三尖杉酯碱及氮烯苯酸诱导肿瘤细胞凋亡的时-效，量-效关系以及凋亡与坏死的消长变化
作者：冼励坚，张启威
单位：中山医科大学肿瘤防治中心实用技术研究室(广州，510060)
关键词：抗癌药物；凋亡；坏死；量-效关系；时-效关系
癌症990613 【摘要】目的：研究三尖杉酯碱及氮烯苯酸诱导肿瘤细胞凋亡的量-效，时-效关系以及凋亡与坏死的消长变化。方法：以S180腹水癌荷瘤小鼠为体内模型，HL60细胞为体外模型，以Hoechst 33342染色细胞，荧光显微镜下观察并计算凋亡指数。透射电镜判定凋亡；流式细胞仪检测DNA分布加以验证。用重复测量方差分析对凋亡指数进行量化处理；以台盼蓝染色阳性作为坏死的参数，观察凋亡与坏死的关系。结果：三尖杉酯碱和氮烯苯酸均诱导了肿瘤细胞凋亡，在荧光显微镜及透射电镜下见典型的凋亡改变。DNA直方图出现亚G1峰。对HL60细胞，在2～24小时时间范围内，三尖杉酯碱在0.02～1.0μg/ml，氮烯苯酸在0.2～5μg/ml浓度范围内，凋亡指数随药物浓度增加及时间延长而上升，24小时后，凋亡指数下降，台盼蓝染色阳性坏死细胞明显增加。在本实验的最高浓度组(三尖杉酯碱5.0μg/ml，氮烯苯酸25μg/ml)凋亡指数最低，台盼蓝阳性率一直处于最高水平。在荷S180腹水癌小鼠，氮烯苯酸在25～250mg/kg和2～48小时范围内，凋亡指数随剂量增加及时间延长而上升，48小时后，凋亡指数下降，台盼蓝染色阳性细胞明显增加。结论：三尖杉酯碱及氮烯苯酸诱导肿瘤细胞凋亡，在一定剂量和时间范围内呈现明显的量-效，时-效关系；高剂量药物倾向于以坏死为主要方式杀灭肿瘤细胞。提示细胞凋亡和坏死的启动和调控可能与损伤强度阈值和时间阈值有关。
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中图分类号：R979.1 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)-06-0668-06
The relationships between dose-effect and time- effect of apoptosis induced by harringtonine and benzoazene in tumor cells and the change of growth and decline between apoptosis and necrosis
XIAN Li-jian，ZHANG Qi- wei
Cancer Institute，Cancer Center，Sun Yat- sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060，P.R.China
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【Abstract】Objective：To study the relationship on the dose-effect and time- effect of apoptosis induced by harringtonine (HT) and benzoazene (BAZ) in tumor cells and the change of growth and decline between apoptosis and necrosis.Methods： Ascitic cells of sarcoma 180 (S180) of mice in vivo and human promyelocyte leukemia HL60 cells in vitro were used as models.The cells were stained with Hoechst 33342 and were observed under fluorescence microscope，the apoptosis index was counted. The ultra-structure of the cells was examined with transmission electron microscope and DNA distribution was analyzed with FCM to define apoptosis.The statistical method of repeated measure analysis of variance was used to analyze the data.The trypan-blue positive rate was used as a parameter of necrosis to investigate the possible relationship between apoptosis and necrosis.Results：Both of HT and BAZ could induce apoptosis of tumor cells. The typical apoptosis was confirmed by the examination of fluorescence microscope and transmission electron microscope.The sub-G1 peak was found in DNA histogram by FCM.In HL60 cells，during the 2～24 hrs，in the dose range of 0.02～1.0 μg/ml of HT，and of 0.2～5 μg/ml of BAZ，the apoptosis index was rising with the time passing and the concentration increasing.After 24 hrs，the apoptosis index reduced and the trypan-blue positive rate rised. The highest concentration of drugs in this experiment (HT in 5.0 μ g/ml，BAZ in 25 μ g/ml) induced the lowest apoptosis index and the highest trypan-blue positive rate (necrosis).In the mice bearing S180 tumor，during 2～48hrs，and in the dose range of 25～250 mg/kg of BAZ，the apoptosis index was rising with the time passing and the dose increasing.Forty-eight hours later，the apoptosis index decreased and the trypan- blue positive rate increased.Conclusions：Antitumor drugs induce apoptosis of tumor cells，the relationship between dose- effect and time-effect was found in certain range of dose and time. High dose of drugs kills tumor cells by necrosis mainly. It implicated that the threshold value of intensity and time of damage may be important in the switching on and the regulating of apoptosis and necrosis.
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Key words：Antitumor drug；Apoptosis；Necrosis；Dose-effect；Time-effect
细胞凋亡是在基因调控下发生的具有特征性的形态学和生化改变的细胞自我消亡的过程。肿瘤发生与细胞凋亡的调节紊乱有密切关系。诱导肿瘤细胞凋亡是某些化疗药物抑制肿瘤细胞生长的机制之一〔1～4〕。本文通过三尖杉酯碱及氮烯苯酸诱导肿瘤细胞凋亡过程的时-效，量-效关系研究，以及凋亡-坏死消长变化的动态观察，进一步深化对药物作用下肿瘤细胞凋亡过程的认识。
1材料与方法
1.1主要实验材料
1.1.1瘤株和动物：人早幼粒细胞白血病HL60细胞株，暨南大学医学院血液病研究所赠送。小鼠S180腹水癌瘤株，中山医科大学肿瘤研究所实用技术室传代。实验用SD大鼠，由中山医科大学实验动物中心提供，实验动物合格证号码：粤检证字95A05号。昆明种小鼠，购自第一军医大学，实验动物合格证号码：粤检证字96A23号。
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1.1.2药物：三尖杉酯碱，中国医学科学院药物研究所实验药厂生产，1mg/支，批号：960106；氮烯苯酸，中国成都制药二厂出品并提供，50mg/支，批号：940601。
1.1.3主要试剂与溶液：RPMI1640培养基(SIGMA公司产品)；辅助因子(NADPH)溶液；噻唑蓝[3(4，dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT] fluka公司产品；25%二甲基亚砜(DMSO)；Hoechst 33342染液(SIGMA公司产品)；1%台盼蓝染液(使用时终末浓度0.05%)；细胞固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)；戊二醛固定液；锇酸固定液；碘化丙啶(PI)染色液(SIGMA公司产品)。
1.1.4主要仪器：奥林帕斯(OLYMPUS)荧光显微镜BHF型，奥林帕斯半自动显微摄影系统FM-10型(日本奥林帕斯公司出品)；透射电子显微镜H600型(日本日立公司出品)；流式细胞仪(COULTER ELITE出品)；Beckman J2-21低温高速离心机(贝克曼公司出品)；DG-3022A型酶联免疫检测仪(国营华东电子管厂)。
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1.2主要实验方法
1.2.1氮烯苯酸在体外的活化：肝亚细胞匀浆的制备及氮烯苯酸在肝匀浆孵育下活化〔5〕：根据常规方法自大鼠肝脏制备线粒体悬液，取线粒体后上清液2ml加入辅助因子溶液4ml，及不同浓度氮烯苯酸药液2ml，37℃孵育2小时。
1.2.2活化后的氮烯苯酸在体外对HL60细胞的细胞毒作用：经肝匀浆活化的氮烯苯酸，按照孵育活化前的药物浓度推算，终末浓度依次为：0.1μg/ml，0.2μg/ml，0.5μg/ml，1.5μg/ml，6.0μg/ml，25.0μg/ml。根据MTT法〔6〕，测定活化后的氮烯苯酸对HL60细胞的细胞毒作用。采用POMS36软件，在486微机上以加权线性回归法计算IC50，作为以下实验剂量的选择依据。
1.2.3荧光显微镜下观察凋亡细胞形态学变化：24只小鼠(体重19～21g，雄性)，在无菌条件下腹腔接种处于对数生长期的S180腹水癌小鼠腹水(以生理盐水稀释2∶1)，每鼠0.2ml。小鼠随机分成6组，每组4只鼠。接种后第7天给药，对照组腹腔注射生理盐水0.5ml/鼠，实验组每鼠腹腔注射氮烯苯酸药液0.5ml，剂量依次为25mg/kg，50mg/kg，100mg/kg，200mg/kg，250mg/kg。分别在给药后2小时，6小时，12小时，24小时，36小时，48小时，72小时抽取腹水，涂片，Hoechst 33342染色。
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HL60细胞在37℃，5%CO2条件下培养，收集对数生长期细胞，更换培养基，调整细胞密度为105/ml；加入相应浓度的氮烯苯酸与肝匀浆的温孵液，使得药物的终末浓度以药物活化前浓度推算时，分别为：0.2μg/ml，1.0μg/ml，5.0μg/ml，25.0μg/ml；三尖杉酯碱药物终末浓度为：0.02μg/ml，0.2μg/ml，1.0μg/ml，5.0μg/ml。对照组中加入生理盐水。分别在给药后2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时、36小时、48小时取细胞悬液，涂片，按Hoechst33342荧光染色法染片，在荧光显微镜下观察并摄片。
1.2.4台盼蓝染色观察S180腹水癌细胞和HL60细胞坏死比率：按台盼蓝拒染法常规测定。
1.2.5透射电子显微镜观察凋亡细胞的形态学变化：收集腹水细胞及培养细胞，洗涤，戊二醛固定，4℃冰箱保存。按常规电镜样品制备程序处理，透射电镜观察并摄影。
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1.2.6流式细胞仪观察法〔7〕：根据荧光显微镜的观察，在药物诱导肿瘤细胞凋亡较明显的时点，即氮烯苯酸作用于小鼠S180腹水癌细胞48小时；活化后的氮烯苯酸以及三尖杉酯碱作用于HL60细胞24小时收集细胞。生理盐水洗涤3次，固定液固定。使用前用PBS离心沉淀，去除固定液，调整细胞数至1×106/ml。加入200μl RNaseA，37℃水浴30分钟。加入PI染色液，混匀，4℃避光30分钟。测试条件：激发波长488nm。
1.2.7细胞凋亡指数的计数：在前述取腹水或细胞悬液涂片的每一时点，在药物的每一剂量组，各涂取4张细胞涂片，Hoechst 33342荧光染色。在荧光显微镜下，用40倍物镜观察细胞涂片，计数其中凋亡细胞核数。每片计数1，000个细胞核，每一视野反复计数3次。依据Conway等提出的原则〔8〕，在计数凋亡细胞时，相对保守地仅将具有明显凋亡特征的细胞计入。凋亡指数依下式计算：
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1.2.8重复测量方差分析法〔9〕：用SAS软件包在486微机上运行，分析：(1)凋亡指数和台盼蓝染色阳性率与药物剂量/浓度的量-效关系；(2)凋亡指数和台盼蓝染色阳性率与药物作用时间的时-效关系；(3)凋亡指数和台盼蓝染色阳性率在药物不同剂量/浓度和不同作用时间的消长关系。
2结果
2.1氮烯苯酸在体外活化，已活化的氮烯苯酸对HL60细胞的细胞毒作用
氮烯苯酸在体外对HL60细胞没有直接细胞毒作用。经过肝匀浆孵育的氮烯苯酸对HL60细胞半数抑制浓度(IC50)=5.3837μg/ml，95%可信限(3.0843～9.3978)，以氮烯苯酸活化前的浓度来表示(下同)。
2.2荧光显微镜下观察在三尖杉酯碱，氮烯苯酸作用下，小鼠S180腹水癌和HL60细胞的形态变化
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三尖杉酯碱和氮烯苯酸均诱导了肿瘤细胞的凋亡，镜下可见活细胞核呈均匀弥散荧光，核的大小、形态一致。凋亡细胞的核固缩成一些高度凝集的点状结构，荧光亮度明显增强；核内见浓染致密的颗粒块状荧光；染色质集中在结构完整的核膜边缘，形成环状、新月状、僧帽状的浓染带；部分细胞的核固缩、碎裂，成为细小的碎片(见图1～3)。
图1 HL60细胞对照组(Hoechst 33342染色×400)
图2 三尖杉酯碱作用于HL60细胞(Hoechst 33342染色×400)
图3 氮烯苯酸活化后作用于HL60细胞(Hoechst 33342染色×400)
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2.3透射电子显微镜观察药物作用下肿瘤细胞超微结构的变化
三尖杉酯碱处理后的HL60细胞和氮烯苯酸处理后小鼠S180腹水癌细胞和HL60细胞均呈现明显的凋亡改变。凋亡细胞染色质固缩，聚集于核膜边缘，呈境界分明的块状或月状、半月状小体。核膜完整，清晰可辩。细胞质内可以看到完整的细胞器，内质网肿胀，线粒体发达。在一些细胞，细胞浆浓缩或裂解成质膜包绕的碎片，其中含有一个或多个核碎片，细胞器杂乱分布但结构完整，形成所谓的凋亡小体。在电镜下，还可以看到单纯坏死细胞，其中核固缩，染色质分布无规律，边界不清，细胞浆肿胀明显，细胞器破坏，没有完整的核膜(图4～6)。
图4 HL60细胞的超微结构(×6000)
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图5 三尖杉酯碱作用于HL60细胞(×6000)
图6 氮烯苯酸活化后作用于HL60细胞(×6000)
2.4流式细胞仪观察凋亡细胞的DNA分布
经流式细胞仪测定细胞DNA含量，可见氮烯苯酸及三尖杉酯碱处理过的细胞出现细胞凋亡特有的亚G1峰(凋亡峰)。氮烯苯酸作用于小鼠S180腹水癌细胞48小时，剂量分别为25mg/kg，50mg/kg，100mg/kg，200mg/kg，250mg/kg时，亚G1峰(凋亡峰)分别占细胞总数的20.5%，28.7%，33.5%，48.6%，49.8%；活化后的氮烯苯酸作用于HL60细胞24小时，浓度为0.2μg/ml，1.0μg/ml，5.0μg/ml时，亚G1峰细胞数分别占细胞总数的22.8%，32.6%，41.0%；三尖杉酯碱作用于HL60细胞24小时，浓度为0.02μg/ml，0.2μg/ml，1.0μg/ml时，亚G1峰细胞数分别占细胞总数的25.6%，34.5%，40.4%。25.0μg/ml氮烯苯酸和5.0μg/ml三尖杉酯碱作用于HL60细胞24小时，DNA直方图中各期峰形模糊，界限不清，无法辨别各峰。
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2.5凋亡指数以及台盼蓝染色阳性率在药物不同剂量/浓度以及不同作用时间的消长变化
不同剂量氮烯苯酸，作用于荷S180腹水癌小鼠，在不同作用时间腹水细胞的凋亡指数(图7)。
图7 氮烯苯酸作用于小鼠S-180腹水癌细胞，不同剂量及不同作用时间下细胞凋亡指数
不同剂量氮烯苯酸，作用于荷S180腹水癌小鼠，在不同作用时间腹水细胞的台盼蓝染色阳性率(图8)。
图8 不同剂量氮烯苯酸作用于小鼠S-180腹水癌细胞48小时，72小时台盼蓝染色阳性率
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不同浓度氮烯苯酸活化后作用于HL60细胞，在不同时间点细胞的凋亡指数(图9)。
图9 活化后的氮烯苯酸体外作用于HL60细胞，不同浓度及不同作用时间下细胞凋亡指数
不同浓度氮烯苯酸活化后作用于HL60细胞，在不同时间点细胞台盼蓝染色阳性率(图10)。
图10 活化后的氮烯苯酸体外作用于HL60细胞，不同浓度及不同作用时间下细胞
台盼蓝染色阳性率
不同浓度三尖杉酯碱作用不同时间，HL60细胞的凋亡指数(图11)。
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图11 三尖杉酯碱体外作用于HL60细胞，不同浓度及不同作用时间下细胞凋亡指数
不同浓度三尖杉酯碱作用不同时间，HL60细胞台盼蓝染色阳性率(图12)。
图12 三尖杉酯碱体外作用于HL60细胞，不同浓度及不同作用时间下细胞台盼蓝染色阳性率
2.6用重复测量方差分析法分析凋亡、坏死变化趋势
对上述数据进行处理，可见在氮烯苯酸作用于小鼠S-180腹水癌细胞，活化后的氮烯苯酸和三尖杉酯碱作用于HL60细胞各组实验中：同一剂量，同一作用时间下所取的细胞涂片之间，细胞凋亡指数及盼蓝染色阳性率均无显著差别(P>0.05)；不同剂量及药物作用不同时间所取的细胞涂片之间，细胞凋亡指数及台盼蓝染色阳性率均不同，有显著差别(P<0.001)。重复测量方差分析确定组间差异有显著性后，对图7～12的变化趋势进一步分析，结果如下：
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2.6.1氮烯苯酸诱导小鼠S180腹水癌细胞凋亡指数(图7)：自给药后2小时至72小时，对照组细胞凋亡指数在0.64%～3.70%，未见明显凋亡现象；在25.0～250.0mg/kg的范围内，细胞凋亡指数随着氮烯苯酸剂量的增加而增加；在2～48小时，细胞凋亡指数随着药物作用时间的延长而增加；48小时后，凋亡指数下降。
2.6.2氮烯苯酸作用于小鼠S180腹水癌细胞48、72小时，细胞台盼蓝染色阳性率(图8)：对照组台盼蓝染色阳性率为3.60%～4.21%；细胞台盼蓝染色阳性率随着药物剂量的增加和药物作用时间的延长而升高；氮烯苯酸250mg/kg，给药72小时后，腹水细胞台盼蓝染色阳性率达到49.31%。
2.6.3活化的氮烯苯酸诱导HL60细胞凋亡(图9)：对照组细胞凋亡指数在0.60%～1.03%内，未见明显的凋亡现象；在0.2～5.0μg/ml浓度范围及2～24小时的时间范围内，HL60细胞凋亡指数随着氮烯苯酸浓度的增加及时间延长而升高；本实验的最高浓度25.0μg/ml组，凋亡指数始终维持在最低水平11.00%～15.85%。
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2.6.4活化的氮烯苯酸作用于HL60细胞台盼蓝染色阳性率(图10)：对照组台盼蓝染色阳性率1.05%～6.68%；随着药物浓度的增加，细胞台盼蓝染色阳性率增加；在本实验药物的最高浓度25.0μg/ml作用下自第2小时起，HL60细胞台盼蓝染色阳性率即明显高于其它浓度组，至作用48小时该组细胞台盼蓝染色阳性率为65.35%。其余浓度的各组台盼蓝染色阳性率随时间延长而逐步升高。
2.6.5三尖杉酯碱诱导HL60细胞凋亡指数(图11)：对照组细胞凋亡指数0.68%～1.15%，未见明显凋亡现象；在0.02～1.0μg/ml浓度及2～24小时范围内凋亡指数随着氮烯苯酸浓度的增加及作用时间延长而升高；在本实验最高浓度5.0μg/ml组，药物作用8小时后，细胞凋亡指数即明显低于其它浓度组，并维持在较低水平。
2.6.6三尖杉酯碱作用于HL60细胞的台盼蓝染色阳性率(图12)：对照组台盼蓝染色阳性率0.85%～6.18%；随着药物浓度增加，细胞台盼蓝染色阳性率升高；本实验最高浓度5.0μg/ml组，台盼蓝染色阳性率一开始就明显高于其它浓度组，并维持在高水平，药物作用48小时染色阳性率达到74.16%。其余各用药组随药物浓度增加及作用时间延长，台盼蓝染色阳性率缓慢升高。药物作用48小时，0.02μg/ml，0.2μg/ml，1.0μg/ml组台盼蓝染色阳性率分别升至40.65%，47.74%，50.14%。
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3讨论
本文除用人早幼粒白血病HL60细胞这一研究凋亡的经典的体外模型外，还应用小鼠S180腹水癌这一体内模型，在不同药物剂量和不同作用时间的较大范围内，多次取材，成功地进行了凋亡的研究。腹水癌模型取材方便，易于制成单细胞悬液，并能在不同时点多次取样，用于活体条件下肿瘤细胞凋亡的研究是方便、可行和可靠的实验模型。
本实验在荧光显微镜观察、电子显微镜鉴定、流式细胞仪分析等确定细胞发生凋亡的前提下，在多个时间和剂量点采取标本计算细胞凋亡指数及台盼蓝染色阳性率，并首次引入“重复测量方差分析法”分析抗癌药物诱导肿瘤细胞凋亡的量-效，时-效关系以及凋亡和坏死的消长变化。实践表明该法在大规模，动态地研究药物诱导细胞凋亡时是一个有效手段。
无论三尖杉酯碱或氮烯苯酸，在一定范围内，细胞凋亡指数随着药物剂量的增加而增加，二者呈现一定的量-效关系。但是当药物浓度高至一定程度(在本实验中氮烯苯酸浓度为25.0μg/ml，三尖杉酯碱浓度为5.0μg/ml)时，细胞凋亡指数反而明显低于其它低浓度组，与此同时，细胞台盼蓝染色阳性率即坏死细胞率显著高于其它浓度组并持续增加。相似的现象还见于其它抗癌药物，例如：Fostriecin 在10～100μmol/L范围内诱导HL60细胞凋亡，当其浓度大于100μmol/L时，则诱导坏死〔10〕。可见抗癌药物作用于肿瘤细胞，在一定浓度范围内，以诱导细胞凋亡为主杀伤肿瘤细胞；而当浓度较高时，药物以诱导细胞坏死作为杀灭肿瘤细胞的主要方式。
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当药物作用启动细胞凋亡过程后，在一定时间范围内，细胞凋亡指数随药物作用时间的延长而增加，体现一定的时-效关系。药物作用时间继续延长，细胞凋亡指数下降；同时，细胞台盼蓝染色阳性率即坏死率随药物作用时间的延长而增加。本实验中，氮烯苯酸诱导S180腹水癌细胞和HL60细胞凋亡以及三尖杉酯碱诱导HL60细胞凋亡时，均呈现这种趋势，可以互为印证。同样的情况还见于阿糖胞苷诱导HL60细胞凋亡的报道〔11〕。
影响细胞台盼蓝染色阳性率的原因是多方面的。在体外培养的细胞模型中，影响因素更为复杂。如：长时间培养造成培养液能量和酸碱度的变化引起细胞继发性坏死等。据周剑峰等报道〔11〕，阿糖胞苷诱导HL60细胞凋亡，药物作用24小时后，细胞bcl-2阳性率有所上升，提示细胞可能预先杀灭低或无表达bcl-2的细胞亚群，从而导致bcl-2阳性率上升。残留高表达bcl-2亚群也可能会造成药物诱导肿瘤细胞凋亡指数下降。我们认为，不排除另一种可能性，即：当损伤性刺激持续存在至一定程度，由于细胞外部条件的变化或细胞内部的调控机制触发了坏死的发生。
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对轻微损伤，细胞通常通过DNA修复予以纠正，而“凋亡”与“坏死”是细胞对损害的完全不同的反应过程。本研究表明“凋亡”与“坏死”的消长变化均与损伤作用的强度和刺激持续程度有关，似乎提示了“凋亡”与“坏死”的启动与调控机制与外部损伤的时间阈值和强度阈值存在微妙关系。这值得从基因水平进行深入研究。
感谢中山医科大学肿瘤中心曹弃元副教授、黄慧强副主任，邝珠玑老师、李满枝老师的帮助以及本校统计教研室方积乾教授在本实验的统计分析工作中给予的宝贵指导。
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收稿日期：1999-05-07；修回日期：1999-07-06, 百拇医药
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关键词：抗癌药物；凋亡；坏死；量-效关系；时-效关系
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The relationships between dose-effect and time- effect of apoptosis induced by harringtonine and benzoazene in tumor cells and the change of growth and decline between apoptosis and necrosis
XIAN Li-jian，ZHANG Qi- wei
Cancer Institute，Cancer Center，Sun Yat- sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060，P.R.China
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【Abstract】Objective：To study the relationship on the dose-effect and time- effect of apoptosis induced by harringtonine (HT) and benzoazene (BAZ) in tumor cells and the change of growth and decline between apoptosis and necrosis.Methods： Ascitic cells of sarcoma 180 (S180) of mice in vivo and human promyelocyte leukemia HL60 cells in vitro were used as models.The cells were stained with Hoechst 33342 and were observed under fluorescence microscope，the apoptosis index was counted. The ultra-structure of the cells was examined with transmission electron microscope and DNA distribution was analyzed with FCM to define apoptosis.The statistical method of repeated measure analysis of variance was used to analyze the data.The trypan-blue positive rate was used as a parameter of necrosis to investigate the possible relationship between apoptosis and necrosis.Results：Both of HT and BAZ could induce apoptosis of tumor cells. The typical apoptosis was confirmed by the examination of fluorescence microscope and transmission electron microscope.The sub-G1 peak was found in DNA histogram by FCM.In HL60 cells，during the 2～24 hrs，in the dose range of 0.02～1.0 μg/ml of HT，and of 0.2～5 μg/ml of BAZ，the apoptosis index was rising with the time passing and the concentration increasing.After 24 hrs，the apoptosis index reduced and the trypan-blue positive rate rised. The highest concentration of drugs in this experiment (HT in 5.0 μ g/ml，BAZ in 25 μ g/ml) induced the lowest apoptosis index and the highest trypan-blue positive rate (necrosis).In the mice bearing S180 tumor，during 2～48hrs，and in the dose range of 25～250 mg/kg of BAZ，the apoptosis index was rising with the time passing and the dose increasing.Forty-eight hours later，the apoptosis index decreased and the trypan- blue positive rate increased.Conclusions：Antitumor drugs induce apoptosis of tumor cells，the relationship between dose- effect and time-effect was found in certain range of dose and time. High dose of drugs kills tumor cells by necrosis mainly. It implicated that the threshold value of intensity and time of damage may be important in the switching on and the regulating of apoptosis and necrosis.
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Key words：Antitumor drug；Apoptosis；Necrosis；Dose-effect；Time-effect
细胞凋亡是在基因调控下发生的具有特征性的形态学和生化改变的细胞自我消亡的过程。肿瘤发生与细胞凋亡的调节紊乱有密切关系。诱导肿瘤细胞凋亡是某些化疗药物抑制肿瘤细胞生长的机制之一〔1～4〕。本文通过三尖杉酯碱及氮烯苯酸诱导肿瘤细胞凋亡过程的时-效，量-效关系研究，以及凋亡-坏死消长变化的动态观察，进一步深化对药物作用下肿瘤细胞凋亡过程的认识。
1材料与方法
1.1主要实验材料
1.1.1瘤株和动物：人早幼粒细胞白血病HL60细胞株，暨南大学医学院血液病研究所赠送。小鼠S180腹水癌瘤株，中山医科大学肿瘤研究所实用技术室传代。实验用SD大鼠，由中山医科大学实验动物中心提供，实验动物合格证号码：粤检证字95A05号。昆明种小鼠，购自第一军医大学，实验动物合格证号码：粤检证字96A23号。
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1.1.2药物：三尖杉酯碱，中国医学科学院药物研究所实验药厂生产，1mg/支，批号：960106；氮烯苯酸，中国成都制药二厂出品并提供，50mg/支，批号：940601。
1.1.3主要试剂与溶液：RPMI1640培养基(SIGMA公司产品)；辅助因子(NADPH)溶液；噻唑蓝[3(4，dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT] fluka公司产品；25%二甲基亚砜(DMSO)；Hoechst 33342染液(SIGMA公司产品)；1%台盼蓝染液(使用时终末浓度0.05%)；细胞固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)；戊二醛固定液；锇酸固定液；碘化丙啶(PI)染色液(SIGMA公司产品)。
1.1.4主要仪器：奥林帕斯(OLYMPUS)荧光显微镜BHF型，奥林帕斯半自动显微摄影系统FM-10型(日本奥林帕斯公司出品)；透射电子显微镜H600型(日本日立公司出品)；流式细胞仪(COULTER ELITE出品)；Beckman J2-21低温高速离心机(贝克曼公司出品)；DG-3022A型酶联免疫检测仪(国营华东电子管厂)。
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1.2主要实验方法
1.2.1氮烯苯酸在体外的活化：肝亚细胞匀浆的制备及氮烯苯酸在肝匀浆孵育下活化〔5〕：根据常规方法自大鼠肝脏制备线粒体悬液，取线粒体后上清液2ml加入辅助因子溶液4ml，及不同浓度氮烯苯酸药液2ml，37℃孵育2小时。
1.2.2活化后的氮烯苯酸在体外对HL60细胞的细胞毒作用：经肝匀浆活化的氮烯苯酸，按照孵育活化前的药物浓度推算，终末浓度依次为：0.1μg/ml，0.2μg/ml，0.5μg/ml，1.5μg/ml，6.0μg/ml，25.0μg/ml。根据MTT法〔6〕，测定活化后的氮烯苯酸对HL60细胞的细胞毒作用。采用POMS36软件，在486微机上以加权线性回归法计算IC50，作为以下实验剂量的选择依据。
1.2.3荧光显微镜下观察凋亡细胞形态学变化：24只小鼠(体重19～21g，雄性)，在无菌条件下腹腔接种处于对数生长期的S180腹水癌小鼠腹水(以生理盐水稀释2∶1)，每鼠0.2ml。小鼠随机分成6组，每组4只鼠。接种后第7天给药，对照组腹腔注射生理盐水0.5ml/鼠，实验组每鼠腹腔注射氮烯苯酸药液0.5ml，剂量依次为25mg/kg，50mg/kg，100mg/kg，200mg/kg，250mg/kg。分别在给药后2小时，6小时，12小时，24小时，36小时，48小时，72小时抽取腹水，涂片，Hoechst 33342染色。
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HL60细胞在37℃，5%CO2条件下培养，收集对数生长期细胞，更换培养基，调整细胞密度为105/ml；加入相应浓度的氮烯苯酸与肝匀浆的温孵液，使得药物的终末浓度以药物活化前浓度推算时，分别为：0.2μg/ml，1.0μg/ml，5.0μg/ml，25.0μg/ml；三尖杉酯碱药物终末浓度为：0.02μg/ml，0.2μg/ml，1.0μg/ml，5.0μg/ml。对照组中加入生理盐水。分别在给药后2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时、36小时、48小时取细胞悬液，涂片，按Hoechst33342荧光染色法染片，在荧光显微镜下观察并摄片。
1.2.4台盼蓝染色观察S180腹水癌细胞和HL60细胞坏死比率：按台盼蓝拒染法常规测定。
1.2.5透射电子显微镜观察凋亡细胞的形态学变化：收集腹水细胞及培养细胞，洗涤，戊二醛固定，4℃冰箱保存。按常规电镜样品制备程序处理，透射电镜观察并摄影。
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1.2.6流式细胞仪观察法〔7〕：根据荧光显微镜的观察，在药物诱导肿瘤细胞凋亡较明显的时点，即氮烯苯酸作用于小鼠S180腹水癌细胞48小时；活化后的氮烯苯酸以及三尖杉酯碱作用于HL60细胞24小时收集细胞。生理盐水洗涤3次，固定液固定。使用前用PBS离心沉淀，去除固定液，调整细胞数至1×106/ml。加入200μl RNaseA，37℃水浴30分钟。加入PI染色液，混匀，4℃避光30分钟。测试条件：激发波长488nm。
1.2.7细胞凋亡指数的计数：在前述取腹水或细胞悬液涂片的每一时点，在药物的每一剂量组，各涂取4张细胞涂片，Hoechst 33342荧光染色。在荧光显微镜下，用40倍物镜观察细胞涂片，计数其中凋亡细胞核数。每片计数1，000个细胞核，每一视野反复计数3次。依据Conway等提出的原则〔8〕，在计数凋亡细胞时，相对保守地仅将具有明显凋亡特征的细胞计入。凋亡指数依下式计算：
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1.2.8重复测量方差分析法〔9〕：用SAS软件包在486微机上运行，分析：(1)凋亡指数和台盼蓝染色阳性率与药物剂量/浓度的量-效关系；(2)凋亡指数和台盼蓝染色阳性率与药物作用时间的时-效关系；(3)凋亡指数和台盼蓝染色阳性率在药物不同剂量/浓度和不同作用时间的消长关系。
2结果
2.1氮烯苯酸在体外活化，已活化的氮烯苯酸对HL60细胞的细胞毒作用
氮烯苯酸在体外对HL60细胞没有直接细胞毒作用。经过肝匀浆孵育的氮烯苯酸对HL60细胞半数抑制浓度(IC50)=5.3837μg/ml，95%可信限(3.0843～9.3978)，以氮烯苯酸活化前的浓度来表示(下同)。
2.2荧光显微镜下观察在三尖杉酯碱，氮烯苯酸作用下，小鼠S180腹水癌和HL60细胞的形态变化
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三尖杉酯碱和氮烯苯酸均诱导了肿瘤细胞的凋亡，镜下可见活细胞核呈均匀弥散荧光，核的大小、形态一致。凋亡细胞的核固缩成一些高度凝集的点状结构，荧光亮度明显增强；核内见浓染致密的颗粒块状荧光；染色质集中在结构完整的核膜边缘，形成环状、新月状、僧帽状的浓染带；部分细胞的核固缩、碎裂，成为细小的碎片(见图1～3)。
图1 HL60细胞对照组(Hoechst 33342染色×400)
图2 三尖杉酯碱作用于HL60细胞(Hoechst 33342染色×400)
图3 氮烯苯酸活化后作用于HL60细胞(Hoechst 33342染色×400)
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2.3透射电子显微镜观察药物作用下肿瘤细胞超微结构的变化
三尖杉酯碱处理后的HL60细胞和氮烯苯酸处理后小鼠S180腹水癌细胞和HL60细胞均呈现明显的凋亡改变。凋亡细胞染色质固缩，聚集于核膜边缘，呈境界分明的块状或月状、半月状小体。核膜完整，清晰可辩。细胞质内可以看到完整的细胞器，内质网肿胀，线粒体发达。在一些细胞，细胞浆浓缩或裂解成质膜包绕的碎片，其中含有一个或多个核碎片，细胞器杂乱分布但结构完整，形成所谓的凋亡小体。在电镜下，还可以看到单纯坏死细胞，其中核固缩，染色质分布无规律，边界不清，细胞浆肿胀明显，细胞器破坏，没有完整的核膜(图4～6)。
图4 HL60细胞的超微结构(×6000)
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图5 三尖杉酯碱作用于HL60细胞(×6000)
图6 氮烯苯酸活化后作用于HL60细胞(×6000)
2.4流式细胞仪观察凋亡细胞的DNA分布
经流式细胞仪测定细胞DNA含量，可见氮烯苯酸及三尖杉酯碱处理过的细胞出现细胞凋亡特有的亚G1峰(凋亡峰)。氮烯苯酸作用于小鼠S180腹水癌细胞48小时，剂量分别为25mg/kg，50mg/kg，100mg/kg，200mg/kg，250mg/kg时，亚G1峰(凋亡峰)分别占细胞总数的20.5%，28.7%，33.5%，48.6%，49.8%；活化后的氮烯苯酸作用于HL60细胞24小时，浓度为0.2μg/ml，1.0μg/ml，5.0μg/ml时，亚G1峰细胞数分别占细胞总数的22.8%，32.6%，41.0%；三尖杉酯碱作用于HL60细胞24小时，浓度为0.02μg/ml，0.2μg/ml，1.0μg/ml时，亚G1峰细胞数分别占细胞总数的25.6%，34.5%，40.4%。25.0μg/ml氮烯苯酸和5.0μg/ml三尖杉酯碱作用于HL60细胞24小时，DNA直方图中各期峰形模糊，界限不清，无法辨别各峰。
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2.5凋亡指数以及台盼蓝染色阳性率在药物不同剂量/浓度以及不同作用时间的消长变化
不同剂量氮烯苯酸，作用于荷S180腹水癌小鼠，在不同作用时间腹水细胞的凋亡指数(图7)。
图7 氮烯苯酸作用于小鼠S-180腹水癌细胞，不同剂量及不同作用时间下细胞凋亡指数
不同剂量氮烯苯酸，作用于荷S180腹水癌小鼠，在不同作用时间腹水细胞的台盼蓝染色阳性率(图8)。
图8 不同剂量氮烯苯酸作用于小鼠S-180腹水癌细胞48小时，72小时台盼蓝染色阳性率
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不同浓度氮烯苯酸活化后作用于HL60细胞，在不同时间点细胞的凋亡指数(图9)。
图9 活化后的氮烯苯酸体外作用于HL60细胞，不同浓度及不同作用时间下细胞凋亡指数
不同浓度氮烯苯酸活化后作用于HL60细胞，在不同时间点细胞台盼蓝染色阳性率(图10)。
图10 活化后的氮烯苯酸体外作用于HL60细胞，不同浓度及不同作用时间下细胞
台盼蓝染色阳性率
不同浓度三尖杉酯碱作用不同时间，HL60细胞的凋亡指数(图11)。
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图11 三尖杉酯碱体外作用于HL60细胞，不同浓度及不同作用时间下细胞凋亡指数
不同浓度三尖杉酯碱作用不同时间，HL60细胞台盼蓝染色阳性率(图12)。
图12 三尖杉酯碱体外作用于HL60细胞，不同浓度及不同作用时间下细胞台盼蓝染色阳性率
2.6用重复测量方差分析法分析凋亡、坏死变化趋势
对上述数据进行处理，可见在氮烯苯酸作用于小鼠S-180腹水癌细胞，活化后的氮烯苯酸和三尖杉酯碱作用于HL60细胞各组实验中：同一剂量，同一作用时间下所取的细胞涂片之间，细胞凋亡指数及盼蓝染色阳性率均无显著差别(P>0.05)；不同剂量及药物作用不同时间所取的细胞涂片之间，细胞凋亡指数及台盼蓝染色阳性率均不同，有显著差别(P<0.001)。重复测量方差分析确定组间差异有显著性后，对图7～12的变化趋势进一步分析，结果如下：
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2.6.1氮烯苯酸诱导小鼠S180腹水癌细胞凋亡指数(图7)：自给药后2小时至72小时，对照组细胞凋亡指数在0.64%～3.70%，未见明显凋亡现象；在25.0～250.0mg/kg的范围内，细胞凋亡指数随着氮烯苯酸剂量的增加而增加；在2～48小时，细胞凋亡指数随着药物作用时间的延长而增加；48小时后，凋亡指数下降。
2.6.2氮烯苯酸作用于小鼠S180腹水癌细胞48、72小时，细胞台盼蓝染色阳性率(图8)：对照组台盼蓝染色阳性率为3.60%～4.21%；细胞台盼蓝染色阳性率随着药物剂量的增加和药物作用时间的延长而升高；氮烯苯酸250mg/kg，给药72小时后，腹水细胞台盼蓝染色阳性率达到49.31%。
2.6.3活化的氮烯苯酸诱导HL60细胞凋亡(图9)：对照组细胞凋亡指数在0.60%～1.03%内，未见明显的凋亡现象；在0.2～5.0μg/ml浓度范围及2～24小时的时间范围内，HL60细胞凋亡指数随着氮烯苯酸浓度的增加及时间延长而升高；本实验的最高浓度25.0μg/ml组，凋亡指数始终维持在最低水平11.00%～15.85%。
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2.6.4活化的氮烯苯酸作用于HL60细胞台盼蓝染色阳性率(图10)：对照组台盼蓝染色阳性率1.05%～6.68%；随着药物浓度的增加，细胞台盼蓝染色阳性率增加；在本实验药物的最高浓度25.0μg/ml作用下自第2小时起，HL60细胞台盼蓝染色阳性率即明显高于其它浓度组，至作用48小时该组细胞台盼蓝染色阳性率为65.35%。其余浓度的各组台盼蓝染色阳性率随时间延长而逐步升高。
2.6.5三尖杉酯碱诱导HL60细胞凋亡指数(图11)：对照组细胞凋亡指数0.68%～1.15%，未见明显凋亡现象；在0.02～1.0μg/ml浓度及2～24小时范围内凋亡指数随着氮烯苯酸浓度的增加及作用时间延长而升高；在本实验最高浓度5.0μg/ml组，药物作用8小时后，细胞凋亡指数即明显低于其它浓度组，并维持在较低水平。
2.6.6三尖杉酯碱作用于HL60细胞的台盼蓝染色阳性率(图12)：对照组台盼蓝染色阳性率0.85%～6.18%；随着药物浓度增加，细胞台盼蓝染色阳性率升高；本实验最高浓度5.0μg/ml组，台盼蓝染色阳性率一开始就明显高于其它浓度组，并维持在高水平，药物作用48小时染色阳性率达到74.16%。其余各用药组随药物浓度增加及作用时间延长，台盼蓝染色阳性率缓慢升高。药物作用48小时，0.02μg/ml，0.2μg/ml，1.0μg/ml组台盼蓝染色阳性率分别升至40.65%，47.74%，50.14%。
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3讨论
本文除用人早幼粒白血病HL60细胞这一研究凋亡的经典的体外模型外，还应用小鼠S180腹水癌这一体内模型，在不同药物剂量和不同作用时间的较大范围内，多次取材，成功地进行了凋亡的研究。腹水癌模型取材方便，易于制成单细胞悬液，并能在不同时点多次取样，用于活体条件下肿瘤细胞凋亡的研究是方便、可行和可靠的实验模型。
本实验在荧光显微镜观察、电子显微镜鉴定、流式细胞仪分析等确定细胞发生凋亡的前提下，在多个时间和剂量点采取标本计算细胞凋亡指数及台盼蓝染色阳性率，并首次引入“重复测量方差分析法”分析抗癌药物诱导肿瘤细胞凋亡的量-效，时-效关系以及凋亡和坏死的消长变化。实践表明该法在大规模，动态地研究药物诱导细胞凋亡时是一个有效手段。
无论三尖杉酯碱或氮烯苯酸，在一定范围内，细胞凋亡指数随着药物剂量的增加而增加，二者呈现一定的量-效关系。但是当药物浓度高至一定程度(在本实验中氮烯苯酸浓度为25.0μg/ml，三尖杉酯碱浓度为5.0μg/ml)时，细胞凋亡指数反而明显低于其它低浓度组，与此同时，细胞台盼蓝染色阳性率即坏死细胞率显著高于其它浓度组并持续增加。相似的现象还见于其它抗癌药物，例如：Fostriecin 在10～100μmol/L范围内诱导HL60细胞凋亡，当其浓度大于100μmol/L时，则诱导坏死〔10〕。可见抗癌药物作用于肿瘤细胞，在一定浓度范围内，以诱导细胞凋亡为主杀伤肿瘤细胞；而当浓度较高时，药物以诱导细胞坏死作为杀灭肿瘤细胞的主要方式。
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当药物作用启动细胞凋亡过程后，在一定时间范围内，细胞凋亡指数随药物作用时间的延长而增加，体现一定的时-效关系。药物作用时间继续延长，细胞凋亡指数下降；同时，细胞台盼蓝染色阳性率即坏死率随药物作用时间的延长而增加。本实验中，氮烯苯酸诱导S180腹水癌细胞和HL60细胞凋亡以及三尖杉酯碱诱导HL60细胞凋亡时，均呈现这种趋势，可以互为印证。同样的情况还见于阿糖胞苷诱导HL60细胞凋亡的报道〔11〕。
影响细胞台盼蓝染色阳性率的原因是多方面的。在体外培养的细胞模型中，影响因素更为复杂。如：长时间培养造成培养液能量和酸碱度的变化引起细胞继发性坏死等。据周剑峰等报道〔11〕，阿糖胞苷诱导HL60细胞凋亡，药物作用24小时后，细胞bcl-2阳性率有所上升，提示细胞可能预先杀灭低或无表达bcl-2的细胞亚群，从而导致bcl-2阳性率上升。残留高表达bcl-2亚群也可能会造成药物诱导肿瘤细胞凋亡指数下降。我们认为，不排除另一种可能性，即：当损伤性刺激持续存在至一定程度，由于细胞外部条件的变化或细胞内部的调控机制触发了坏死的发生。
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对轻微损伤，细胞通常通过DNA修复予以纠正，而“凋亡”与“坏死”是细胞对损害的完全不同的反应过程。本研究表明“凋亡”与“坏死”的消长变化均与损伤作用的强度和刺激持续程度有关，似乎提示了“凋亡”与“坏死”的启动与调控机制与外部损伤的时间阈值和强度阈值存在微妙关系。这值得从基因水平进行深入研究。
感谢中山医科大学肿瘤中心曹弃元副教授、黄慧强副主任，邝珠玑老师、李满枝老师的帮助以及本校统计教研室方积乾教授在本实验的统计分析工作中给予的宝贵指导。
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收稿日期：1999-05-07；修回日期：1999-07-06, 百拇医药