CD3 AK细胞与LAK细胞的诱导和体外杀伤活性的比较*
作者：罗小玲 梁安民 谢裕安 吴继宁
单位：(广西医科大学附属肿瘤医院生物治疗中心 南宁 530021)
关键词：CD3 AK细胞；LAK细胞；增殖能力；杀伤活性
广西医科大学学报990610
摘要 目的：探讨CD3 AK细胞与LAK细胞的诱导、增殖动力学和杀伤活性的变化。方法：采用抗CD3单克隆抗体(anti- CD3 McAb)和rIL-2及PHA(植物血凝素)共刺激法诱生扩增CD3 AK细胞，用等量rIL-2和PHA共刺激法诱生LAK细胞，观察它们的增殖动力学变化；用MTT法以K562细胞和H7402细胞为靶细胞，测定CD3 AK细胞和LAK细胞的杀伤活性。结果：微量的anti-CD3 McAb辅以少量的rIL-2和PHA就能诱导和大量扩增CD3 AK细胞，其扩增能力显著高于LAK细胞(P<0.001)；CD3 AK细胞对 K562细胞和H7402细胞的杀伤活性显著高于LAK细胞(P<0.05)。结论：CD3 AK细胞的扩增能力及杀伤活性均较LAK细胞为强，是更为有效的杀瘤效应细胞。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R392.11
COMPARISON OF INDUCTION AND KILLING ACTIVITY BETWEEN CD3 AK CELLS AND LAK CELLS IN VITRO
Luo Xiaoling,Liang Anmin,Xie Yuan,et al
(Biotherapy Centre,Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021)
Abstract Objective:To probe into the induction and changes of multiplication kinetics and killing activity in anti-CD3 monoclonal antibody activated killer cells (CD3 AK) and lymphokine-activated killer cells (LAK).Method:CD3 AK cells were induced by combined anti-CD3 McAb and recombinant IL-2 (rIL-2),and PHA,and LAK cells were induced by the same dose of rIL-2 and PHA.Their multiplication kinetics was observed.Killing activity of CD3 AK and LAK cells was determined by MTT method with K562 and H7402 cells being used as target cells.Results:CD3,AK cells were stimulated by trace anti-CD3 McAb plus rIL-2 and PHA,and were multiplicated on a large scale.The multiplication ability of CD3 AK cells was higher than that of LAK cells markedly (P<0.001) and the killing activity of CD3 AK cells was stronger than that of LAK cells significantly when K562 cells and H7402 cells were used as target cells (P<0.05).Conclusion:CD3 AK cells had higher multiplication ability and killing activity in comparison with LAK cells.CD3 AK cell is another more efficient killer cell.
, 百拇医药
Key words CD3 AK cell;LAK cell; multiplication ability;killing activity
抗CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞(anti-CD3 monoclonal antibody activated killer cells,CD3 AK细胞)和淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine-activated killer cells,LAK细胞)对肿瘤细胞具有高度的杀伤活性，是目前恶性肿瘤患者过继免疫治疗的有效的免疫效应细胞。我们对CD3 AK细胞与LAK细胞的诱导、增殖能力及杀伤活性进行了比较研究，结果报告如下。
1 材料与方法
1.1主要试剂：①anti-CD3 McAb：由中科院天津血液研究所提供；②rIL-2：上海生化所产品；③PHA：广州医工所产品；④RPMI1640培养基：美国GIBCOBRL公司产品；⑤淋巴细胞分离液：上海生化试剂二厂产品。
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1.2 靶细胞：K562细胞株(人红白血病细胞株)和H7402细胞株(人肝癌细胞株)均为本室传代培养，培养条件为含5%AB型血清的RPMI-1640完全培养基(CM)，37℃和体积分数为5% CO2，细胞存活率为98%以上。
1.3 CD3 AK细胞与LAK细胞的诱生扩增：
1.3.1 外周血单个核细胞(PBMC)分离：选择正常献血员(O型、Rh阳性，男女不限)的肝素抗凝血，按 2∶1比例(血样∶淋巴细胞分离液)，将血样沿离心管壁缓慢加于淋巴细胞分离液表面，室温下1 800 r/mim离心20 min，于界面处收集PBMC，用Hank's液低速离心洗涤3次，重悬于CM中，37℃和体积分数为5% CO2,孵育1 h去贴壁细胞，台盼蓝排斥试验检查活细胞率>98%。计数并调节细胞浓度为1×106/ml的细胞悬液。
, 百拇医药
1.3.2 CD3 AK细胞的诱生扩增：将PBMC、anti-CD3 McAb、rIL-2和PHA一起加入250 ml培养瓶中(终浓度：anti-CD3 McAb为1 mg/L，rIL-2为2×105 u/L，PHA为100 mg/L，细胞浓度为1×106/ml)，anti-CD3 McAb和PHA只加入1次，不被洗掉，rIL-2定期补充(每隔3 d用含2×105 u/L rIL-2的完全培养基传代)，此即为anti-CD3 McAb, rIL-2和PHA共刺激法。
1.3.3 LAK细胞的诱生扩增：采用等浓度时rIL-2和PHA共刺激PMBC，定期补充rIL-2(方法同CD3 AK细胞)。
1.4 扩增分析：在培养扩增后第4、7、10、13、16 d取培养的CD3 AK细胞悬液和LAK细胞悬液，按1∶1比例用质量浓度为0.2%台盼蓝生理盐水稀释，计活细胞数，并除以初始细胞数，求出实际扩增倍数。
, 百拇医药
1.5 杀伤活性检测：采用96孔平底细胞培养板用MTT法[1]分别测定CD3 AK细胞和LAK细胞的杀伤活性，靶细胞为K562细胞和H7402细胞，效靶细胞比例为50∶1，杀伤时间为48 h，每个样品做3个复孔。
1.6 统计学方法：数据用
±s表示，按配对资料进行t检验。
2 结 果
2.1CD3 AK细胞与LAK细胞增殖能力及增殖动力学的比较：采用直接计数法计活细胞数，观察培养16 d内的CD3 AK细胞与LAK细胞的扩增能力及增殖动力学变化，结果见表1。anti-CD3 McAb具有非常明显的激活和增殖作用，CD3 AK细胞的扩增倍数远大于LAK细胞，至培养的第10、13、16天，CD3 AK细胞的扩增倍数均极显著高于LAK细胞的扩增倍数(P<0.001)。
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表1 CD3AK细胞与LAK细胞的扩增倍数(±s) 细胞
细胞扩增倍数
4 d
7 d
10 d
13 d
16 d
CD3AK细胞
3±1.45
40±1.63*
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201±3.52**
408±5.19**
609±7.05**
LAK细胞
1±0.64
8±1.03
21±4.55
27±8.11
28±6.13
*P<0.01;**P<0.001
2.2 CD3 AK细胞与LAK细胞的杀伤活性比较：用MTT法检测培养至第10天的CD3 AK细胞与LAK细胞对K562细胞和H7402细胞的杀伤活性，结果见表2。CD3 AK细胞对K562和H7402二株肿瘤细胞的杀伤活性均显著高于LAK细胞(P<0.05)。
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表2 CD3AK细胞与LAK细胞杀伤活性比较(±s) 效应细胞
靶细胞
K562
H7402
CD3AK细胞
78.54±6.23*
64.37±8.23*
LAK细胞
56.28±3.54
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34.29±6.74
*P<0.053 讨 论
早在80年代，人们就已经发现针对T细胞表面分化抗原CD3分子的单克隆抗体具有强的丝裂原作用，当将淋巴细胞与anti-CD3 McAb共育2～3 d，淋巴细胞可见明显增殖，此种激活仅为一次性完成，淋巴细胞一经激活即无需anti-CD3 McAb的持续存在而发挥作用。当加入低剂量的IL-2继续培养即可维持其活跃增殖，经2～3周培养后每个克隆可扩增至104～105倍，体外增殖及活性维持可达4～5周[2]。我们的实验结果也证实了这一观点，微量的anti-CD3 McAb就能高效激活PBMC，CD3 AK细胞培养至第10天可扩增至201倍，第16天至609倍，而LAK细胞分别仅为21倍和28倍，二者比较有极显著差异。anti-CD3 McAb高效激活T细胞的机制普遍认为是：①通过anti-CD3 McAb与T细胞膜上的CD3/TCR复合体结合，激活淋巴细胞并诱导及促进其增殖[3]；②促进T细胞膜IL-2受体的充分表达，促进丝裂作用，启动LAK细胞活性，导致细胞增殖与活性增强[4]。笔者认为，以上两种机制本质上是一致的，都是通过影响淋巴细胞膜IL-2受体的数量和活性，使淋巴细胞对IL-2高度敏感，最终能在低剂量IL-2的存在下维持高效的增殖能力和杀瘤活性。本研究结果还显示了CD3 AK细胞的体外杀瘤活性显著高于LAK细胞，分析其原因可能有以下几点：①anti-CD3 McAb非特异性激活的淋巴细胞介导的组织相容性复合体(MHC)非限制性溶瘤作用[5]；②anti-CD3 McAb通过识别T细胞表面的CD3/TCR复合体促使其产生TNF(肿瘤坏死因子)和IFN(干扰素)等多种能杀伤肿瘤细胞的细胞因子[6]；③CD3 AK细胞的扩增能力明显高于LAK细胞，效应细胞数量多；④CD3 AK细胞诱导肿瘤细胞凋亡[5]。我们的研究结果表明：微量的anti-CD3 McAb和低剂量的rIL-2、PHA联合应用，可高效激活诱生出具有细胞毒活性的效应细胞—CD3 AK细胞，其扩增能力及杀瘤活性均较LAK细胞强，是肿瘤过继免疫治疗的新一代的高效抗瘤效应细胞。
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*广西区科技厅自然科学基金资助课题(9306083)
参 考 文 献
1 张志强,田志刚,崔亚言,等.MTT法检测NK和LAK活性的方法学探讨.中国实验临床免疫学杂志,1994，6(3):12
2 Yun YS, Hargrove ME, Ting CC.Heterogeneity of longterm cultured activated killer cells induced by anti-T3 antibody.J Immunol,1988，141:1 390
3 杨志刚主编.医药卫生科学技术进展.北京:人民军医出版社,1992.14
4 Laura AS.Induction of interleukin-2 receptors and proliferation in vesting peripheral T cells by monoclonal anti-CD(T) antibodies does not require the presence of macro phages.Clin Exp Immunol,1987,68:146
5 施广霞,钱振超,程一棹,等.CD3 AK介导的MHC非限制性溶瘤作用的机制分析.中国肿瘤生物治疗杂志，1995，2(4):269
6 Weiss AJ,Imtoden R,Wiskocil,et al.The role of T3 in the activation of human T cell.J Clin Immunol，1984，4:165
收稿日期：1999-07-21, 百拇医药
单位：(广西医科大学附属肿瘤医院生物治疗中心 南宁 530021)
关键词：CD3 AK细胞；LAK细胞；增殖能力；杀伤活性
广西医科大学学报990610
摘要 目的：探讨CD3 AK细胞与LAK细胞的诱导、增殖动力学和杀伤活性的变化。方法：采用抗CD3单克隆抗体(anti- CD3 McAb)和rIL-2及PHA(植物血凝素)共刺激法诱生扩增CD3 AK细胞，用等量rIL-2和PHA共刺激法诱生LAK细胞，观察它们的增殖动力学变化；用MTT法以K562细胞和H7402细胞为靶细胞，测定CD3 AK细胞和LAK细胞的杀伤活性。结果：微量的anti-CD3 McAb辅以少量的rIL-2和PHA就能诱导和大量扩增CD3 AK细胞，其扩增能力显著高于LAK细胞(P<0.001)；CD3 AK细胞对 K562细胞和H7402细胞的杀伤活性显著高于LAK细胞(P<0.05)。结论：CD3 AK细胞的扩增能力及杀伤活性均较LAK细胞为强，是更为有效的杀瘤效应细胞。
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中国图书资料分类法分类号 R392.11
COMPARISON OF INDUCTION AND KILLING ACTIVITY BETWEEN CD3 AK CELLS AND LAK CELLS IN VITRO
Luo Xiaoling,Liang Anmin,Xie Yuan,et al
(Biotherapy Centre,Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021)
Abstract Objective:To probe into the induction and changes of multiplication kinetics and killing activity in anti-CD3 monoclonal antibody activated killer cells (CD3 AK) and lymphokine-activated killer cells (LAK).Method:CD3 AK cells were induced by combined anti-CD3 McAb and recombinant IL-2 (rIL-2),and PHA,and LAK cells were induced by the same dose of rIL-2 and PHA.Their multiplication kinetics was observed.Killing activity of CD3 AK and LAK cells was determined by MTT method with K562 and H7402 cells being used as target cells.Results:CD3,AK cells were stimulated by trace anti-CD3 McAb plus rIL-2 and PHA,and were multiplicated on a large scale.The multiplication ability of CD3 AK cells was higher than that of LAK cells markedly (P<0.001) and the killing activity of CD3 AK cells was stronger than that of LAK cells significantly when K562 cells and H7402 cells were used as target cells (P<0.05).Conclusion:CD3 AK cells had higher multiplication ability and killing activity in comparison with LAK cells.CD3 AK cell is another more efficient killer cell.
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Key words CD3 AK cell;LAK cell; multiplication ability;killing activity
抗CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞(anti-CD3 monoclonal antibody activated killer cells,CD3 AK细胞)和淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine-activated killer cells,LAK细胞)对肿瘤细胞具有高度的杀伤活性，是目前恶性肿瘤患者过继免疫治疗的有效的免疫效应细胞。我们对CD3 AK细胞与LAK细胞的诱导、增殖能力及杀伤活性进行了比较研究，结果报告如下。
1 材料与方法
1.1主要试剂：①anti-CD3 McAb：由中科院天津血液研究所提供；②rIL-2：上海生化所产品；③PHA：广州医工所产品；④RPMI1640培养基：美国GIBCOBRL公司产品；⑤淋巴细胞分离液：上海生化试剂二厂产品。
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1.2 靶细胞：K562细胞株(人红白血病细胞株)和H7402细胞株(人肝癌细胞株)均为本室传代培养，培养条件为含5%AB型血清的RPMI-1640完全培养基(CM)，37℃和体积分数为5% CO2，细胞存活率为98%以上。
1.3 CD3 AK细胞与LAK细胞的诱生扩增：
1.3.1 外周血单个核细胞(PBMC)分离：选择正常献血员(O型、Rh阳性，男女不限)的肝素抗凝血，按 2∶1比例(血样∶淋巴细胞分离液)，将血样沿离心管壁缓慢加于淋巴细胞分离液表面，室温下1 800 r/mim离心20 min，于界面处收集PBMC，用Hank's液低速离心洗涤3次，重悬于CM中，37℃和体积分数为5% CO2,孵育1 h去贴壁细胞，台盼蓝排斥试验检查活细胞率>98%。计数并调节细胞浓度为1×106/ml的细胞悬液。
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1.3.2 CD3 AK细胞的诱生扩增：将PBMC、anti-CD3 McAb、rIL-2和PHA一起加入250 ml培养瓶中(终浓度：anti-CD3 McAb为1 mg/L，rIL-2为2×105 u/L，PHA为100 mg/L，细胞浓度为1×106/ml)，anti-CD3 McAb和PHA只加入1次，不被洗掉，rIL-2定期补充(每隔3 d用含2×105 u/L rIL-2的完全培养基传代)，此即为anti-CD3 McAb, rIL-2和PHA共刺激法。
1.3.3 LAK细胞的诱生扩增：采用等浓度时rIL-2和PHA共刺激PMBC，定期补充rIL-2(方法同CD3 AK细胞)。
1.4 扩增分析：在培养扩增后第4、7、10、13、16 d取培养的CD3 AK细胞悬液和LAK细胞悬液，按1∶1比例用质量浓度为0.2%台盼蓝生理盐水稀释，计活细胞数，并除以初始细胞数，求出实际扩增倍数。
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1.5 杀伤活性检测：采用96孔平底细胞培养板用MTT法[1]分别测定CD3 AK细胞和LAK细胞的杀伤活性，靶细胞为K562细胞和H7402细胞，效靶细胞比例为50∶1，杀伤时间为48 h，每个样品做3个复孔。
1.6 统计学方法：数据用
±s表示，按配对资料进行t检验。2 结 果
2.1CD3 AK细胞与LAK细胞增殖能力及增殖动力学的比较：采用直接计数法计活细胞数，观察培养16 d内的CD3 AK细胞与LAK细胞的扩增能力及增殖动力学变化，结果见表1。anti-CD3 McAb具有非常明显的激活和增殖作用，CD3 AK细胞的扩增倍数远大于LAK细胞，至培养的第10、13、16天，CD3 AK细胞的扩增倍数均极显著高于LAK细胞的扩增倍数(P<0.001)。
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表1 CD3AK细胞与LAK细胞的扩增倍数(
±s) 细胞细胞扩增倍数
4 d
7 d
10 d
13 d
16 d
CD3AK细胞
3±1.45
40±1.63*
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201±3.52**
408±5.19**
609±7.05**
LAK细胞
1±0.64
8±1.03
21±4.55
27±8.11
28±6.13
*P<0.01;**P<0.001
2.2 CD3 AK细胞与LAK细胞的杀伤活性比较：用MTT法检测培养至第10天的CD3 AK细胞与LAK细胞对K562细胞和H7402细胞的杀伤活性，结果见表2。CD3 AK细胞对K562和H7402二株肿瘤细胞的杀伤活性均显著高于LAK细胞(P<0.05)。
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表2 CD3AK细胞与LAK细胞杀伤活性比较(
±s) 效应细胞靶细胞
K562
H7402
CD3AK细胞
78.54±6.23*
64.37±8.23*
LAK细胞
56.28±3.54
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*P<0.053 讨 论
早在80年代，人们就已经发现针对T细胞表面分化抗原CD3分子的单克隆抗体具有强的丝裂原作用，当将淋巴细胞与anti-CD3 McAb共育2～3 d，淋巴细胞可见明显增殖，此种激活仅为一次性完成，淋巴细胞一经激活即无需anti-CD3 McAb的持续存在而发挥作用。当加入低剂量的IL-2继续培养即可维持其活跃增殖，经2～3周培养后每个克隆可扩增至104～105倍，体外增殖及活性维持可达4～5周[2]。我们的实验结果也证实了这一观点，微量的anti-CD3 McAb就能高效激活PBMC，CD3 AK细胞培养至第10天可扩增至201倍，第16天至609倍，而LAK细胞分别仅为21倍和28倍，二者比较有极显著差异。anti-CD3 McAb高效激活T细胞的机制普遍认为是：①通过anti-CD3 McAb与T细胞膜上的CD3/TCR复合体结合，激活淋巴细胞并诱导及促进其增殖[3]；②促进T细胞膜IL-2受体的充分表达，促进丝裂作用，启动LAK细胞活性，导致细胞增殖与活性增强[4]。笔者认为，以上两种机制本质上是一致的，都是通过影响淋巴细胞膜IL-2受体的数量和活性，使淋巴细胞对IL-2高度敏感，最终能在低剂量IL-2的存在下维持高效的增殖能力和杀瘤活性。本研究结果还显示了CD3 AK细胞的体外杀瘤活性显著高于LAK细胞，分析其原因可能有以下几点：①anti-CD3 McAb非特异性激活的淋巴细胞介导的组织相容性复合体(MHC)非限制性溶瘤作用[5]；②anti-CD3 McAb通过识别T细胞表面的CD3/TCR复合体促使其产生TNF(肿瘤坏死因子)和IFN(干扰素)等多种能杀伤肿瘤细胞的细胞因子[6]；③CD3 AK细胞的扩增能力明显高于LAK细胞，效应细胞数量多；④CD3 AK细胞诱导肿瘤细胞凋亡[5]。我们的研究结果表明：微量的anti-CD3 McAb和低剂量的rIL-2、PHA联合应用，可高效激活诱生出具有细胞毒活性的效应细胞—CD3 AK细胞，其扩增能力及杀瘤活性均较LAK细胞强，是肿瘤过继免疫治疗的新一代的高效抗瘤效应细胞。
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*广西区科技厅自然科学基金资助课题(9306083)
参 考 文 献
1 张志强,田志刚,崔亚言,等.MTT法检测NK和LAK活性的方法学探讨.中国实验临床免疫学杂志,1994，6(3):12
2 Yun YS, Hargrove ME, Ting CC.Heterogeneity of longterm cultured activated killer cells induced by anti-T3 antibody.J Immunol,1988，141:1 390
3 杨志刚主编.医药卫生科学技术进展.北京:人民军医出版社,1992.14
4 Laura AS.Induction of interleukin-2 receptors and proliferation in vesting peripheral T cells by monoclonal anti-CD(T) antibodies does not require the presence of macro phages.Clin Exp Immunol,1987,68:146
5 施广霞,钱振超,程一棹,等.CD3 AK介导的MHC非限制性溶瘤作用的机制分析.中国肿瘤生物治疗杂志，1995，2(4):269
6 Weiss AJ,Imtoden R,Wiskocil,et al.The role of T3 in the activation of human T cell.J Clin Immunol，1984，4:165
收稿日期：1999-07-21, 百拇医药