原发性肝细胞癌组织中c-myc和p53基因的表达及意义
作者：史宪杰 李开宗 窦科峰 高志清 胡沛臻 马福成 杨守京
单位：史宪杰 李开宗 窦科峰 高志清 第四军医大学西京医院 1肝胆外科； 胡沛臻 马福成 杨守京 病理科 陕西省西安市 710032
关键词：肝肿瘤；癌，肝细胞；c-myc基因；p53基因；基因表达
中国图书馆分类号 R735中国图书馆分类号 R735.7
Subject headings liver neoplasms; carcinoma, hepatocellular; c-myc gene; p53 gene; gene expression
c-myc是常见的激活癌基因，它有导致细胞的恶性转化作用. p53基因是重要的抑癌基因，其突变失活在肿瘤的发生过程中起重要作用[1]. 我们应用免疫组织化学技术检测了79例原发性肝细胞癌和63例癌旁肝细胞中c-myc和P53蛋白的分布与表达，对C-myc，p53基因与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)发生、发展及恶性程度的关系并结合临床有关资料进行了探讨，报告如下.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 79例HCC标本均为第四军医大学西京医院外科手术及活检标本，组织经100mL/L中性福尔马林固定、石蜡包埋，5μm连续切片，分别作HE染色和免疫组织化学染色. 根据Edmondson分级标准进行分级，Ⅰ级10例，Ⅱ级30例，Ⅲ级31例，Ⅳ级8例. 鼠抗C-myc均购自美国Santa Cruz Biotechnology, Inc. 鼠抗P53mAb及Dako En VisionTM System两步法免疫组织化学染色试剂盒购自丹麦Dako公司.
1.2 方法 石蜡切片常规脱蜡至水，30mL/L H2O2甲醇封闭内源性过氧化物酶活性，室温下10min，PBS振洗5min×3，浸泡于10mmol/L柠檬酸缓冲液中(pH 6.0)，微波修复抗原10min，自然冷却至室温后蒸馏水洗涤，PBS振洗5min×3，100mL/L正常山羊血清封闭非特异背景染色37℃ 30min，切片加鼠抗C-myc mAb(1∶100)，鼠抗P53mAb(1∶100)，4℃过夜，37℃复温30min，PBS振洗5min×3，切片加mouse En VisionTM 37℃ 30min，PBS振洗5min×3，DAB呈色，苏木精衬染，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，树脂封片观察. 阳性对照：用已知p53及C-myc阳性的切片重复染色；阴性对照：用PBS代替第一抗体；替代对照：用正常鼠血清代替第一抗体.
, 百拇医药
2 结果
C-myc和P53蛋白免疫组化阳性物质为棕黄色颗粒，主要分布在细胞核. C-myc蛋白在癌组织及癌旁组织中的阳性率分别为81.0%(64/79)和12.7%(8/63)，两者比较差异显著(P<0.01)；P53蛋白在HCC中阳性表达率为50.6%(40/79)，明显高于癌旁6.3%(4/63)，两者比较差异显著(P<0.01)，根据Edmondson分级标准将HCC分成四个等级，HCC中C-myc和P53蛋白的表达与细胞分化程度密切相关，呈负相关(表1)，细胞分化的越好，阳性率越低.
表1 C-myc和P53蛋白表达与HCC组织病理分级的关系 n(%)
Edmondson
分级
n
, http://www.100md.com
C-myc表达
P53表达
-
+
-
+
Ⅰ
10
4
6(60.0)
8
2(20.0)
Ⅱ
, http://www.100md.com 30
7
23(76.7)
18
12(40.0)
Ⅲ
31
4
27(87.1)
12
19(61.3)
Ⅳ
8
, http://www.100md.com
0
8(100.0)
1
7(87.5)
3 讨论
c-myc癌基因编码的磷酸化蛋白Mr 62000，位于细胞核内，在所有具增殖潜力的细胞中均有表达，具有DNA结合能力，参与调节细胞增殖和分化[2，3]. Nisen et al[4]证实某些肿瘤中c-myc基因激活时，可伴有C-myc蛋白的过量表达. 在细胞增殖过程中，细胞增殖周期的G1期是影响细胞增殖速度的主要时相，调节细胞G1期向S期转化的因素包括正调节因子和负调节因子，C-myc蛋白是促使G1期向S期转化的调节因子[5]. 本研究结果HCC中C-myc蛋白的表达很高(81.0%)，癌旁组织中的阳性率为12.7%(8/63)，两者比较差异显著(P<0.01)，且C-myc蛋白阳性率与HCC细胞分化呈负相关性，细胞分化越差，阳性率越高. 追踪临床病例随访资料(43例)，结合本组实验结果表明，绝大多数C-myc蛋白高表达的病例，HCC恶性程度高，患者一般情况及肝功较差，HCC瘤体偏大，预后不佳.
, 百拇医药
抑癌基因的失活或突变与癌基因激活可导致肿瘤细胞的恶性转化和增殖. p53基因可分为野生型和突变型，前者为抑癌基因，后者为致癌基因. 由于野生型P53蛋白T1/2短，导致其含量低，不易检出，而突变型P53蛋白稳定性强，T1/2延长，可用免疫组化方法检出. 本组79例HCC中，40例(50.6%)P53蛋白阳性表达，阳性物质位于细胞核内，且与细胞分化程度密切相关，表明p53基因突变是HCC的频发事件. HCC发生是一个多步骤的过程，是由多种癌基因作用并伴有细胞异常增殖的转化过程. 对HCC作C-myc和P53基因蛋白的检测具有重要的意义，HCC细胞分化越差，临床分期越晚，两者的阳性表达率越高，回顾临床资料，患者术后生存率越低，预后越差，说明C-myc和P53蛋白的表达和分布与HCC发生、发展及临床预后有密切的关系.
通讯作者 史宪杰
4 参考文献
, 百拇医药 1 Tabor E. Tumor suppressor genes, growth factor genes, and oncogene in hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma. J Med Virol, 1994;42:357-365
2 Shibuya M, Yokota J, Ueyama Y. Amplication and exoression of a cellular oncogene(c-myc) in human gastric carcinoma. Mol Cell Biol, 1985;5:414-418
3 Alitalo K, Schwab M, Lin CC, Varmus HE, Bishop JM. Homogeneously stsining chromosomal regions contain amplified copies of an abundantly expressed cellular oncogene(c-myc) in colon carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA, 1983;80:1707-1711
, http://www.100md.com
4 Nisen PD, Zimmerman KA, Cotter SV, Gilbert F, Alt FW. Enhanced expression of the N-myc gene in wilms tumors. Cancer Res, 1986;46:6217-6222
5 Askew DS, Ashmun RA, Simmons BC, Cleveland JL. Constitutive c-myc expression in an IL-3-dependent myeloid cell line suppresses cell cycle arrest and acceleraters apoptosis. Oncogene, 1991;6:1915-1922
收稿日期 1998-12-11 修回日期 1999-03-01, http://www.100md.com
单位：史宪杰 李开宗 窦科峰 高志清 第四军医大学西京医院 1肝胆外科； 胡沛臻 马福成 杨守京 病理科 陕西省西安市 710032
关键词：肝肿瘤；癌，肝细胞；c-myc基因；p53基因；基因表达
中国图书馆分类号 R735中国图书馆分类号 R735.7
Subject headings liver neoplasms; carcinoma, hepatocellular; c-myc gene; p53 gene; gene expression
c-myc是常见的激活癌基因，它有导致细胞的恶性转化作用. p53基因是重要的抑癌基因，其突变失活在肿瘤的发生过程中起重要作用[1]. 我们应用免疫组织化学技术检测了79例原发性肝细胞癌和63例癌旁肝细胞中c-myc和P53蛋白的分布与表达，对C-myc，p53基因与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)发生、发展及恶性程度的关系并结合临床有关资料进行了探讨，报告如下.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 79例HCC标本均为第四军医大学西京医院外科手术及活检标本，组织经100mL/L中性福尔马林固定、石蜡包埋，5μm连续切片，分别作HE染色和免疫组织化学染色. 根据Edmondson分级标准进行分级，Ⅰ级10例，Ⅱ级30例，Ⅲ级31例，Ⅳ级8例. 鼠抗C-myc均购自美国Santa Cruz Biotechnology, Inc. 鼠抗P53mAb及Dako En VisionTM System两步法免疫组织化学染色试剂盒购自丹麦Dako公司.
1.2 方法 石蜡切片常规脱蜡至水，30mL/L H2O2甲醇封闭内源性过氧化物酶活性，室温下10min，PBS振洗5min×3，浸泡于10mmol/L柠檬酸缓冲液中(pH 6.0)，微波修复抗原10min，自然冷却至室温后蒸馏水洗涤，PBS振洗5min×3，100mL/L正常山羊血清封闭非特异背景染色37℃ 30min，切片加鼠抗C-myc mAb(1∶100)，鼠抗P53mAb(1∶100)，4℃过夜，37℃复温30min，PBS振洗5min×3，切片加mouse En VisionTM 37℃ 30min，PBS振洗5min×3，DAB呈色，苏木精衬染，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，树脂封片观察. 阳性对照：用已知p53及C-myc阳性的切片重复染色；阴性对照：用PBS代替第一抗体；替代对照：用正常鼠血清代替第一抗体.
, 百拇医药
2 结果
C-myc和P53蛋白免疫组化阳性物质为棕黄色颗粒，主要分布在细胞核. C-myc蛋白在癌组织及癌旁组织中的阳性率分别为81.0%(64/79)和12.7%(8/63)，两者比较差异显著(P<0.01)；P53蛋白在HCC中阳性表达率为50.6%(40/79)，明显高于癌旁6.3%(4/63)，两者比较差异显著(P<0.01)，根据Edmondson分级标准将HCC分成四个等级，HCC中C-myc和P53蛋白的表达与细胞分化程度密切相关，呈负相关(表1)，细胞分化的越好，阳性率越低.
表1 C-myc和P53蛋白表达与HCC组织病理分级的关系 n(%)
Edmondson
分级
n
, http://www.100md.com
C-myc表达
P53表达
-
+
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Ⅰ
10
4
6(60.0)
8
2(20.0)
Ⅱ
, http://www.100md.com 30
7
23(76.7)
18
12(40.0)
Ⅲ
31
4
27(87.1)
12
19(61.3)
Ⅳ
8
, http://www.100md.com
0
8(100.0)
1
7(87.5)
3 讨论
c-myc癌基因编码的磷酸化蛋白Mr 62000，位于细胞核内，在所有具增殖潜力的细胞中均有表达，具有DNA结合能力，参与调节细胞增殖和分化[2，3]. Nisen et al[4]证实某些肿瘤中c-myc基因激活时，可伴有C-myc蛋白的过量表达. 在细胞增殖过程中，细胞增殖周期的G1期是影响细胞增殖速度的主要时相，调节细胞G1期向S期转化的因素包括正调节因子和负调节因子，C-myc蛋白是促使G1期向S期转化的调节因子[5]. 本研究结果HCC中C-myc蛋白的表达很高(81.0%)，癌旁组织中的阳性率为12.7%(8/63)，两者比较差异显著(P<0.01)，且C-myc蛋白阳性率与HCC细胞分化呈负相关性，细胞分化越差，阳性率越高. 追踪临床病例随访资料(43例)，结合本组实验结果表明，绝大多数C-myc蛋白高表达的病例，HCC恶性程度高，患者一般情况及肝功较差，HCC瘤体偏大，预后不佳.
, 百拇医药
抑癌基因的失活或突变与癌基因激活可导致肿瘤细胞的恶性转化和增殖. p53基因可分为野生型和突变型，前者为抑癌基因，后者为致癌基因. 由于野生型P53蛋白T1/2短，导致其含量低，不易检出，而突变型P53蛋白稳定性强，T1/2延长，可用免疫组化方法检出. 本组79例HCC中，40例(50.6%)P53蛋白阳性表达，阳性物质位于细胞核内，且与细胞分化程度密切相关，表明p53基因突变是HCC的频发事件. HCC发生是一个多步骤的过程，是由多种癌基因作用并伴有细胞异常增殖的转化过程. 对HCC作C-myc和P53基因蛋白的检测具有重要的意义，HCC细胞分化越差，临床分期越晚，两者的阳性表达率越高，回顾临床资料，患者术后生存率越低，预后越差，说明C-myc和P53蛋白的表达和分布与HCC发生、发展及临床预后有密切的关系.
通讯作者 史宪杰
4 参考文献
, 百拇医药 1 Tabor E. Tumor suppressor genes, growth factor genes, and oncogene in hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma. J Med Virol, 1994;42:357-365
2 Shibuya M, Yokota J, Ueyama Y. Amplication and exoression of a cellular oncogene(c-myc) in human gastric carcinoma. Mol Cell Biol, 1985;5:414-418
3 Alitalo K, Schwab M, Lin CC, Varmus HE, Bishop JM. Homogeneously stsining chromosomal regions contain amplified copies of an abundantly expressed cellular oncogene(c-myc) in colon carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA, 1983;80:1707-1711
, http://www.100md.com
4 Nisen PD, Zimmerman KA, Cotter SV, Gilbert F, Alt FW. Enhanced expression of the N-myc gene in wilms tumors. Cancer Res, 1986;46:6217-6222
5 Askew DS, Ashmun RA, Simmons BC, Cleveland JL. Constitutive c-myc expression in an IL-3-dependent myeloid cell line suppresses cell cycle arrest and acceleraters apoptosis. Oncogene, 1991;6:1915-1922
收稿日期 1998-12-11 修回日期 1999-03-01, http://www.100md.com