聚合酶链反应技术应用中的问题
作者：覃锦耀 李国坚
单位：广西医科大学第一附属医院(南宁530021)
关键词：
广西预防医学990620
聚合酶链反应(PCR)技术是特异性DNA序列体外引物定向酶促技术。经过十多年的发展，此技术渗透了生物学科的各个分支，已在细菌、病毒、遗传基因和肿瘤基因分析等领域广泛应用[1]。可以说，PCR技术的发明是分子生物学技术的革命性突破。然而，目前PCR技术在应用中尚存在不少问题，现综述如下。
1 仪器设备不配套或性能不良
如没有配置旋涡混合器、PH计，没有标准的微量加样器和超净工作台，没有合格的紫外透射仪，更重要的是PCR热循环仪的性能差。有些PCR仪导热元件质量差或仪器上的管孔与反应管不匹配，使导热性能下降，直接影响扩增效果。有些仪器显示温度与实际温度不符，有可能使TaqDNA聚合酶在94℃变性时，被实际上过高的温度所破坏，造成PCR失败。
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2 实验室布局不合理
如检测间和其它区间相通或混合在一起，会造成严重污染。这是因为样品中各种核酸片段(包括靶序列、非特异性片段等)均可通过空气传播，造成整个实验室空气、仪器设备及加样器的污染，进而造成PCR反应管中试剂的污染。另外，消毒不严格、操作不规范导致残留扩增产物污染，使结果全部阳性或有大量非特异产物。
3 取样和制备DNA模板的问题
采取标本的方法或部位不正确，会影响PCR检测结果。如痰液取到了唾液或鼻涕，尤其是儿童更不易获得真正的痰液。在这种情况下，有人建议用外周血白细胞检测结核分枝杆菌，认为可提高肺结核诊断的敏感性和准确性[2～5]。如果病人取样部位病原菌消失，应根据病人的病理情况采样。如伤寒杆菌的菌血症期已过，仍以血标本进行PCR就不可能与病情一致。
在制备模板时，要消除PCR反应及TaqDNA聚合酶的抑制物质，包括样品或细菌中蛋白质，酚、血卟啉等。尤其是血卟啉是一种螯合剂，通过与Mg2+结合从而抑制酶的催化反应。若细胞和细胞器崩解，核酸酶被激活，可以使待检DNA降解，降解的DNA能与靶DNA竞争使非特异性产物增加，减少特异性DNA扩增产量[6～7]。在检测血中病毒RNA时，血样品中加入强变性剂后，蛋白质变性凝块，这些凝块包埋了未变性的蛋白质和未被裂解的病毒，还包埋着有活性的RNA酶和已释放的部分RNA，如果不用旋涡振荡器充分混匀，就不能使所有的蛋白质变性，不能使病毒RNA都释放出来，也不能使所有的降解RNA的RNA酶失活，以保证RNA的完整。
, 百拇医药
4 PCR试剂的质量问题
PCR试剂的质量直接影响着检测结果，因此应注意：(1)除了考虑引物的保守性和特异性、引物的长度和G+C的含量外，引物的使用浓度很重要，过高浓度易导致非特异性产物合成，过低浓度则影响扩增产量。(2)dNTPs经碱中和后在缓冲体系中的稳定性明显增加，而分装和浓贮冻存、减少冻化次数也能有效地保持dNTPs的能量和稳定性。反应体系中高浓度dNTPs不仅会抑制DNA聚合酶的活性，而且容易产生错误掺入[8]。(3)高质量的Taq-DNA聚合酶对PCR扩增至关重要，而使用重组酶可得到高纯度的产物[9]。酶的浓度过低会使靶序列产物很低，过高则可在复性和延伸阶段干扰试验，出现非特异性扩增带。(4)DNA模扳、引物、dNTPs的磷酸基、EDTA等都可以与Mg2+结合，降低Mg2+浓度，当Mg2+浓度过低时，TaqDNA聚合酶的活力显著降低，产物量减少。而Mg2+浓度过高则可催化非特异性扩增。有报道，将Mg2+浓度优化为0.3mmol/L时，结核杆菌的扩增带最清晰，产物量最大[10]。(5)在PCR缓冲液中加入一些酶的稳定剂，如0.01%的明胶，有利于扩增效果。制备电泳凝胶用的缓冲液与电泳缓冲液不一致时，轻则DNA带较宽、不齐，重则无DNA带型。
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5 关于PCR程序的循环参数
(1)变性温度与时间主要取决于所扩增片段的长短与序列的G+C含量。温度过低，DNA双链解开不完全，产物降低或扩增失败，温度过高则影响酶的活性甚至失活。变性的时间太短太长都会影响产物的特异性。(2)退火温度主要取决于引物的长度和G+C含量，通常Tm=4×(G+C)+2×(A+T)。提高退火温度可减少非特异性扩增，消除拖尾现象。退火时间过长是没有必要的，但如果短于45秒会引起延伸失败，降低产量。(3)延伸温度及时间对扩增产物的特异性和产量均有影响。当延伸温度在TaqDNA聚合酶的最适温度时，酶活力最强。延伸时间主要取决于所扩增DNA片段的浓度和长度。浓度低、片段长则适当延长时间，反之则适当缩短时间。(4)在得到足够产物的前提下，减少延伸时间和循环次数，可防止非特异性扩增和引物二聚体形成。
6 消除假阴性和假阳性的方法
6.1 消除假阴性 (1)引物与靶DNA序列应有良好的互补性，尤其是3'端要绝对保证与靶基因互补。(2)采用高活性的TaqDNA聚合酶和最佳的反应系统。 (3)在冰浴条件下操作，防止逆转录酶在常温下失活和抑制组织细胞内源性RNA酶活性。(4)防止唾液、手表面的外源性RNA酶和酚、氯仿等抑制剂的污染。(5)吸头、离心管在使用前经0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)浸泡过夜再高压消毒。(6)在用痰和脑脊液检测结核杆菌时，标本量要足够大(≥2ml)。痰标本成分复杂，结核杆菌分布不均，取材太少不一定能获得此菌，并且靶DNA浓度很低时，其它真核和原核的DNA即会与其竞争，大量的非特异性扩增产物掩盖了特异性的片段。脑脊液标本量太少，就不能获得足够的DNA模板。这些都极易导致假阴性[11～13]。
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6.2 消除假阳性 (1)分区操作，经常用紫外线消毒，防止非样品性靶基因造成实验室的“随带性“污染。(2)放置和启闭离心管时防止样品间的交叉污染。(3)防止阳性对照管对待测样品的意外污染。(4)吸取样品和试剂时用力不应过猛，防止污染加样器头，而在加样品和试剂时也应动作轻巧，避免产生气溶胶污染。实验桌被污染的部位和加样器等， 常用1.0mol/L稀盐酸或过氯酸擦洗，使残存DNA脱嘌呤断链失活[9]。(5)采取抗污染措施，如加入UDG或用duTP代替dTTP。也可以采用热启动PCR以减少引物二聚体和非特异性扩增[14]。(6)采用单管PCR检测病毒RNA，使RNA提取、反转录及PCR都在一个反应管中进行，减少操作步骤，最大限度地减少了环境核酸或核酸酶造成的污染。用单管PCR检测HCV感染的样品中RNA获得了满意的效果[14～15]。
综上所述，PCR技术在应用中应充分考虑实验室的仪器装备、高素质的技术人员、试剂质量和经常性的质量监控等因素，只有这样，才能获得满意的检测结果。
, 百拇医药
参考文献
1 申昆玲，照日格图.聚合酶链反应技术在临床应用中需要注意的问题.中华儿科杂志，1997，35(7):341
2 Forbes BA,Hicks KES. Direct detection of Myc-obacterium tuberculosis in respiratory specimens in a clinical laboratory by polymerase chain re-action. J Clin Microbiol,1993,31:1688
3 Nolte FS, Metchock B, Mcgowan JE. Direct detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum by polymerase chain reaction and DNA hybridi-zation. J Clin Microbiol,1993,31:1777
, 百拇医药
4 Schluger NW ,condos R, Lewis S, et al. Amplification of DNA of Mycobacterium tuberculo-sis from peripheral blood of patients with pul-monary tuberculosis.Lancet, 1994,344:694
5 张吉旺， 彭 晓， 朱俊芳.肺结核患者外周血白细胞中结核分枝菌 DNA 的检测. 中华医学检验杂志， 1996， 19(3)： 173
6 黄嫦秀. 怎样控制PCR 在临床检验中的质量.四川医学， 1997， 18(6):405
7 马维芳，张基增， 徐湘民.用硫氰酸胍自外周血快速提取DNA. 临床检验杂志， 1995， 13( 3)：142
8 丁柳泰山 .PCR技术检测的质控问题经验谈.华西医学， 1997， 12(4)：413
, http://www.100md.com
9 张 正 . 聚合酶链反应方法学进展及临床价值的评估.中华医学检验杂志，1995，18(4)：246
10王俊霞，孙树汉.结核杆菌DNA聚合酶链反应中Mg2+浓度的优化.临床检验杂志，1995，14(4)：203
11 Shankar P, Manjunath N ,Mohan KK, et al.Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by polymerase chain reaction.Lancet,1991,337:5
12 李小英，张 捷，寇丽筠.聚合酶链反应与DNA探针检测临床标本中结核分枝杆菌的评价.中国防痨杂志，1997，19(1)：33
13 陈 忠摘.用聚合酶链反应早期诊断结核性脑膜炎. 国外医学(内科学分册), 1997， 18(1)：182
14 李君文，晁福寰.致病微生物PCR检测方法研究进展.中国卫生检验杂志，1997，7(5)：33
15 Ahmab N, Schiff GM, Baroudy BM. Detect-ton of viremia by a one step polymerase chain reaction method in hepatitis C virus infection.Virus Research,1993,30:303
1999-01-04收稿。1999-03-02修回。, http://www.100md.com
单位：广西医科大学第一附属医院(南宁530021)
关键词：
广西预防医学990620
聚合酶链反应(PCR)技术是特异性DNA序列体外引物定向酶促技术。经过十多年的发展，此技术渗透了生物学科的各个分支，已在细菌、病毒、遗传基因和肿瘤基因分析等领域广泛应用[1]。可以说，PCR技术的发明是分子生物学技术的革命性突破。然而，目前PCR技术在应用中尚存在不少问题，现综述如下。
1 仪器设备不配套或性能不良
如没有配置旋涡混合器、PH计，没有标准的微量加样器和超净工作台，没有合格的紫外透射仪，更重要的是PCR热循环仪的性能差。有些PCR仪导热元件质量差或仪器上的管孔与反应管不匹配，使导热性能下降，直接影响扩增效果。有些仪器显示温度与实际温度不符，有可能使TaqDNA聚合酶在94℃变性时，被实际上过高的温度所破坏，造成PCR失败。
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2 实验室布局不合理
如检测间和其它区间相通或混合在一起，会造成严重污染。这是因为样品中各种核酸片段(包括靶序列、非特异性片段等)均可通过空气传播，造成整个实验室空气、仪器设备及加样器的污染，进而造成PCR反应管中试剂的污染。另外，消毒不严格、操作不规范导致残留扩增产物污染，使结果全部阳性或有大量非特异产物。
3 取样和制备DNA模板的问题
采取标本的方法或部位不正确，会影响PCR检测结果。如痰液取到了唾液或鼻涕，尤其是儿童更不易获得真正的痰液。在这种情况下，有人建议用外周血白细胞检测结核分枝杆菌，认为可提高肺结核诊断的敏感性和准确性[2～5]。如果病人取样部位病原菌消失，应根据病人的病理情况采样。如伤寒杆菌的菌血症期已过，仍以血标本进行PCR就不可能与病情一致。
在制备模板时，要消除PCR反应及TaqDNA聚合酶的抑制物质，包括样品或细菌中蛋白质，酚、血卟啉等。尤其是血卟啉是一种螯合剂，通过与Mg2+结合从而抑制酶的催化反应。若细胞和细胞器崩解，核酸酶被激活，可以使待检DNA降解，降解的DNA能与靶DNA竞争使非特异性产物增加，减少特异性DNA扩增产量[6～7]。在检测血中病毒RNA时，血样品中加入强变性剂后，蛋白质变性凝块，这些凝块包埋了未变性的蛋白质和未被裂解的病毒，还包埋着有活性的RNA酶和已释放的部分RNA，如果不用旋涡振荡器充分混匀，就不能使所有的蛋白质变性，不能使病毒RNA都释放出来，也不能使所有的降解RNA的RNA酶失活，以保证RNA的完整。
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4 PCR试剂的质量问题
PCR试剂的质量直接影响着检测结果，因此应注意：(1)除了考虑引物的保守性和特异性、引物的长度和G+C的含量外，引物的使用浓度很重要，过高浓度易导致非特异性产物合成，过低浓度则影响扩增产量。(2)dNTPs经碱中和后在缓冲体系中的稳定性明显增加，而分装和浓贮冻存、减少冻化次数也能有效地保持dNTPs的能量和稳定性。反应体系中高浓度dNTPs不仅会抑制DNA聚合酶的活性，而且容易产生错误掺入[8]。(3)高质量的Taq-DNA聚合酶对PCR扩增至关重要，而使用重组酶可得到高纯度的产物[9]。酶的浓度过低会使靶序列产物很低，过高则可在复性和延伸阶段干扰试验，出现非特异性扩增带。(4)DNA模扳、引物、dNTPs的磷酸基、EDTA等都可以与Mg2+结合，降低Mg2+浓度，当Mg2+浓度过低时，TaqDNA聚合酶的活力显著降低，产物量减少。而Mg2+浓度过高则可催化非特异性扩增。有报道，将Mg2+浓度优化为0.3mmol/L时，结核杆菌的扩增带最清晰，产物量最大[10]。(5)在PCR缓冲液中加入一些酶的稳定剂，如0.01%的明胶，有利于扩增效果。制备电泳凝胶用的缓冲液与电泳缓冲液不一致时，轻则DNA带较宽、不齐，重则无DNA带型。
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5 关于PCR程序的循环参数
(1)变性温度与时间主要取决于所扩增片段的长短与序列的G+C含量。温度过低，DNA双链解开不完全，产物降低或扩增失败，温度过高则影响酶的活性甚至失活。变性的时间太短太长都会影响产物的特异性。(2)退火温度主要取决于引物的长度和G+C含量，通常Tm=4×(G+C)+2×(A+T)。提高退火温度可减少非特异性扩增，消除拖尾现象。退火时间过长是没有必要的，但如果短于45秒会引起延伸失败，降低产量。(3)延伸温度及时间对扩增产物的特异性和产量均有影响。当延伸温度在TaqDNA聚合酶的最适温度时，酶活力最强。延伸时间主要取决于所扩增DNA片段的浓度和长度。浓度低、片段长则适当延长时间，反之则适当缩短时间。(4)在得到足够产物的前提下，减少延伸时间和循环次数，可防止非特异性扩增和引物二聚体形成。
6 消除假阴性和假阳性的方法
6.1 消除假阴性 (1)引物与靶DNA序列应有良好的互补性，尤其是3'端要绝对保证与靶基因互补。(2)采用高活性的TaqDNA聚合酶和最佳的反应系统。 (3)在冰浴条件下操作，防止逆转录酶在常温下失活和抑制组织细胞内源性RNA酶活性。(4)防止唾液、手表面的外源性RNA酶和酚、氯仿等抑制剂的污染。(5)吸头、离心管在使用前经0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)浸泡过夜再高压消毒。(6)在用痰和脑脊液检测结核杆菌时，标本量要足够大(≥2ml)。痰标本成分复杂，结核杆菌分布不均，取材太少不一定能获得此菌，并且靶DNA浓度很低时，其它真核和原核的DNA即会与其竞争，大量的非特异性扩增产物掩盖了特异性的片段。脑脊液标本量太少，就不能获得足够的DNA模板。这些都极易导致假阴性[11～13]。
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6.2 消除假阳性 (1)分区操作，经常用紫外线消毒，防止非样品性靶基因造成实验室的“随带性“污染。(2)放置和启闭离心管时防止样品间的交叉污染。(3)防止阳性对照管对待测样品的意外污染。(4)吸取样品和试剂时用力不应过猛，防止污染加样器头，而在加样品和试剂时也应动作轻巧，避免产生气溶胶污染。实验桌被污染的部位和加样器等， 常用1.0mol/L稀盐酸或过氯酸擦洗，使残存DNA脱嘌呤断链失活[9]。(5)采取抗污染措施，如加入UDG或用duTP代替dTTP。也可以采用热启动PCR以减少引物二聚体和非特异性扩增[14]。(6)采用单管PCR检测病毒RNA，使RNA提取、反转录及PCR都在一个反应管中进行，减少操作步骤，最大限度地减少了环境核酸或核酸酶造成的污染。用单管PCR检测HCV感染的样品中RNA获得了满意的效果[14～15]。
综上所述，PCR技术在应用中应充分考虑实验室的仪器装备、高素质的技术人员、试剂质量和经常性的质量监控等因素，只有这样，才能获得满意的检测结果。
, 百拇医药
参考文献
1 申昆玲，照日格图.聚合酶链反应技术在临床应用中需要注意的问题.中华儿科杂志，1997，35(7):341
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, 百拇医药
4 Schluger NW ,condos R, Lewis S, et al. Amplification of DNA of Mycobacterium tuberculo-sis from peripheral blood of patients with pul-monary tuberculosis.Lancet, 1994,344:694
5 张吉旺， 彭 晓， 朱俊芳.肺结核患者外周血白细胞中结核分枝菌 DNA 的检测. 中华医学检验杂志， 1996， 19(3)： 173
6 黄嫦秀. 怎样控制PCR 在临床检验中的质量.四川医学， 1997， 18(6):405
7 马维芳，张基增， 徐湘民.用硫氰酸胍自外周血快速提取DNA. 临床检验杂志， 1995， 13( 3)：142
8 丁柳泰山 .PCR技术检测的质控问题经验谈.华西医学， 1997， 12(4)：413
, http://www.100md.com
9 张 正 . 聚合酶链反应方法学进展及临床价值的评估.中华医学检验杂志，1995，18(4)：246
10王俊霞，孙树汉.结核杆菌DNA聚合酶链反应中Mg2+浓度的优化.临床检验杂志，1995，14(4)：203
11 Shankar P, Manjunath N ,Mohan KK, et al.Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by polymerase chain reaction.Lancet,1991,337:5
12 李小英，张 捷，寇丽筠.聚合酶链反应与DNA探针检测临床标本中结核分枝杆菌的评价.中国防痨杂志，1997，19(1)：33
13 陈 忠摘.用聚合酶链反应早期诊断结核性脑膜炎. 国外医学(内科学分册), 1997， 18(1)：182
14 李君文，晁福寰.致病微生物PCR检测方法研究进展.中国卫生检验杂志，1997，7(5)：33
15 Ahmab N, Schiff GM, Baroudy BM. Detect-ton of viremia by a one step polymerase chain reaction method in hepatitis C virus infection.Virus Research,1993,30:303
1999-01-04收稿。1999-03-02修回。, http://www.100md.com