多形性胶质母细胞瘤 Pten /MMAC1 /Tep1 基因的表达研究*
作者：肖绍文 谢小薰 罗国容 陈维平 吴耀生 莫发荣
单位：肖绍文 (广西医科大学第一附属医院神经外科 南宁 530021); 谢小薰 罗国容 陈维平 莫发荣 广西医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室; 吴耀生 广西医科大学基础医学院生物化学教研室
关键词：Pten/MMCA1/Tep1基因；多形性胶质母细胞瘤；免疫组化
广西医科大学学报990605
摘要 目的：探讨肿瘤抑制基因Pten/MMAC1/Tep1在多形性胶质母细胞瘤中的作用。方法：用免疫组化ABC法检测20例多形性胶质母细胞瘤中Pten/MMAC1/Tep1基因的表达。结果：60%(12/20)病例该基因表达丢失；40%(8/20)表达低下；无一例表达正常。结论：Pten/MMAC1/Tep1表达异常可能与多形性胶质母细胞瘤的发生有关。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R730.264
STUDY ON Pten/MMAC1/Tep1 GENE EXPRESSION IN GLIOBLASTOMA MULTIFORME
Xiao Shaowen,Xie Xiaoxun,Luo Guorong,et al
(Deptment of Neurosurgery,First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021)
Abstract Objective:To explore the role of the tumor suppressor gene Pten/MMAC1/Tep1 on glioblastoma multiforme(GBM).Methods:20 cases of GBM were detected for expression of Pten/MMAC1/Tep1 by immunohistochemical technique (ABC method).Result:The rate for loss of the gene expression was 60% (12/20),and for lower expression of the gene was 40%(8/20).There was no one case present in normal expression of this gene.Conclusion:It was suggested that abnormal expression of Pten/MMAC1/Tep1 corresponded to the occurrence of GBM
, 百拇医药
Key words pten/MMCA1/tep1 gene;glioblastoma multiforme;immunohistochemistry
肿瘤抑制基因 Pten/MMAC1/Tep1于1997年由美国3个科研小组分别克隆，定位于染色体10q23.3，编码的蛋白质由403个氨基酸组成，为一种蛋白质酪氨酸磷酸酶(Protein Tyrosine Phosphatases,PTPs)[1～3]。现除了在 Cowden 病——一种常染色体显性遗传性错构瘤综合征中发现了该基因的胚系突变外[4]，在许多肿瘤如胶质瘤、乳腺癌、肾癌、前列腺癌和黑色素瘤等发现了各种类型的体细胞性突变[5]。目前国外有关 Pten/MMAC1/Tep1的研究多集中于基因的突变和缺失，对基因表达的研究还很少，国内尚未见有关 Pten/MMAC1/Tep1的研究报道。本研究采用免疫组化技术，对20例多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)进行Pten/MMAC1/Tep1蛋白质表达水平的检测，探讨该基因在GBM发生中的作用。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1病例与标本：20例GBM取自我校第一附属医院神经外科1995～1998年的手术切除的标本，并经病理查实。
1.2 免疫组化检测：肿瘤标本经福尔马林固定，55℃石蜡包埋。切片厚4 μm。常规脱蜡后用微波修复抗原，经过氧化氢阻断，血清封闭。1∶5000稀释兔抗人Pten/MMAC1/Tep1抗体(由美国Columbia大学医学院 Monica Peacocke医生惠赠)，孵育切片，4℃过夜，次日用ABC药盒(Vector公司)及方法染色，待显色后用苏木素复染。用免疫前兔血清作替代对照，PBS液作空白对照。5例正常脑组织和2例皮肤作正常对照。
1.3 结果判断：Pten/MMAC1/Tep1阳性反应细胞质出现棕黄色颗粒。阴性反应：细胞质内无阳性颗粒出现；弱阳性反应：少于20%的细胞出现阳性颗粒；阳性反应：多于20%的细胞出现阳性颗粒。
, 百拇医药
2 结 果
20例GBM中12例阴性，Pten/MMAC1/Tep1蛋白丢失率为60%，8例为弱阳性，Pten/MMAC1/Tep1蛋白表达低下为40%；无一例表达正常。正常对照组均为阳性；空白对照组和替代对照组均为阴性。
3 讨 论
Pten/MMAC1/Tep1的CDNA长1212bp，含9个外显子，编码蛋白50 ku，该蛋白除与PTPs高度同源外，尚与细胞质蛋白auxilin和张力蛋白部分同源。目前认为该基因的抗肿瘤作用是通过拮抗癌基因产物酪氨酸蛋白质激酶(Protein tyrosine kinase,PTKs)起作用，PTPs和PTKs协同作用维持着细胞生长和分化等所必需的蛋白质酪氨酸磷酸化的正常进行，这一过程失调将影响着细胞的正常生长并与细胞恶性转有关[1～3，5]。关于脑肿瘤中Pten/MMAC1/Tep1的研究，首先由Steck等[1]和Li等[2]报道，胶质瘤的突变率分别为26%(3/8)和31%(13/42)。随后Wang等[6]对GBM作了专题报道，发现74%(25/34)的病例在第10号染色体长臂上存在着杂合子丢失，其中有15例有DNA突变，突变率为44%，提示Pten/MMAC1/Tep1可能是使第10号染色体功能失活的主要靶基因。这些研究显示了在脑胶质瘤中存在各种类型的Pten/MMAC1/Tep1基因突变，其中一些突变将导致截断蛋白的产生。然而，蛋白质异常也可能与基因突变无关。关于GBM中Pten/MMAC1/Tep1蛋白的表达情况目前尚未见报道，从本研究结果来看，在GBM中该蛋白质丢失率较高(60%)，蛋白质低表达也占40%，即无一例呈Pten/MMAC1/Tep1表达正常，可见GBM中该蛋白表达异常达100%，远高于26%～44%的DNA突变率。Whang等[7]对前列腺癌的研究结果也有类似情况，10例移植瘤中除一例为Pten/MMAC1/Tep1基因的纯合子丢失外，其余均表现为野生型，然而在这些野生型的肿瘤中却发现5例有相应蛋白质表达低下和缺失，说明蛋白质表达异常并不完全由DNA突变所致。从Pten/MMAC1/Tep1的基因结构来看[3]，5’端存在着非常长的非翻译区，并含有许多 CpG岛结构，作为肿瘤抑制基因Pten/MMAC1/Tep1是否也与一些肿瘤抑制基因如(p16/CDKN2a)一样，由于启动子区域的甲基化导致转录完全阻断，使蛋白质的表达缺失[8]。针对这一问题，Carinse等[9]对原发性前列腺癌进行了甲基化研究，但未发现在Pten/MMAC1/Tep1的启动子区域有甲基化现象。Whang等[7]用去甲基化试剂使前列腺癌移植瘤的Pten/MMAC1/Tep1的mRNA表达恢复，提示该基因的CpG岛存在甲基化。虽然这些实验的结果不尽相同，还难以阐明Pten/MMAC1/Tep1蛋白表达异常的机制，但从我们的研究结果及一些学者对前列腺癌的研究结果来看，Pten/MMAC1/Tep1的表达异常远高于基因的突变率，提示Pten/MMAC1/Tep1的功能失活不仅限于DNA水平，可能尚存在于转录水平的异常和蛋白质修饰的异常，进一步对该基因蛋白质表达及功能的研究，将会更深入的认识Pten/MMAC1/Tep1在肿瘤发生中的作用。
, 百拇医药
GBM是胶质瘤中最恶性的一种,诊断后的生存年限常不超过2年[10],Pten/MMAC1/Tep1蛋白丢失与表达低下与生存年限有无关系，尚需进行大量的临床研究。此外,Pten/MMAC1/Tep1的蛋白表达差异是否存在于儿童和成人GBM中，以及其它胶质瘤与GBM中,它们之间有何临床意义,Pten/MMAC1/Tep1蛋白的检测是否可作为胶质瘤恶性程度和预后的参考指标将有待于进一步的研究。
(美国哥伦比亚大学医学院Dr.M.Peacoke 赠送抗体及ABC药盒，特此致谢)
*广西区科技厅青年科学基金资助(No.98110001)
参 考 文 献
1 Steck PA,Pershouse MA,Jasser SA,et al.Identification of a candidate tumor suppressor gene,MMAC1,at chromosome 10q23.3 that is mutated in multiple advanced cancers.Nature Genetics,1997,15(4):356
, 百拇医药
2 Lie J,Yen C,Law D,et al.PTEN,a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain,breast,and prostate cancer.Science,1997,275(5308):1943
3 Lie DM,Sun H.TEP1,encoded by a candidate tumor suppressor locus,is a novel protein tyrosine phosphatase regulated by transforming growth factor β.Cancer Res，1997,57:2124
4 Tsou HC,Ping XL,Ix Ciao Bun,et al.The genetic basis of Cowden’s syndrome:three novel mutation in PTEN/MMAC1/TEP1.Hum Genet，1998,102:467
, 百拇医药
5 谢小薰，肖绍文.肿瘤抑制基因 Pten /MMAC1.实用癌症杂志，1999，(3)：237～238
6 Wang SI,Puc J,Li J,et al.Somatic mutation of glioblastoma multiforme Cancer Res.1997,57(19):4183
7 Whang YE,Wu X,Suzhki H,et al.Inactivation of the tumor suppressor PTEN/MMAC1 in advanced human prostae cancer through loss of expression.Proc Natl.Acad Sci USA，1998,95:5246
8 Merlo A,Heman JG,Mao L,et al.5’CpG island methylation is associated with transcriptional silencing of the tumor suppressor P16/CDKN2/MTS1 in human cancers.Nat Med,1995,1:686
9 Cairns P,Okami K,Halachmi N,et al.Frequent inactivation of PTEN/MMAC1 in primary prostate cancer.Cancer Res，1997,57：4997
10 Louis DN.Cancer principles and practice of oncology.Ed 5.Philadelphia,Lippincott-Raven Publishers,1997,2013～2017
收稿日期：1999-05-26, 百拇医药
单位：肖绍文 (广西医科大学第一附属医院神经外科 南宁 530021); 谢小薰 罗国容 陈维平 莫发荣 广西医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室; 吴耀生 广西医科大学基础医学院生物化学教研室
关键词：Pten/MMCA1/Tep1基因；多形性胶质母细胞瘤；免疫组化
广西医科大学学报990605
摘要 目的：探讨肿瘤抑制基因Pten/MMAC1/Tep1在多形性胶质母细胞瘤中的作用。方法：用免疫组化ABC法检测20例多形性胶质母细胞瘤中Pten/MMAC1/Tep1基因的表达。结果：60%(12/20)病例该基因表达丢失；40%(8/20)表达低下；无一例表达正常。结论：Pten/MMAC1/Tep1表达异常可能与多形性胶质母细胞瘤的发生有关。
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中国图书资料分类法分类号 R730.264
STUDY ON Pten/MMAC1/Tep1 GENE EXPRESSION IN GLIOBLASTOMA MULTIFORME
Xiao Shaowen,Xie Xiaoxun,Luo Guorong,et al
(Deptment of Neurosurgery,First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021)
Abstract Objective:To explore the role of the tumor suppressor gene Pten/MMAC1/Tep1 on glioblastoma multiforme(GBM).Methods:20 cases of GBM were detected for expression of Pten/MMAC1/Tep1 by immunohistochemical technique (ABC method).Result:The rate for loss of the gene expression was 60% (12/20),and for lower expression of the gene was 40%(8/20).There was no one case present in normal expression of this gene.Conclusion:It was suggested that abnormal expression of Pten/MMAC1/Tep1 corresponded to the occurrence of GBM
, 百拇医药
Key words pten/MMCA1/tep1 gene;glioblastoma multiforme;immunohistochemistry
肿瘤抑制基因 Pten/MMAC1/Tep1于1997年由美国3个科研小组分别克隆，定位于染色体10q23.3，编码的蛋白质由403个氨基酸组成，为一种蛋白质酪氨酸磷酸酶(Protein Tyrosine Phosphatases,PTPs)[1～3]。现除了在 Cowden 病——一种常染色体显性遗传性错构瘤综合征中发现了该基因的胚系突变外[4]，在许多肿瘤如胶质瘤、乳腺癌、肾癌、前列腺癌和黑色素瘤等发现了各种类型的体细胞性突变[5]。目前国外有关 Pten/MMAC1/Tep1的研究多集中于基因的突变和缺失，对基因表达的研究还很少，国内尚未见有关 Pten/MMAC1/Tep1的研究报道。本研究采用免疫组化技术，对20例多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)进行Pten/MMAC1/Tep1蛋白质表达水平的检测，探讨该基因在GBM发生中的作用。
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1 材料和方法
1.1病例与标本：20例GBM取自我校第一附属医院神经外科1995～1998年的手术切除的标本，并经病理查实。
1.2 免疫组化检测：肿瘤标本经福尔马林固定，55℃石蜡包埋。切片厚4 μm。常规脱蜡后用微波修复抗原，经过氧化氢阻断，血清封闭。1∶5000稀释兔抗人Pten/MMAC1/Tep1抗体(由美国Columbia大学医学院 Monica Peacocke医生惠赠)，孵育切片，4℃过夜，次日用ABC药盒(Vector公司)及方法染色，待显色后用苏木素复染。用免疫前兔血清作替代对照，PBS液作空白对照。5例正常脑组织和2例皮肤作正常对照。
1.3 结果判断：Pten/MMAC1/Tep1阳性反应细胞质出现棕黄色颗粒。阴性反应：细胞质内无阳性颗粒出现；弱阳性反应：少于20%的细胞出现阳性颗粒；阳性反应：多于20%的细胞出现阳性颗粒。
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2 结 果
20例GBM中12例阴性，Pten/MMAC1/Tep1蛋白丢失率为60%，8例为弱阳性，Pten/MMAC1/Tep1蛋白表达低下为40%；无一例表达正常。正常对照组均为阳性；空白对照组和替代对照组均为阴性。
3 讨 论
Pten/MMAC1/Tep1的CDNA长1212bp，含9个外显子，编码蛋白50 ku，该蛋白除与PTPs高度同源外，尚与细胞质蛋白auxilin和张力蛋白部分同源。目前认为该基因的抗肿瘤作用是通过拮抗癌基因产物酪氨酸蛋白质激酶(Protein tyrosine kinase,PTKs)起作用，PTPs和PTKs协同作用维持着细胞生长和分化等所必需的蛋白质酪氨酸磷酸化的正常进行，这一过程失调将影响着细胞的正常生长并与细胞恶性转有关[1～3，5]。关于脑肿瘤中Pten/MMAC1/Tep1的研究，首先由Steck等[1]和Li等[2]报道，胶质瘤的突变率分别为26%(3/8)和31%(13/42)。随后Wang等[6]对GBM作了专题报道，发现74%(25/34)的病例在第10号染色体长臂上存在着杂合子丢失，其中有15例有DNA突变，突变率为44%，提示Pten/MMAC1/Tep1可能是使第10号染色体功能失活的主要靶基因。这些研究显示了在脑胶质瘤中存在各种类型的Pten/MMAC1/Tep1基因突变，其中一些突变将导致截断蛋白的产生。然而，蛋白质异常也可能与基因突变无关。关于GBM中Pten/MMAC1/Tep1蛋白的表达情况目前尚未见报道，从本研究结果来看，在GBM中该蛋白质丢失率较高(60%)，蛋白质低表达也占40%，即无一例呈Pten/MMAC1/Tep1表达正常，可见GBM中该蛋白表达异常达100%，远高于26%～44%的DNA突变率。Whang等[7]对前列腺癌的研究结果也有类似情况，10例移植瘤中除一例为Pten/MMAC1/Tep1基因的纯合子丢失外，其余均表现为野生型，然而在这些野生型的肿瘤中却发现5例有相应蛋白质表达低下和缺失，说明蛋白质表达异常并不完全由DNA突变所致。从Pten/MMAC1/Tep1的基因结构来看[3]，5’端存在着非常长的非翻译区，并含有许多 CpG岛结构，作为肿瘤抑制基因Pten/MMAC1/Tep1是否也与一些肿瘤抑制基因如(p16/CDKN2a)一样，由于启动子区域的甲基化导致转录完全阻断，使蛋白质的表达缺失[8]。针对这一问题，Carinse等[9]对原发性前列腺癌进行了甲基化研究，但未发现在Pten/MMAC1/Tep1的启动子区域有甲基化现象。Whang等[7]用去甲基化试剂使前列腺癌移植瘤的Pten/MMAC1/Tep1的mRNA表达恢复，提示该基因的CpG岛存在甲基化。虽然这些实验的结果不尽相同，还难以阐明Pten/MMAC1/Tep1蛋白表达异常的机制，但从我们的研究结果及一些学者对前列腺癌的研究结果来看，Pten/MMAC1/Tep1的表达异常远高于基因的突变率，提示Pten/MMAC1/Tep1的功能失活不仅限于DNA水平，可能尚存在于转录水平的异常和蛋白质修饰的异常，进一步对该基因蛋白质表达及功能的研究，将会更深入的认识Pten/MMAC1/Tep1在肿瘤发生中的作用。
, 百拇医药
GBM是胶质瘤中最恶性的一种,诊断后的生存年限常不超过2年[10],Pten/MMAC1/Tep1蛋白丢失与表达低下与生存年限有无关系，尚需进行大量的临床研究。此外,Pten/MMAC1/Tep1的蛋白表达差异是否存在于儿童和成人GBM中，以及其它胶质瘤与GBM中,它们之间有何临床意义,Pten/MMAC1/Tep1蛋白的检测是否可作为胶质瘤恶性程度和预后的参考指标将有待于进一步的研究。
(美国哥伦比亚大学医学院Dr.M.Peacoke 赠送抗体及ABC药盒，特此致谢)
*广西区科技厅青年科学基金资助(No.98110001)
参 考 文 献
1 Steck PA,Pershouse MA,Jasser SA,et al.Identification of a candidate tumor suppressor gene,MMAC1,at chromosome 10q23.3 that is mutated in multiple advanced cancers.Nature Genetics,1997,15(4):356
, 百拇医药
2 Lie J,Yen C,Law D,et al.PTEN,a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain,breast,and prostate cancer.Science,1997,275(5308):1943
3 Lie DM,Sun H.TEP1,encoded by a candidate tumor suppressor locus,is a novel protein tyrosine phosphatase regulated by transforming growth factor β.Cancer Res，1997,57:2124
4 Tsou HC,Ping XL,Ix Ciao Bun,et al.The genetic basis of Cowden’s syndrome:three novel mutation in PTEN/MMAC1/TEP1.Hum Genet，1998,102:467
, 百拇医药
5 谢小薰，肖绍文.肿瘤抑制基因 Pten /MMAC1.实用癌症杂志，1999，(3)：237～238
6 Wang SI,Puc J,Li J,et al.Somatic mutation of glioblastoma multiforme Cancer Res.1997,57(19):4183
7 Whang YE,Wu X,Suzhki H,et al.Inactivation of the tumor suppressor PTEN/MMAC1 in advanced human prostae cancer through loss of expression.Proc Natl.Acad Sci USA，1998,95:5246
8 Merlo A,Heman JG,Mao L,et al.5’CpG island methylation is associated with transcriptional silencing of the tumor suppressor P16/CDKN2/MTS1 in human cancers.Nat Med,1995,1:686
9 Cairns P,Okami K,Halachmi N,et al.Frequent inactivation of PTEN/MMAC1 in primary prostate cancer.Cancer Res，1997,57：4997
10 Louis DN.Cancer principles and practice of oncology.Ed 5.Philadelphia,Lippincott-Raven Publishers,1997,2013～2017
收稿日期：1999-05-26, 百拇医药