Etest法在耳鼻咽喉致病真菌药敏检测中的应用研究*
作者：李菊裳 农辉图 程 鹂
单位：李菊裳 程 鹂(广西医科大学第一附属医院皮肤性病科 南宁 530021); 农辉图 广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科
关键词：Etest；药敏试验；耳鼻咽喉真菌病
广西医科大学学报990603
摘要 目的：用Etest法研究耳鼻咽喉致病真菌对酮康唑(KE)、伊曲康唑(IT)、5-氟孢嘧啶(FC)、二性霉素B(AP)、氟康唑(FL)5种抗真菌药的敏感性。方法：按瑞典倍肯公司关于Etest检测方法，用上述5种抗真菌药对来自耳鼻咽喉的黄曲霉、烟曲霉及白念珠菌等15种致病真菌进行药敏检测，判定其MIC值。结果：①白念珠菌对上述5种抗真菌药均敏感，其中酮康唑及伊曲康唑最敏感；②酮康唑、伊曲康唑对黄曲霉、烟曲霉、米曲霉、卡氏枝孢霉、尖端单孢霉、桔青霉及皮癣菌均有敏感性，两药对15种致病真菌的MIC值分别为≤0.008～>32 mg/L和≤0.006～32 mg/L；③氟康唑对15种受试菌株中的11株有耐药性，其MIC值≤0.5～>32 mg/L。结论：① Etest法对致病真菌的药敏检测具有先进新颖，操作简便，定值精确，结论可靠，重复性好的优点；②酮康唑、伊曲康唑有广谱高效的抗真菌功效，而氟康唑是窄谱的抗真菌药。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R763
STUDY ON SUSCEPTIBILITY TESTING OF PATHOGENIC FUNGI FROM OTORHINOLARYNGOLOGY BY ETEST METHOD
Li Jushang, Nong Huitu,Cheng Li
(Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021)
Abstract Objectve:To study sensitivity of pathogenic fungi from otorhinolaryngology to 5 antifungal agents of Ketoconazole (KE),Itraconazole(IT),Fluorocytosine(FC),Amphtericin B (AP) and Fluconazole (FL) by Etest method.Methods:The Etest for determing MIC of pathogenic fungi was performed according to the manufactuer's instructions.The Etest trip of comtaining above 5 antifungal drugs were put on medium with Candida albicans，A.flarus and A.fumigatus etc,respectively，for determing MIC of antifungal drugs.Results:Candida albicans were sensitized to all the above 5 antifungal drugs,and specially,KE and IT were most sensitized.KE and IT were sensitized to all A.flavus,A.fumigatus,A.oryzae,Cladosporium carrionii,Monosporium apiospermum,Penicillium citrinum and Dermatophyte.The MIC range KE and IT against 15 strains of pathogenic fungi were≤0.008～≤12 mg/L and ≤0.006～4 mg/L,respectively.The MIC of FL was ≤0.5～>32 mg/L and 11 of 15 strain showed resistance.Conclusion:Advantages of Etest method for testing antifungal susceptibilities of pathogenic fungi to the above five antifungal agents is novel,advanced,handy,exact and satisfactory reproduction.KE and IT are a broad spectrum and highly efficent antifungal drugs and FL is a narrow spectrum of antifungal agent.
, 百拇医药
Key words etest;susceptibility testing;mycosis of otorhinolaryngology
由于多种因素的影响，侵袭性或非侵袭性真菌感染越来越多，耳鼻咽喉真菌病常见。此类真菌感染对人健康威胁性较大，且耐药性报告增多，为监测抗真菌药物的敏感性及耐药性，以指导治疗，致病性耳鼻咽喉真菌的药敏测试已显得极其重要。抗真菌药敏检测方法较多，真菌的药敏测试由于受不同药物、菌种、方法等相关因素的影响而复杂难做。唯用Etest技术检测目前国内未有报告，本研究对本院耳鼻咽喉科真菌病分离出的15个不同菌种的真菌，用瑞典倍肯公司(AB BIODISK Sweden)产的Etest抗真菌药敏试条进行药敏测试，现报告如下。
1 材料与方法
1.1实验菌株：用自本院耳鼻咽喉科门诊及住院的耳部、鼻、副鼻窦、咽喉霉菌病病人分离出的白念珠菌、黄曲霉、烟曲霉、棕曲霉、棒曲霉、米曲霉、黑曲霉、卡氏枝孢霉、尖端单孢霉、桔青霉、米根霉、孢子丝菌及耳廓癣的红色毛癣菌、须癣毛菌及断发毛癣菌等15株活化的真菌，曲霉菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂基(PDA)，其余菌株接种于葡萄糖蛋白胨琼脂基(SDA)。除白念珠菌培养24 h外，其余菌株培养7d。用1ml无菌生理盐水置于菌落上，用一巴斯吸液管将分生孢子与菌丝微粒混合为均匀悬液，过滤离心沉淀，加生理盐水制成0.5麦氏浓度悬液。
, 百拇医药
1.2 培养基：新鲜配制的RPMI1640加MOPS加质量浓度为2%的葡萄糖，调整pH7.0，加入质量浓度为1.5% Bacto琼脂基(RPMI琼脂基)，消毒灭菌后即分别置于15个直径150 mm无菌实验平板上自然冷却。
1.3 实验药物：瑞典倍肯公司1998年生产的Etest抗真菌药敏试条，包括二性霉素B(AP)、5氟胞嘧啶(FC)、酮康唑(KE)、伊曲康唑(IT)、氟康唑(FL)等5种，起始浓度32 mg/L，终末浓度0.002 mg/L。
1.4 方法：①以无菌拭子分别蘸取上述15种受试菌株之菌悬液，从3个方向分别涂布于实验菌株的RPMI琼脂平板上，然后将实验平板置于生物安全柜中放置15 min，以使表面干燥；②分别用无菌镊子将上述5种Etest抗真菌药敏试条呈同心等距放射状置于各自的实验菌株RPMI琼脂平板上，置25℃孵育。
1.5 MIC判读：孵育24 h后开始初次判读，48 h第二次判读，一直观察7 d，判读时间视菌株生长的快慢而定。在抑菌圈与MIC刻度交界处读取MIC值。
, 百拇医药
2 结 果
5种常用抗真菌药物对15株不同的真菌的MIC值不同(表1)，白念珠菌对KE、IT、FC、AP、FL均敏感，尤以KE及IT最感，MC范围≤0.012～0.5 mg/L(图1)，黄曲霉对IT、KE、FC的MIC≤0.125～0.75 mg/L，AP及FL的MIC值>3 mg/L(图2)。结果表明，酮康唑、伊曲康唑具有抗菌谱广，对受试的白念珠菌、黄曲霉、烟曲霉、棕曲霉、米曲霉、卡氏枝孢霉、尖端单孢霉、桔青霉及红色毛癣菌、须癣毛菌、断发毛癣菌等皮肤癣菌均有较好的抑菌作用，氟康唑抗菌谱较窄，仅对白念珠菌、红色毛癣菌、须癣菌敏感，对其它受试的11株菌均耐药。
表1 耳鼻咽喉真菌病致病菌种Etest法药敏检测MIC值(ρB/mg.L-1) 菌种名
KE
, http://www.100md.com IT
FC
AP
FL
观察时间
(t/h)
白念珠菌
0.012
0.023
0.047
0.054
0.5
24
, http://www.100md.com
黄曲霉
0.75
0.125
0.75
>32
>32
72
烟曲霉
2
1
0.25
>32
>32
, 百拇医药
72
棕曲霉
12
4
>32
>32
>32
48
棒曲霉
>32
6
>32
0.094
, http://www.100md.com >32
48
米曲霉
1
0.5
>32
>32
>32
72
黑曲霉
>32
8
1.5
0.75
, 百拇医药
>32
24
卡氏枝孢霉
0.047
0.047
>32
4
>32
96
尖端单孢霉
1
0.19
0.125
, http://www.100md.com
32
>32
72
桔青霉
0.5
1.5
0.19
0.064
>32
48
米根霉
>32
>32
, 百拇医药
>32
>32
>32
72
孢子丝菌
不生长
168
红色毛癣菌
0.012
0.006
>32
0.25
0.125
, http://www.100md.com
96
须癣毛菌
0.008
0.006
>32
>32
1
96
断发毛癣菌
0.125
0.032
>32
3
, 百拇医药
>32
96
图1 白色念珠菌药敏图
图2 黄曲霉菌药敏图
3 讨 论
随着各种真菌感染的疾病日趋增多，耐药菌株亦渐出现，抗真菌药敏测试日显重要，目前国际及国内尚无标准化的测试方法，药基法、纸片法及微量稀释法，各有优缺点，但操作较复杂难做，Colombo曾用美国国家实验室标准委员会(NCCLS)的抗真菌药敏试验专门委员会的微量稀释法Etest法对氟康唑与伊曲康唑进行对比研究，结果两法有很好的一致性，认为Etest法与微量稀释法两者可作为互相代替的药敏检测方法[1]。本研究在国内首次使用瑞典倍肯公司生产的Etest抗真菌药敏试条，对分离来自耳鼻咽喉真菌病的15株真菌作药敏测试，效果满意，Etest法与上述3种方法比较，具有技术先进、简便易行、定值准确、重复性好、结果可靠的优点。
, 百拇医药
本研究5种常用抗真菌药对白念珠菌均有很好的抑菌作用，尤以酮康唑及伊曲康唑为佳，明显优于氟康唑及二性霉素B，与国外Gupta有关两药的药代动力学报告相符[2]，和金学洙[3]报告的相似，但Etest氟康唑药敏试条对白念珠菌的MIC值较吴绍熙[4]报告的药基法的MIC值为高，这可能与使用的检测方法不同有关，或由于使用这株白念珠菌对氟康唑不那么敏感有关。本研究表明伊曲康唑及酮康唑对红色毛癣菌、须癣菌及断发毛菌特具敏感性，其MIC值明显低于刘维达[5]用微量稀释法的MIC值，此可能与实验方法不同有关，微量稀释法用于丝状菌敏试的难度较大。本研究表明伊曲康唑、酮康唑具有抗菌谱广，对白念珠菌、黄曲霉、烟曲霉、棕曲霉、米曲霉、卡氏枝孢霉、尖端单孢菌、桔青霉及皮肤癣菌均有很好的敏感性。在治疗真菌感染的疾病时，应选用对致病真菌敏感性好副作用小的抗真菌药，方可收到满意的疗效，本研究必将在真菌病的临床诊疗上起很高的指导作用。
*本研究是广西区教育厅资助项目(编号：96047)
, http://www.100md.com
参 考 文 献
1 Colombo AL，Barchiesi F,McGough DA，et al.Comparison of Etest and National Committee for Clinical Laborotory Standards broth Macrodilution Method for azole antifungal susceptibility testing.J Clin Microbiol，1995,33(3):535～540
2 Gupta AK,Sauder DN，Shear NH.Antifungal agent:an Review Part Ⅰ and Part Ⅱ.J Am Acad Dermatol，1994,36(5):677～689; 36(6):911～933
3 金学洙，张恩轩，李福秋,等.伊曲康唑等药物的抑菌实验研究.中国皮肤性病学杂志，1997，11(3)：141～143
4 吴绍熙，郭宁如，沈永年，等.国产氟康唑抗真菌药敏学研究.中华皮肤科杂志，1994，27(2)：80～82
5 刘维达，王金燕，吴建明.微量稀释法测定皮肤癣菌最低抑菌浓度(MIC)的实验研究.临床皮肤科杂志,1997，26(4)：228～250
收稿日期：1999-05-11, 百拇医药
单位：李菊裳 程 鹂(广西医科大学第一附属医院皮肤性病科 南宁 530021); 农辉图 广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科
关键词：Etest；药敏试验；耳鼻咽喉真菌病
广西医科大学学报990603
摘要 目的：用Etest法研究耳鼻咽喉致病真菌对酮康唑(KE)、伊曲康唑(IT)、5-氟孢嘧啶(FC)、二性霉素B(AP)、氟康唑(FL)5种抗真菌药的敏感性。方法：按瑞典倍肯公司关于Etest检测方法，用上述5种抗真菌药对来自耳鼻咽喉的黄曲霉、烟曲霉及白念珠菌等15种致病真菌进行药敏检测，判定其MIC值。结果：①白念珠菌对上述5种抗真菌药均敏感，其中酮康唑及伊曲康唑最敏感；②酮康唑、伊曲康唑对黄曲霉、烟曲霉、米曲霉、卡氏枝孢霉、尖端单孢霉、桔青霉及皮癣菌均有敏感性，两药对15种致病真菌的MIC值分别为≤0.008～>32 mg/L和≤0.006～32 mg/L；③氟康唑对15种受试菌株中的11株有耐药性，其MIC值≤0.5～>32 mg/L。结论：① Etest法对致病真菌的药敏检测具有先进新颖，操作简便，定值精确，结论可靠，重复性好的优点；②酮康唑、伊曲康唑有广谱高效的抗真菌功效，而氟康唑是窄谱的抗真菌药。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R763
STUDY ON SUSCEPTIBILITY TESTING OF PATHOGENIC FUNGI FROM OTORHINOLARYNGOLOGY BY ETEST METHOD
Li Jushang, Nong Huitu,Cheng Li
(Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021)
Abstract Objectve:To study sensitivity of pathogenic fungi from otorhinolaryngology to 5 antifungal agents of Ketoconazole (KE),Itraconazole(IT),Fluorocytosine(FC),Amphtericin B (AP) and Fluconazole (FL) by Etest method.Methods:The Etest for determing MIC of pathogenic fungi was performed according to the manufactuer's instructions.The Etest trip of comtaining above 5 antifungal drugs were put on medium with Candida albicans，A.flarus and A.fumigatus etc,respectively，for determing MIC of antifungal drugs.Results:Candida albicans were sensitized to all the above 5 antifungal drugs,and specially,KE and IT were most sensitized.KE and IT were sensitized to all A.flavus,A.fumigatus,A.oryzae,Cladosporium carrionii,Monosporium apiospermum,Penicillium citrinum and Dermatophyte.The MIC range KE and IT against 15 strains of pathogenic fungi were≤0.008～≤12 mg/L and ≤0.006～4 mg/L,respectively.The MIC of FL was ≤0.5～>32 mg/L and 11 of 15 strain showed resistance.Conclusion:Advantages of Etest method for testing antifungal susceptibilities of pathogenic fungi to the above five antifungal agents is novel,advanced,handy,exact and satisfactory reproduction.KE and IT are a broad spectrum and highly efficent antifungal drugs and FL is a narrow spectrum of antifungal agent.
, 百拇医药
Key words etest;susceptibility testing;mycosis of otorhinolaryngology
由于多种因素的影响，侵袭性或非侵袭性真菌感染越来越多，耳鼻咽喉真菌病常见。此类真菌感染对人健康威胁性较大，且耐药性报告增多，为监测抗真菌药物的敏感性及耐药性，以指导治疗，致病性耳鼻咽喉真菌的药敏测试已显得极其重要。抗真菌药敏检测方法较多，真菌的药敏测试由于受不同药物、菌种、方法等相关因素的影响而复杂难做。唯用Etest技术检测目前国内未有报告，本研究对本院耳鼻咽喉科真菌病分离出的15个不同菌种的真菌，用瑞典倍肯公司(AB BIODISK Sweden)产的Etest抗真菌药敏试条进行药敏测试，现报告如下。
1 材料与方法
1.1实验菌株：用自本院耳鼻咽喉科门诊及住院的耳部、鼻、副鼻窦、咽喉霉菌病病人分离出的白念珠菌、黄曲霉、烟曲霉、棕曲霉、棒曲霉、米曲霉、黑曲霉、卡氏枝孢霉、尖端单孢霉、桔青霉、米根霉、孢子丝菌及耳廓癣的红色毛癣菌、须癣毛菌及断发毛癣菌等15株活化的真菌，曲霉菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂基(PDA)，其余菌株接种于葡萄糖蛋白胨琼脂基(SDA)。除白念珠菌培养24 h外，其余菌株培养7d。用1ml无菌生理盐水置于菌落上，用一巴斯吸液管将分生孢子与菌丝微粒混合为均匀悬液，过滤离心沉淀，加生理盐水制成0.5麦氏浓度悬液。
, 百拇医药
1.2 培养基：新鲜配制的RPMI1640加MOPS加质量浓度为2%的葡萄糖，调整pH7.0，加入质量浓度为1.5% Bacto琼脂基(RPMI琼脂基)，消毒灭菌后即分别置于15个直径150 mm无菌实验平板上自然冷却。
1.3 实验药物：瑞典倍肯公司1998年生产的Etest抗真菌药敏试条，包括二性霉素B(AP)、5氟胞嘧啶(FC)、酮康唑(KE)、伊曲康唑(IT)、氟康唑(FL)等5种，起始浓度32 mg/L，终末浓度0.002 mg/L。
1.4 方法：①以无菌拭子分别蘸取上述15种受试菌株之菌悬液，从3个方向分别涂布于实验菌株的RPMI琼脂平板上，然后将实验平板置于生物安全柜中放置15 min，以使表面干燥；②分别用无菌镊子将上述5种Etest抗真菌药敏试条呈同心等距放射状置于各自的实验菌株RPMI琼脂平板上，置25℃孵育。
1.5 MIC判读：孵育24 h后开始初次判读，48 h第二次判读，一直观察7 d，判读时间视菌株生长的快慢而定。在抑菌圈与MIC刻度交界处读取MIC值。
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2 结 果
5种常用抗真菌药物对15株不同的真菌的MIC值不同(表1)，白念珠菌对KE、IT、FC、AP、FL均敏感，尤以KE及IT最感，MC范围≤0.012～0.5 mg/L(图1)，黄曲霉对IT、KE、FC的MIC≤0.125～0.75 mg/L，AP及FL的MIC值>3 mg/L(图2)。结果表明，酮康唑、伊曲康唑具有抗菌谱广，对受试的白念珠菌、黄曲霉、烟曲霉、棕曲霉、米曲霉、卡氏枝孢霉、尖端单孢霉、桔青霉及红色毛癣菌、须癣毛菌、断发毛癣菌等皮肤癣菌均有较好的抑菌作用，氟康唑抗菌谱较窄，仅对白念珠菌、红色毛癣菌、须癣菌敏感，对其它受试的11株菌均耐药。
表1 耳鼻咽喉真菌病致病菌种Etest法药敏检测MIC值(ρB/mg.L-1) 菌种名
KE
, http://www.100md.com IT
FC
AP
FL
观察时间
(t/h)
白念珠菌
0.012
0.023
0.047
0.054
0.5
24
, http://www.100md.com
黄曲霉
0.75
0.125
0.75
>32
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72
烟曲霉
2
1
0.25
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, 百拇医药
72
棕曲霉
12
4
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48
棒曲霉
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0.094
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米曲霉
1
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黑曲霉
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8
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卡氏枝孢霉
0.047
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>32
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尖端单孢霉
1
0.19
0.125
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桔青霉
0.5
1.5
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0.064
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米根霉
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72
孢子丝菌
不生长
168
红色毛癣菌
0.012
0.006
>32
0.25
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96
须癣毛菌
0.008
0.006
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1
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断发毛癣菌
0.125
0.032
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图1 白色念珠菌药敏图
图2 黄曲霉菌药敏图
3 讨 论
随着各种真菌感染的疾病日趋增多，耐药菌株亦渐出现，抗真菌药敏测试日显重要，目前国际及国内尚无标准化的测试方法，药基法、纸片法及微量稀释法，各有优缺点，但操作较复杂难做，Colombo曾用美国国家实验室标准委员会(NCCLS)的抗真菌药敏试验专门委员会的微量稀释法Etest法对氟康唑与伊曲康唑进行对比研究，结果两法有很好的一致性，认为Etest法与微量稀释法两者可作为互相代替的药敏检测方法[1]。本研究在国内首次使用瑞典倍肯公司生产的Etest抗真菌药敏试条，对分离来自耳鼻咽喉真菌病的15株真菌作药敏测试，效果满意，Etest法与上述3种方法比较，具有技术先进、简便易行、定值准确、重复性好、结果可靠的优点。
, 百拇医药
本研究5种常用抗真菌药对白念珠菌均有很好的抑菌作用，尤以酮康唑及伊曲康唑为佳，明显优于氟康唑及二性霉素B，与国外Gupta有关两药的药代动力学报告相符[2]，和金学洙[3]报告的相似，但Etest氟康唑药敏试条对白念珠菌的MIC值较吴绍熙[4]报告的药基法的MIC值为高，这可能与使用的检测方法不同有关，或由于使用这株白念珠菌对氟康唑不那么敏感有关。本研究表明伊曲康唑及酮康唑对红色毛癣菌、须癣菌及断发毛菌特具敏感性，其MIC值明显低于刘维达[5]用微量稀释法的MIC值，此可能与实验方法不同有关，微量稀释法用于丝状菌敏试的难度较大。本研究表明伊曲康唑、酮康唑具有抗菌谱广，对白念珠菌、黄曲霉、烟曲霉、棕曲霉、米曲霉、卡氏枝孢霉、尖端单孢菌、桔青霉及皮肤癣菌均有很好的敏感性。在治疗真菌感染的疾病时，应选用对致病真菌敏感性好副作用小的抗真菌药，方可收到满意的疗效，本研究必将在真菌病的临床诊疗上起很高的指导作用。
*本研究是广西区教育厅资助项目(编号：96047)
, http://www.100md.com
参 考 文 献
1 Colombo AL，Barchiesi F,McGough DA，et al.Comparison of Etest and National Committee for Clinical Laborotory Standards broth Macrodilution Method for azole antifungal susceptibility testing.J Clin Microbiol，1995,33(3):535～540
2 Gupta AK,Sauder DN，Shear NH.Antifungal agent:an Review Part Ⅰ and Part Ⅱ.J Am Acad Dermatol，1994,36(5):677～689; 36(6):911～933
3 金学洙，张恩轩，李福秋,等.伊曲康唑等药物的抑菌实验研究.中国皮肤性病学杂志，1997，11(3)：141～143
4 吴绍熙，郭宁如，沈永年，等.国产氟康唑抗真菌药敏学研究.中华皮肤科杂志，1994，27(2)：80～82
5 刘维达，王金燕，吴建明.微量稀释法测定皮肤癣菌最低抑菌浓度(MIC)的实验研究.临床皮肤科杂志,1997，26(4)：228～250
收稿日期：1999-05-11, 百拇医药