活剂可使维生素D3受体基因表达升高，从而提高细胞对1,25-(OH)2VD3的反应性，降低维生素D3的用量〔4〕。
研究表明，ATRA和1,25-(OH)2VD3通过相应受体即维甲酸受体(retinoic acid receptor,RAR)和维生素D3受体(vitamin D3 receptor,VDR)介导的核内信号传递途径产生诱导分化作用，而且这两种途径存在交叉现象〔9〕。有趣的是在白血病细胞株的诱导分化实验中发现，先后使用这两种诱导剂并无叠加效果，而只有两者联合使用时才可使癌细胞的逆转效果增强〔10〕。
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本实验联合使用ATRA和1,25-(OH)2VD3诱导大肠癌细胞，结果显示细胞增长明显比单独用药时慢，诱导分化的标志性酶(肠型ALP)明显升高。这说明体外联合使用这两种诱导剂对大肠癌等实体瘤细胞进行诱导是可行的。由于单独使用ATRA会产生耐药性和停药后易旧病复发〔10〕以及单独使用1,25-(OH)2VD3有较严重的副作用，因此，联合使用诱导剂是一种有广泛应用前景的、相对无毒性的治疗肿瘤的新方法。
〔参考文献〕
〔1〕Friend C, Scher W, Holland JG, et al. Hemoglobin synthesis in murine virus-induced leukemia cells in vitro：stimulation of erythroid differentiation by dimethyl sulfoxide〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1971,68：378～382.
, 百拇医药
〔2〕Honma Y,Takenaga K,Kasukabe T,et al.Induction of differentiation of cultured human promyelocytic leukemin cells by retinoids〔J〕.Biochem Biophys Res Commun, 1980,95：507～512.
〔3〕Warrell RP Jr.Application for retinoids in cancer therapy〔J〕.Semin Hematol,1994,31 (4suppl 5)：1～13.
〔4〕宋亮年,孙琳琳.Forskolin 对1,25-二羟维生素D3受体mRNA表达的调节及其生物学意义〔J〕.第二军医大学学报,1996,17(6)：513.
〔5〕温汉平，王小宁，孙华蕴.肿瘤细胞体外药敏试验MTT分析法〔J〕.中华肿瘤杂志，1993, 15(6)：470.
, 百拇医药
〔6〕Herz F,Halwer M.Differential effects of sodium butyrate and hypermosolality on the modulation of alkaline phosphatases of LoVo cells〔J〕.Exp Cell Res,1990,188(1)：50～54.
〔7〕郁宝铭,陆爱国,郑民华,等.全反式维甲酸诱导大肠癌细胞分化的实验研究〔J〕.实用癌症杂志,1997,12(4)：241.
〔8〕Smith MA,Parkinson DR,Cheson BD,et al.Retinoids in cancer therapy〔J〕.J Clin Oncol,1992,10(5)：839～864.
〔9〕Nakajima H,Kizaki M,Ueno H,et al.All-trans and 9-cis retinoic acid enhance 1,25-dihydroxyvitamin D3-induced monocytic differentiation of U937 cells〔J〕.Leuk Res, 1996,20(8)：665～676.
〔10〕Camagna A,Testa U,Masciulli R, et al.The synergistic effect of simultaneous addition of retinoic acid and vitamin D3 on the in-vitro differentiation of human promyelocytic leukemia cell lines could be efficiently transposed in vivo〔J〕.Med Hypotheses,1998,50(3)：253～257.
收稿日期：1999-02-02;修回日期：1999-06-08, 百拇医药
单位：郭俊明，罗超权 中山医科大学生物化学教研室(广州,510089)；何小洪 中山医科大学附属一院心内科实验室；廖异平 中山医科大学组胚学教研室
关键词：全反式维甲酸；1；25-二羟维生素D3；LoVo细胞；诱导分化
癌症990608 【摘要】目的：观察联合使用全反式维甲酸(all-trans-retinoicacid,ATRA)和1,25-二羟维生素D3对大肠癌细胞株LoVo的影响。方法：以MTT法测定细胞生长，碱性磷酸酶(alkaline phosphatases,ALP)比活性检测细胞分化。结果：ATAR和1,25-二羟维生素D3对LoVo生长的抑制作用在一定浓度范围内呈时间浓度依赖关系，联合用药时抑制作用增强。经药物作用细胞后肠型ALP逐渐升高。结论：联合使用ATRA和1,25-二羟维生素D3诱导LoVo细胞分化比单独用药效果更好。
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中图分类号：R735.34 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)06-0649-03
Differential effects of combinative using all-trans-retinoic acid and1,25-dihydroxy vitamin D3 on large intestinal cancer cells
GUO Jun-ming,HE Xiao-hong,LIAO Yi-ping,et al.
Department of Biochemistry,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Gunagzhou 510089,P.R.China
【Abstract】 Objective：To observe the differentiation effects of combinative use of all-trans-retinoic acid (ATRA) and 1,25-dihydroxy vitamin D3 on large intestinal cancer cells. Methods： Growth inhibition was studied using MTT assay. Differentiation was assessed by alkaline phosphatases (ALP) relative activities. Results： The inhibitions of ATRA and 1,25-dihydroxy vitamin D3 on LoVo appeared in a dose and time dependent manners. The inhibition was increased as combinative use of both of them. The intestinal type of ALP was gradually increased by drug treatment. Conclusion： The differentiation effects of combinative use of ATRA and 1,25-dihydroxy vitamin D3 on LoVo cells was better than that of use of any one inducer only.
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Key words：All-trans-retinoic acid; 1,25-dihydroxy vitamin D3;LoVo cells; Differentiation
传统化学治疗是治疗恶性肿瘤的主要方法之一，但它的基本原理是干扰细胞代谢而使细胞死亡，这也会对增殖旺盛的正常细胞(如：骨髓细胞、生殖细胞等)产生杀伤作用而具有严重的副作用。另外，由于肿瘤细胞耐药现象的逐渐增多，进一步限制了化疗的应用。自从1971年Friend等发现二甲基亚砜可诱导小鼠红白血病细胞分化为成熟红细胞而产生血红蛋白以来，诱导分化作为一种有效的治疗肿瘤的方法引起了人们的普遍重视〔1,2〕。
全反式维甲酸(all-trans-retinoicacid，ATRA)是一种公认的诱导分化剂，对多种肿瘤细胞有诱导分化作用〔3〕。近年来大量实验证明，1，25-二羟维生素D3(1，25-(OH)2VD3)除了具有经典的调节钙磷代谢作用外，对许多类型细胞的生长分化过程均有明显的调节作用，显示其具有良好的抗肿瘤潜能〔4〕。但是诱导分化疗法往往需要较大剂量，从而产生较严重的毒副作用。因此，进一步研究诱导分化的作用机理和联合应用诱导剂，以提高其疗效是本研究领域的重点课题。国内外联合应用诱导剂研究白血病的文献较多，但联合应用ATRA和1，25-(OH)2VD3对大肠癌细胞进行诱导分化研究的尚未见报道。为探讨联合应用诱导剂对实体瘤(大肠癌)进行治疗的可行性，本研究联合应用ATRA和1，25-(OH)2VD3对大肠癌细胞株LoVo进行了诱导分化研究，现将实验结果报道如下。
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1材料和方法
1.1材料
ATRA(Sigma)和1,25-(OH)2VD3(Roche)用无水乙醇溶解后无菌过滤，避光保存。氮蓝四唑盐(MTT)购自华美公司，碱性磷酸酶(alkaline phosphatases,ALP)试剂盒为Unison公司产品，脱氧胆酸钠为Sigma公司产品。
1.2细胞株与细胞培养
LoVo细胞株由本校动物中心提供，常规培养于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液(Gibco)中，37℃，5%CO2培养。48小时弱光下换液一次，取对数生长期细胞进行实验。
1.3细胞增殖测定
用MTT法〔5〕。药物分为1×10-4mol/L～1×10-8mol/LATRA5组、1×10-7mol/L～1×10-9mol/L1,25-(OH)2VD33组、1×10-6mol/LATRA/1×10-7mol/L1,25-(OH)2VD3、1×10-5mol/LATRA/1×10-7mol/L1，25-(OH)2VD3和1×10-6mol/LATRA/1×10-8mol/L1,25-(OH)2VD34组共12组，另设对照组和空白组。用570nm和630nm双波长测定A值，按方差分析进行数据分析。生长抑制率(%)=(对照组A值-实验组A值)/(对照组A值-空白组A值)。
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1.4ALP比活性测定〔6〕
细胞常规消化后用0.25%脱氧胆酸钠溶解后置液氮中备测。
2结果
2.1细胞形态学变化
对照细胞呈多形性，经药物作用后细胞体积变小，核浆比例减小。
2.2MTT检测结果
ATRA对LoVo细胞有抑制作用，在一定浓度范围内(1×10-5mol/L～1×10-7mol/L)呈现时间浓度依赖关系(10-5mol/L组，P<0.01；其它组，P<0.05)；而当浓度过高(1×10-4mol/L)时，大部分细胞已死亡，ATRA表现有毒性(P<0.01)；但当浓度为1×10-8mol/L时，细胞生长反而比对照快(P<0.05)(图1)。1,25-(OH)2VD3对LoVo细胞的抑制也有明显的时间依赖关系(各组，P<0.01)，其与ATRA不同的是早期(第2天)就有抑制作用(图2)。两药物同时使用时也有明显的作用(各组，P<0.01)，当VD3浓度固定时，增加ATRA的浓度抑制率下降；但ATRA浓度不变而增加VD3浓度抑制率升高(表1)。
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图1 ATRA诱导LoVo细胞MTT测定曲线0：对照组；1～5：实验组,ATRA的浓度依次为
10-4、10-5、10-6、10-7和10-8(mol/L)
图2 1,25-(OH)2VD3诱导LoVo细胞MTT测定曲线0：对照组;1～3：实验组,1,25-(OH)2VD3的浓度次为10-7、10-8和10-9(mol/L)
表1 联合使用ATRA和1,25-(OH)2VD3对LoVo的抑制率
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组别
例数
抑制率(%)
第2天
第2天
第6天
10-6mol/LATRA/10-7mol/LVD3
12
90.34
77.64
88.40
10-5mol/LATRA/10-7mol/LVD3
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12
88.30
74.07
77.97
10-6mol/LATRA/10-8mol/LVD3
12
82.20
74.17
92.36
2.3肠型ALP比活性测定结果
在ATRA或1,25-(OH)2VD3作用下，ALP比活性随其浓度增加而逐渐升高，呈现时间浓度关系(P<0.05)。在1×10-5mol/LATRA/1×10-7mol/L1,25-(OH)2VD3联合作用下升高最明显，早期即升高(P<0.001，图3)。ALP值在65℃温育后即显著下降，这说明升高的为大肠细胞所特有的肠型ALP(热不稳定型)。
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图3 联合用药诱导LoVo细胞后ALP比活性的变化
3讨论
诱导分化的作用机理与化疗的完全相反，它不是杀死肿瘤细胞而是使肿瘤细胞向正常细胞方向转化，从而降低其恶性度，其表现为形态学改变、细胞增殖能力下降和具有正常细胞的功能。如：红白血病细胞经诱导分化后的主要生化指标是产生血红蛋白，表现为联苯胺试验阳性〔1〕。
维甲酸是一种常用的诱导分化剂，国内外研究表明它可使多种肿瘤细胞逆转〔2，3〕。单独使用ATRA具有诱导LoVo细胞分化的作用〔7〕。本实验也证实了在一定浓度范围内它对LoVo细胞的作用呈现出时间浓度依赖关系；另本实验观察到一有意义的现象：当其作用浓度过低(1×10-8mol/L)时细胞增长反而加快。其原因可能是ATRA是维生素A的衍生物，具有促进生长、调节免疫、分化等多种生理功能〔8〕。因此，选用ATRA作为诱导剂应注意合适剂量，本实验结果显示，其有效作用浓度为1×10-5mol/L～1×10-7mol/L。
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1,25-(OH)2VD3已被有效地应用于诱导分化的研究中，但其用量往往较大，因而副作用较大，若能与其它药物联合使用可降低其副作用。使用腺苷酸环化酶激活剂可使维生素D3受体基因表达升高，从而提高细胞对1,25-(OH)2VD3的反应性，降低维生素D3的用量〔4〕。
研究表明，ATRA和1,25-(OH)2VD3通过相应受体即维甲酸受体(retinoic acid receptor,RAR)和维生素D3受体(vitamin D3 receptor,VDR)介导的核内信号传递途径产生诱导分化作用，而且这两种途径存在交叉现象〔9〕。有趣的是在白血病细胞株的诱导分化实验中发现，先后使用这两种诱导剂并无叠加效果，而只有两者联合使用时才可使癌细胞的逆转效果增强〔10〕。
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本实验联合使用ATRA和1,25-(OH)2VD3诱导大肠癌细胞，结果显示细胞增长明显比单独用药时慢，诱导分化的标志性酶(肠型ALP)明显升高。这说明体外联合使用这两种诱导剂对大肠癌等实体瘤细胞进行诱导是可行的。由于单独使用ATRA会产生耐药性和停药后易旧病复发〔10〕以及单独使用1,25-(OH)2VD3有较严重的副作用，因此，联合使用诱导剂是一种有广泛应用前景的、相对无毒性的治疗肿瘤的新方法。
〔参考文献〕
〔1〕Friend C, Scher W, Holland JG, et al. Hemoglobin synthesis in murine virus-induced leukemia cells in vitro：stimulation of erythroid differentiation by dimethyl sulfoxide〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1971,68：378～382.
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〔2〕Honma Y,Takenaga K,Kasukabe T,et al.Induction of differentiation of cultured human promyelocytic leukemin cells by retinoids〔J〕.Biochem Biophys Res Commun, 1980,95：507～512.
〔3〕Warrell RP Jr.Application for retinoids in cancer therapy〔J〕.Semin Hematol,1994,31 (4suppl 5)：1～13.
〔4〕宋亮年,孙琳琳.Forskolin 对1,25-二羟维生素D3受体mRNA表达的调节及其生物学意义〔J〕.第二军医大学学报,1996,17(6)：513.
〔5〕温汉平，王小宁，孙华蕴.肿瘤细胞体外药敏试验MTT分析法〔J〕.中华肿瘤杂志，1993, 15(6)：470.
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〔6〕Herz F,Halwer M.Differential effects of sodium butyrate and hypermosolality on the modulation of alkaline phosphatases of LoVo cells〔J〕.Exp Cell Res,1990,188(1)：50～54.
〔7〕郁宝铭,陆爱国,郑民华,等.全反式维甲酸诱导大肠癌细胞分化的实验研究〔J〕.实用癌症杂志,1997,12(4)：241.
〔8〕Smith MA,Parkinson DR,Cheson BD,et al.Retinoids in cancer therapy〔J〕.J Clin Oncol,1992,10(5)：839～864.
〔9〕Nakajima H,Kizaki M,Ueno H,et al.All-trans and 9-cis retinoic acid enhance 1,25-dihydroxyvitamin D3-induced monocytic differentiation of U937 cells〔J〕.Leuk Res, 1996,20(8)：665～676.
〔10〕Camagna A,Testa U,Masciulli R, et al.The synergistic effect of simultaneous addition of retinoic acid and vitamin D3 on the in-vitro differentiation of human promyelocytic leukemia cell lines could be efficiently transposed in vivo〔J〕.Med Hypotheses,1998,50(3)：253～257.
收稿日期：1999-02-02;修回日期：1999-06-08, 百拇医药