应用单细胞凝胶电泳技术检测辐射致外周血淋巴细胞DNA损伤
作者：洪承皎 王 静 童 建
单位：苏州医学院放射医学系，江苏 苏州 215007
关键词：单细胞凝胶电泳试验；电离辐射；淋巴细胞；DNA单链断裂(ssb)
中国工业医学杂志990610
摘要：应用单细胞凝胶电泳试验(SCGE)分别检测了受γ射线照射后小鼠及从事X射线探伤工人的外周血淋巴细胞DNA单链断裂(ssb)，结果发现：0.5Gy和5.0Gy的γ射线照射组小鼠，外周血淋巴细胞彗星百分率显著高于对照组；从事X射线探伤工人的外周血淋巴细胞彗星百分率也显著升高。提示SCGE检测的DNAssb可作为射线对健康影响的早期生物学指标。
中图分类号：R446.11+3；X591 文献标识码：A 文章编号：1002-221X(1999)06-0346-02
, 百拇医药
Detection of radiation-induced DNA damage in peripheral lymphocytes with single cell gelelectrophoresis
HONG Cheng-jiao，WANG Jing，TONG Jian
(Department of Radiation Medicine，Suzhou Medical College，Suzhou?215007，China)
Abstract：Objective To study radiation-induced DNA damage in peripheral lymphocytes.Methods Breakage of single strand DNA in mice exposed to γ-ray and in workers engaged in flaw-detection and exposed to X-ray was detected with single cell gel electrophoresis(SCGE).Results Comet percentage in peripheral lymphocytes increased in mice exposed to 0.5 Gy and 5.0 Gy γ-ray，significantly higher than that in controls.Also，comet percentage increased in workers engaged in flaw detection and exposed to X-ray.Conclusion It suggests that single strand DNA breakage detected by SCGE can be used as an early biological indicator reflecting radiation effect on health.
, 百拇医药
Key words：Single cell gel electrophoresis；Ionizing radiation；Lymphocyte；Single strand DNA breakage
电离辐射往往是通过损伤DNA而诱发细胞突变和癌变。近年来由Singh等改进和建立的单细胞凝胶电泳试验(single cell microgel electrophoresis，SCGE)，俗称“彗星”试验(Comet assay)，是一种检测哺乳动物细胞DNA断裂的新技术[1，2]。该技术已广泛应用于放射生物学、遗传毒理学、生物监测及细胞凋亡等领域的研究。本文应用SCGE检测了受γ射线照射后小鼠及从事X射线探伤工人的外周血淋巴细胞DNA单链断裂(DNAssb)的情况。
1 材料和方法
1.1 实验动物及照射
, 百拇医药
雄性昆明系小鼠由苏州医学院实验动物中心提供，6～7周龄，体质量(20±2)g，用Co-60外照射治疗机全身照射小鼠。球靶距70cm，照射剂量0.5和5.0Gy，剂量率为90.3cGy/min。
1.2 调查对象
选择从事X射线探伤的工人18名，采集静脉血0.5～1ml肝素抗凝，以非X射线接触者20名为对照组。
1.3 外周血淋巴细胞分离
取静脉血0.5～1ml肝素抗凝，沿离心管加在等体积淋巴细胞分离液面上，3 500r/min离心2min，吸取中间层淋巴细胞于10ml离心管中，加磷酸缓冲液(PBS)至5ml，1 500r/min离心8min，如此重复洗涤2次，再将细胞悬于PBS，置4℃待用。
1.4 单细胞凝胶电泳试验
, 百拇医药
参照Singh等[2]的方法，简述如下：(1)正常熔点琼脂(0.5%)85μl均匀铺在磨砂载玻片上，吸取75μl含约104个细胞的低熔点琼脂(0.7%)均匀铺在正常熔点凝胶层上，再于其上铺一层低熔点琼脂凝胶；(2)将玻片浸入新配的碱性细胞裂解液(含10%DMSO，1%Triton X-100)中裂解1.5h；(3)取出玻片置于碱性电泳液中展开20min后，在25V，300mA电泳条件下电泳20min；(4)用Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中和3次后加100μl溴乙锭(2μg/ml)染色，盖上盖玻片在荧光显微镜下观察计数彗星细胞的百分率，每份样品计数200个细胞。
2 结果
2.1 X射线探伤工人调查结果
从事X射线探伤的工人，年龄27～58岁，平均(42.1±8.4)岁，职业工龄3～18年，平均(13.4±7.9)年。人均累积剂量当量(0.69±0.35)Sv，人均年剂量当量0.05Sv*a-1。
, http://www.100md.com
2.2 γ射线照射后小鼠淋巴细胞DNA的改变
由表1可见，0.5Gy和5.0Gy的γ射线照射组小鼠，淋巴细胞彗星百分率显著高于对照组。经统计学处理，差异有高度显著性。
表1 γ射线照射后小鼠淋巴细胞彗星百分率的改变(x±s) 组 别
n
彗星百分率
对照组
10
1.00±0.10
0.5Gy
10
, http://www.100md.com 9.00±2.34
5.0Gy
10
28.30±4.82
与对照组相比，P<0.01。
2.3 X射线探伤工人淋巴细胞DNA的改变
由表2可见，从事X射线探伤工人的淋巴细胞彗星百分率显著高于对照组。经统计学处理，差异有高度显著性。
表2 X射线探伤工人淋巴细胞彗星百分率的改变(x±s) 组 别
n
彗星百分率
, 百拇医药
对照组
20
0
X射线探伤组
18
3.9±2.16
与对照组相比，P<0.01。
3 讨论
DNA链断裂的检测是研究DNA辐射损伤的方法之一。早期建立的检测方法很多(如速度沉降法、羟基磷灰石柱层析分析法、中性膜洗脱法等)。这些方法灵敏度低，操作条件不易控制，所获得的结果反映了群体细胞DNA损伤效应，不能对单个细胞进行分析[3]。而SCGE是在核酸沉淀法(Nucleoid Sedimentation)和晕圈分析(Holo Assay)及弱碱性条件下的单细胞凝胶电泳等检测技术基础上逐步发展起来的一种检测哺乳类有核细胞DNA断裂的新技术，它具有如下的优点[4，5]：(1)在单细胞水平上的检测技术，SCGE能够对单个细胞的DNA损伤进行研究，避免了只能对细胞群体的DNA改变进行检测的不足；(2)适用范围广，可检测各种类型组织细胞，不仅适用于静止状态的细胞，且对T和B淋巴细胞均敏感，不像SCE试验仅对T淋巴细胞，微核试验仅对B淋巴细胞敏感；(3)简便经济快速，所需样品细胞数目少(<10 000个)，无需放射性核素，检测时间短，步骤较为简单，花费甚少；(4)敏感性高，它可检出0.1个DNA断裂/109道尔顿，比SCE和UDS试验具有更高的灵敏性。
, 百拇医药
辐射致淋巴细胞DNAssb、功能障碍在体内和体外实验及人群资料中均得到证实[6，7]。本研究发现，γ射线照射后小鼠淋巴细胞彗星百分率显著增加，从事X射线探伤工人的淋巴细胞彗星百分率也显著增加。这表明SCGE可以灵敏地检测DNAssb(包括射线对工人细胞的DNAssb)，从而为现场调查提供方便的检测指标。近来有人结合应用核酸酶(或FPG，UVC，UVB，UVA)测定了DNA分子中嘧啶(或嘌呤等)位置的氧化损伤[8]。可见，SCGE检测的DNAssb可作为射线对健康影响的早期生物学指标。
作者简介：洪承皎(1966—)，女，江苏苏州人，主管技师。
参考文献：
[1]Ostling O，Johanson KJ.Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells[J].Biochem Biophys Res Commun，1984，123(1)：291.
, 百拇医药
[2]Singh NP，McCoy MT，Tice RR，et al.A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells[J].Exp Cell Res，1988，175：184.
[3]Akpa TC，Weber KJ，Schneider E，et al.Heavy ion-induced DNA double-strand breaks in yeast[J].Int J Radiat Biol，1992，62：279.
[4]Kennelly JC，Lane MP，Barker JA，et al.Genotoxic activity of 1-chloromethylpyrene in stomach epithelium in vivo：insensitivity of the stomach scintillation UDS assay[J].Cancinogenesis，1993，14(4)：637.
, http://www.100md.com
[5]Lankinen MH，Vilpo LM，vilpo JA.UV-and gamma-irradiation-induced DNA single-strand breaks and their repair in human blood granulocytes and lymphocytes[J].Mutat Res，1996，352：31.
[6]Vijayalaxmi，Tice RR，Strauss GHS.Assessment of radiation-induced DNA damage in human blood lymphocytes using the single-cell gel electrophoresis technique[J].Mutat Res，1992，271：243.
[7]Betti C，Davini RT，Giannessi L，et al.Microgel electrophoresis assay(comet test)and SCE analysis in human lymphocytes from 100 normal subjects[J].Mutat Res，1994，307：232.
[8]Alapetite C，Wachter T，Sage E，et al.Use of the alkaline comet assay to detect DNA repair deficiencies in human fibroblasts exposed to UVC，UVB，UVA and gamma-rays[J].Int J Radiat Biol，1996，69：359.
收稿日期：1999-10-20, http://www.100md.com
单位：苏州医学院放射医学系，江苏 苏州 215007
关键词：单细胞凝胶电泳试验；电离辐射；淋巴细胞；DNA单链断裂(ssb)
中国工业医学杂志990610
摘要：应用单细胞凝胶电泳试验(SCGE)分别检测了受γ射线照射后小鼠及从事X射线探伤工人的外周血淋巴细胞DNA单链断裂(ssb)，结果发现：0.5Gy和5.0Gy的γ射线照射组小鼠，外周血淋巴细胞彗星百分率显著高于对照组；从事X射线探伤工人的外周血淋巴细胞彗星百分率也显著升高。提示SCGE检测的DNAssb可作为射线对健康影响的早期生物学指标。
中图分类号：R446.11+3；X591 文献标识码：A 文章编号：1002-221X(1999)06-0346-02
, 百拇医药
Detection of radiation-induced DNA damage in peripheral lymphocytes with single cell gelelectrophoresis
HONG Cheng-jiao，WANG Jing，TONG Jian
(Department of Radiation Medicine，Suzhou Medical College，Suzhou?215007，China)
Abstract：Objective To study radiation-induced DNA damage in peripheral lymphocytes.Methods Breakage of single strand DNA in mice exposed to γ-ray and in workers engaged in flaw-detection and exposed to X-ray was detected with single cell gel electrophoresis(SCGE).Results Comet percentage in peripheral lymphocytes increased in mice exposed to 0.5 Gy and 5.0 Gy γ-ray，significantly higher than that in controls.Also，comet percentage increased in workers engaged in flaw detection and exposed to X-ray.Conclusion It suggests that single strand DNA breakage detected by SCGE can be used as an early biological indicator reflecting radiation effect on health.
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Key words：Single cell gel electrophoresis；Ionizing radiation；Lymphocyte；Single strand DNA breakage
电离辐射往往是通过损伤DNA而诱发细胞突变和癌变。近年来由Singh等改进和建立的单细胞凝胶电泳试验(single cell microgel electrophoresis，SCGE)，俗称“彗星”试验(Comet assay)，是一种检测哺乳动物细胞DNA断裂的新技术[1，2]。该技术已广泛应用于放射生物学、遗传毒理学、生物监测及细胞凋亡等领域的研究。本文应用SCGE检测了受γ射线照射后小鼠及从事X射线探伤工人的外周血淋巴细胞DNA单链断裂(DNAssb)的情况。
1 材料和方法
1.1 实验动物及照射
, 百拇医药
雄性昆明系小鼠由苏州医学院实验动物中心提供，6～7周龄，体质量(20±2)g，用Co-60外照射治疗机全身照射小鼠。球靶距70cm，照射剂量0.5和5.0Gy，剂量率为90.3cGy/min。
1.2 调查对象
选择从事X射线探伤的工人18名，采集静脉血0.5～1ml肝素抗凝，以非X射线接触者20名为对照组。
1.3 外周血淋巴细胞分离
取静脉血0.5～1ml肝素抗凝，沿离心管加在等体积淋巴细胞分离液面上，3 500r/min离心2min，吸取中间层淋巴细胞于10ml离心管中，加磷酸缓冲液(PBS)至5ml，1 500r/min离心8min，如此重复洗涤2次，再将细胞悬于PBS，置4℃待用。
1.4 单细胞凝胶电泳试验
, 百拇医药
参照Singh等[2]的方法，简述如下：(1)正常熔点琼脂(0.5%)85μl均匀铺在磨砂载玻片上，吸取75μl含约104个细胞的低熔点琼脂(0.7%)均匀铺在正常熔点凝胶层上，再于其上铺一层低熔点琼脂凝胶；(2)将玻片浸入新配的碱性细胞裂解液(含10%DMSO，1%Triton X-100)中裂解1.5h；(3)取出玻片置于碱性电泳液中展开20min后，在25V，300mA电泳条件下电泳20min；(4)用Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中和3次后加100μl溴乙锭(2μg/ml)染色，盖上盖玻片在荧光显微镜下观察计数彗星细胞的百分率，每份样品计数200个细胞。
2 结果
2.1 X射线探伤工人调查结果
从事X射线探伤的工人，年龄27～58岁，平均(42.1±8.4)岁，职业工龄3～18年，平均(13.4±7.9)年。人均累积剂量当量(0.69±0.35)Sv，人均年剂量当量0.05Sv*a-1。
, http://www.100md.com
2.2 γ射线照射后小鼠淋巴细胞DNA的改变
由表1可见，0.5Gy和5.0Gy的γ射线照射组小鼠，淋巴细胞彗星百分率显著高于对照组。经统计学处理，差异有高度显著性。
表1 γ射线照射后小鼠淋巴细胞彗星百分率的改变(x±s) 组 别
n
彗星百分率
对照组
10
1.00±0.10
0.5Gy
10
, http://www.100md.com 9.00±2.34
5.0Gy
10
28.30±4.82
与对照组相比，P<0.01。
2.3 X射线探伤工人淋巴细胞DNA的改变
由表2可见，从事X射线探伤工人的淋巴细胞彗星百分率显著高于对照组。经统计学处理，差异有高度显著性。
表2 X射线探伤工人淋巴细胞彗星百分率的改变(x±s) 组 别
n
彗星百分率
, 百拇医药
对照组
20
0
X射线探伤组
18
3.9±2.16
与对照组相比，P<0.01。
3 讨论
DNA链断裂的检测是研究DNA辐射损伤的方法之一。早期建立的检测方法很多(如速度沉降法、羟基磷灰石柱层析分析法、中性膜洗脱法等)。这些方法灵敏度低，操作条件不易控制，所获得的结果反映了群体细胞DNA损伤效应，不能对单个细胞进行分析[3]。而SCGE是在核酸沉淀法(Nucleoid Sedimentation)和晕圈分析(Holo Assay)及弱碱性条件下的单细胞凝胶电泳等检测技术基础上逐步发展起来的一种检测哺乳类有核细胞DNA断裂的新技术，它具有如下的优点[4，5]：(1)在单细胞水平上的检测技术，SCGE能够对单个细胞的DNA损伤进行研究，避免了只能对细胞群体的DNA改变进行检测的不足；(2)适用范围广，可检测各种类型组织细胞，不仅适用于静止状态的细胞，且对T和B淋巴细胞均敏感，不像SCE试验仅对T淋巴细胞，微核试验仅对B淋巴细胞敏感；(3)简便经济快速，所需样品细胞数目少(<10 000个)，无需放射性核素，检测时间短，步骤较为简单，花费甚少；(4)敏感性高，它可检出0.1个DNA断裂/109道尔顿，比SCE和UDS试验具有更高的灵敏性。
, 百拇医药
辐射致淋巴细胞DNAssb、功能障碍在体内和体外实验及人群资料中均得到证实[6，7]。本研究发现，γ射线照射后小鼠淋巴细胞彗星百分率显著增加，从事X射线探伤工人的淋巴细胞彗星百分率也显著增加。这表明SCGE可以灵敏地检测DNAssb(包括射线对工人细胞的DNAssb)，从而为现场调查提供方便的检测指标。近来有人结合应用核酸酶(或FPG，UVC，UVB，UVA)测定了DNA分子中嘧啶(或嘌呤等)位置的氧化损伤[8]。可见，SCGE检测的DNAssb可作为射线对健康影响的早期生物学指标。
作者简介：洪承皎(1966—)，女，江苏苏州人，主管技师。
参考文献：
[1]Ostling O，Johanson KJ.Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells[J].Biochem Biophys Res Commun，1984，123(1)：291.
, 百拇医药
[2]Singh NP，McCoy MT，Tice RR，et al.A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells[J].Exp Cell Res，1988，175：184.
[3]Akpa TC，Weber KJ，Schneider E，et al.Heavy ion-induced DNA double-strand breaks in yeast[J].Int J Radiat Biol，1992，62：279.
[4]Kennelly JC，Lane MP，Barker JA，et al.Genotoxic activity of 1-chloromethylpyrene in stomach epithelium in vivo：insensitivity of the stomach scintillation UDS assay[J].Cancinogenesis，1993，14(4)：637.
, http://www.100md.com
[5]Lankinen MH，Vilpo LM，vilpo JA.UV-and gamma-irradiation-induced DNA single-strand breaks and their repair in human blood granulocytes and lymphocytes[J].Mutat Res，1996，352：31.
[6]Vijayalaxmi，Tice RR，Strauss GHS.Assessment of radiation-induced DNA damage in human blood lymphocytes using the single-cell gel electrophoresis technique[J].Mutat Res，1992，271：243.
[7]Betti C，Davini RT，Giannessi L，et al.Microgel electrophoresis assay(comet test)and SCE analysis in human lymphocytes from 100 normal subjects[J].Mutat Res，1994，307：232.
[8]Alapetite C，Wachter T，Sage E，et al.Use of the alkaline comet assay to detect DNA repair deficiencies in human fibroblasts exposed to UVC，UVB，UVA and gamma-rays[J].Int J Radiat Biol，1996，69：359.
收稿日期：1999-10-20, http://www.100md.com