肝药酶诱导剂对暴发性肝衰竭的影响*
作者：黄仁彬 邦古拉 臧林泉 梁 霜 王乃平
单位：(广西医科大学药理学教研室 南宁 530021)
关键词：苯巴比妥；利福平；暴发性肝衰竭；细胞色素P450；氨性肝昏迷
广西医科大学学报990602 摘要 目的：研究肝微粒体药物代谢酶(肝药酶)诱导剂苯巴比妥(PB)和利福平(RFP)对肝药酶和肝衰竭的影响。方法：观察PB和RFP对肝药酶细胞色素P450(P450)和细胞色素b5(Cyt.b5)的含量、苯胺羟化酶活性、肝切除暴发性肝衰竭死亡率和高血氨性肝昏迷存活期的影响。结果：PB和RFP能明显提高正常肝脏和部分肝切除后再生肝P450含量和苯胺羟化酶活性。在肝切除术后5h至9d内，经PB处置的小鼠暴发性肝衰竭死亡率低于空白对照组，分别为32.1%和49.2%。存活期也明显长于空白对照组，分别为(160.7±84.1)h和(128.9±92.6)h。此外，在肝切除小鼠中，PB和RFP组NH4Cl所致的高血氨性肝昏迷存活期分别为(60.8±22.5)h和(112.9±7.2)h，也明显长于空白对照组的(44.6±28.3)h。结论：PB和RFP能显著地诱导肝药酶，延长高血氨性肝昏迷的存活期，以及有一定的降低肝切除暴发性肝衰竭死亡率作用。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R969.2
EFFECT OF MICROSOMAL DRUG-METABOLIZING ENZYME
INDUCERS ON FULMINANT ILVER FAILURE
Huang Renbin,Banggula,Zang Linquan,et al.
(Department of Pharmacology,Guangxi Medical University,Nanning,530021)
Abstract Objective:To study the effect of hepatic microsomal drug-metabolizing enzyme inducers rifampin (RFP) and phenobarbital (PB) on fulminant liver failure.Methods:The effects of PB and RFP on the contents of microsomal drug-metabolizing enzyme cytochrome P450(P450) and cytochrome b5(Cyt.b5),the activity of aniline hydroxylase,the mortality of fulminant liver failure caused by hepatectomy,and the survival period of ammonemia hepatic coma induced by ammonium chloride were investigated.Results:The content of P450 and the activity of aniline hydroxylase were significantly increased in the normal liver and regenerated liver after partial hepatetomy by the treatment with PB and RFP.The mortality of fulminant liver failure by hepatetomy was 32.1% in mice treated with PB,compared to 49.2% in control within 5h to 9d after the hepatetomy.The survival period was longer in PB group than in control,(160.7±84.1)h and (128.9±92.6)h,respectively.In addition,the survival periods of ammonemia hepatic coma induced by NH4Cl in the groups treated with both PB and RFP were (60.8±22.5)h and (112.9±7.2)h,respectively,which were longer than that in control (44.6±28.3)h following the hepatetomy.Conclusion:PB and RFP could significantly induce microsomal drug-metabolizing enzyme and extend the survival period of ammonemia hepatic coma,and also decrease the mortality of fulminant liver failure by hepatetomy to some extent.
, 百拇医药
Key words phenobarbital;rifampin;fulminant liver failure;cytochrome P450;ammonemia hepatic coma
暴发性肝衰竭系由多种原因如病毒性肝炎和药物中毒等引起的急性大量肝细胞坏死，或肝细胞内细胞器严重功能障碍，致短期内发展至肝性脑病的一种综合症，大部分肝切除、肝移植和肝硬化也可导致暴发性肝衰竭。目前主要强调综合治疗，包括消除致病因素，纠正代谢紊乱、应用肝细胞生长因子以促进肝细胞再生和治疗并发症等，但治疗效果欠理想，死亡率可高达44～48%[1]。为此，我们试图寻找新的治疗方法，本文主要研究肝药酶诱导剂PB和RFP对正常肝脏和大部分肝切除后再生肝脏肝药酶的诱导作用及对部分肝切除暴发性肝衰竭和外源性高血氨性肝昏迷的治疗作用。
1 材料与方法
1.1材料
, 百拇医药
1.1.1 药品：苯巴比妥钠，每支0.1 g，上海中国第八制药厂生产，批号：79110624；利福平，每粒150 mg,上海衡山药业有限公司生产，批号：980501。
1.1.2 试剂：连二亚硫酸钠(Na2S2O4)，广东汕头新宁化工厂出品，批号：920816；辅酶Ⅱ(NADPH)，上海丽珠东风生物技术有限公司出品，批号：3007。
1.1.3 仪器：美国Beckman DU-640紫外可见光分光光度计。
1.1.4 动物：昆明系小鼠，体质量24～30 g，雌雄兼用，由广西医科大学实验动物中心提供。
1.2 方法
1.2.1 动物处理与肝微粒体的制备：将小鼠随机分为空白对照组、PB组(80 mg/kg,腹腔注射)和RFP组(100 mg/kg,灌胃)。空白对照组给予生理盐水。动物每天给药1次，连续8 d。第9天用乙醚麻醉，作大部分肝切除手术(约切除70%)。切除的肝脏用冰冻的质量浓度为1.15%KCl冲洗，滤纸吸干，称质量，加2倍肝质量的体积分数为15%甘油-20 mmol/L PBS(磷酸缓冲液，pH 7.4),匀浆，离心10 min(3000 r/min)，取上清液即得肝微粒体(MS)。于术后2、5和8 d再分别取再生肝，用同样的方法制备MS，整个过程均在0～4℃中进行。
, 百拇医药
1.2.2 P450和Cyt.b5含量及苯胺羟化酶活性测定：先用Beckman DU-640紫外可见光分光光度计扫描待测样品(100 μl MS +2 ml PBS)，确定扫描基线(调零)，然后在比色杯加入数毫克Na2S2O4，于400～500 nm 处扫描得到还原型Cyt.b5的吸收光谱曲线，记录430和490 nm处OD值[2，3]。调零，在比色杯通入一氧化碳 (CO) 30 s，于400～500 nm处扫描得到P450的吸收光谱曲线，记录450、420和490 nm处OD值[2，4]。苯胺羟化酶活性按Imai 等方法测定[5]。
1.2.3 PB和RFP对高血氨性肝昏迷的影响：将小鼠随机分为A、B两批。每批各分为空白对照组、PB组(80 mg/kg,腹腔注射)和RFP组(100 mg/kg,灌胃)。空白对照组给予生理盐水。动物每天给药1次，连续8 d。第9天A批各组均腹腔注射2.5% NH4Cl (每次0.005 ml/g),每5 min 1次，观察非肝切除动物中毒症状，记录动物死亡时间和NH4Cl致死用量。B批各组在乙醚麻醉下作大部分肝切除手术，于术后4 h按A批方法和剂量腹腔注射NH4Cl，观察肝切除动物中毒症状，记录动物死亡时间和NH4Cl致死量。
, http://www.100md.com
1.2.4 PB对肝切除暴发性肝衰竭的影响:将小鼠随机分为空白对照和PB组(80 mg/kg,腹腔注射)。动物每天给药1次，连续8 d。于第9天在乙醚麻醉下进行大部分肝切除手术。术后第1天PB剂量改为30 mg/kg，以后每天递增10 mg/kg 直至80 mg/kg，并连续3 d应用青霉素G(20万单位/kg,腹腔注射)以预防细菌感染。观察术后9 d内肝衰竭小鼠的死亡时间，计算小鼠的死亡率和存活期，非死亡小鼠以9 d(216 h)计算死亡时间。
1.2.5 统计方法：用t检验或χ2检验比较组间差异的显著性。P450和Cyt.b5含量用nmol/g liver(肝)及苯胺羟化酶活性用nmol/g liver/min表示。由于每组小鼠肝重有明显差异，故同时用nmol/100 g体质量(b.w.)或nmol/100 g b.w./min，以充分反映肝脏的功能。
2 结 果
, http://www.100md.com
2.1PB和RFP对P450，Cyt.b5和苯胺羟化酶的影响：部分肝切除术后的再生肝P450和Cyt.b5含量明显降低,而苯胺羟化酶活性明显。PB和RFP是很强的肝药酶诱导剂，能显著诱导正常肝脏和再生肝脏的P450。PB组术前(正常肝脏)及术后2，5和8 d的再生肝脏的P450含量(nmol/g liver)分别比空白对照组高121.9%，149.3%，190.1%和68.1%,RFP组比空白对照组分别高40.8%，26.1%，95.7%和24.5%(见表1)。PB对Cyt.b5的诱导作用较弱，以每克肝Cyt.b5含量(nmol/g liver)统计无明显差异。由于PB组肝重增加，按体质量计算Cyt.b5含量(nmol/100 g b.w.)，与对照组比较具有明显差异(P<0.05或P<0.01)，但RFP对Cyt.b5无明显的诱导作用(见表2)。PB对苯胺羟化酶也有明显的诱导作用，使正常肝和部分肝切除术后再生肝苯胺羟化酶活性显著提高，与空白对照组比较有明显差异，RFP对该酶也有一定的诱导作用见表3。
, 百拇医药
表1 PB和RFP对P450含量的影响(
±s) 组别
剂量
(mg/kg)
P450(nmol/g liver)
术前
术后2 d
术后5 d
术后8 d
空白对照
0.053±0.011 (10)
0.024±0.005 (8)
, http://www.100md.com
0.030±0.006 (8)
0.048±0.029(10)
PB
80
0.118±0.016**(10)
0.060±0.014**(8)
0.087±0.015**(7)
0.081±0.013*(7)
RFP
100
, 百拇医药
0.075±0.010**(10)
0.031±0.048* (8)
0.059±0.009**(8)
0.060±0.033 (8)
与空白对照组比较：*P< 0.05；**P< 0.01；括号中的数值为动物数,术前值为切除肝的数值(下同)表2 PB和RFP对Cyt.b5含量的影响(±s) 组别
剂量
(mg/kg)
Cyt.b5(nmol/g liver)
, http://www.100md.com
术前
术后2 d
术后5 d
术后8 d
空白对照
0.128±0.034(10)
0.068±0.031(8)
0.069±0.022(8)
0.106±0.009(10)
PB
80
0.150±0.020(10)
, 百拇医药
0.076±0.024(8)
0.091±0.026(7)
0.108±0.038 (7)
RFP
100
0.142±0.031(10)
0.070±0.010(8)
0.068±0.013(8)
0.081±0.038 (8)
PB、PFP组与空白对照组比较：P>0.05表3 PB和RFP对苯胺羟化酶活性的影响(±s) 组别
, 百拇医药
剂量
(mg/kg)
苯胺羟化酶(nmol/g liver/min)
术前
术后2 d
术后5 d
空白对照
0.351±0.191(8)
0.465±0.268 (8)
0.394±0.244 (7)
PB
80
, 百拇医药
0.615±0.356(7)
1.343±0.569**(8)
0.927±0.416*(7)
RFP
100
0.564±0.381(8)
1.003±0.602 (8)
0.579±0.265 (8)
与空白对照组比较：*P<0.05；**P<0.01
2.2 PB和RFP对肝切除及非肝切除高血氨性肝昏迷的影响：小鼠大部分肝切除后肝功能严重减退或衰竭，连续多次腹腔注射NH4Cl后使血氨显著升高，出现昏迷、惊厥以至死亡。与空白对照组比较，PB和RFP能明显延长小鼠的存活期和提高NH4Cl致死量，尤以RFP作用显著。PB和RFP也明显延长非肝切除小鼠的存活期及提高NH4Cl的致死量，见表4。
, 百拇医药
表4 PB和RFP对肝切除和非肝切除氨性肝昏迷存活期和NH4Cl致死量的影响(±s) 组别
剂量
(mg/kg)
肝切除小鼠
非肝切除小鼠
n
存活期(t/min)
致死量(ml/kg)
n
存活期(t/min)
, 百拇医药
致死量(ml/kg)
空白对照
7
44.6±28.3
29.0±14.2
11
59.5±16.4
69.0±19.2
PB
80
8
60.8±22.5
41.0±12.2
, 百拇医药
10
74.6±11.5*
89.3±10.1**
RFP
100
10
112.9±7.2**
66.2±4.0**
11
73.3±10.3*
89.0±9.2**
, 百拇医药
与空白对照组比较：*P<0.05；**P<0.01;n为动物数
2.3 PB对大部分肝切除暴发性肝衰竭的影响:大部分肝切除可致暴发性肝衰竭，部分动物多在术后3 d内因肝衰竭而死亡。PB有一定程度的降低肝衰竭死亡率和延长动物的存活期，但与空白对照组比较，除术后5 h至9 d的死亡率有显著性差异外，其余时间的死亡率和动物存活期均无明显差异，见表5、表6。
表5 PB对肝切除暴发性肝衰竭死亡率的影响 组别
剂量
(mg/kg)
术后9 d内
术后5 h至9 d内
术后12 h至9 d内
, 百拇医药
实验数
死亡数
死亡率(%)
实验数
死亡数
死亡率(%)
实验数
死亡数
死亡率(%)
空白对照
65
34
52.3
, 百拇医药
61
30
49.2
57
26
45.6
PB
80
61
23
37.7
56
18
, http://www.100md.com 32.1*
53
15
28.3
与空白对照组比较：*P<0.05表6 PB对肝切除肝衰竭存活期的影响(±s)
组别
剂量
(mg/kg)
术后9 d内
术后5 h至9 d内
术后12 h至9 d内
, 百拇医药
n
生存期(t/h)
n
生存期(t/h)
n
生存期(t/h)
空白对照
65
119.1±95.2
61
128.9±92.6
57
135.4±90.4
, 百拇医药
PB
80
61
148.8±96.6
56
160.7±84.1
53
169.4±77.7
与空白对照组比较：P>0.05；非死亡动物以9 d(216 h)计；术后5 h至9 d和12 h至9 d分别是术后5 h前和12 h前死亡的动物不计在内3 讨 论
研究结果表明，PB和RFP对正常肝的P450和苯胺羟化酶均有明显的诱导作用，前者对Cyt.b5也有一定的诱导作用。这两种诱导剂也明显提高大部分肝切除后再生肝的P450和苯胺羟化酶的活性。RFP和PB均能显著提高非肝切除小鼠和大部分肝切除暴发性肝衰竭小鼠外源性高血氨性肝昏迷的存活期和NH4Cl致死量。此外，PB也有一定的降低部分肝切除暴发性肝衰竭死亡率和延长存活期作用。
, 百拇医药
苯巴比妥和利福平是典型的肝药酶诱导剂，通过诱导肝药酶P450、Cyt.b5和NADPH-Cyt.c还原酶等药物代谢酶[6]，提高肝脏的物质代谢功能，可加促外源性物质如药物和内源性物质如NH3的生物转化。苯巴比妥也可诱导肝细胞葡萄糖醛酸转移酶，用于治疗新生儿病理性黄疸，以促进胆红素与葡萄糖醛酸结合和排泄。近年，也有报道用苯巴比妥治疗肝硬化，可提高肝脏的功能，使物质代谢能力和血浆蛋白含量明显提高。由此表明，肝药酶诱导剂通过增加肝代谢酶的含量和活性，从而显著提高物质的生物转化能力和其它肝脏功能。此外，Huang等[6]研究发现PB和RFP除诱导肝药酶外，对肝外组织如小肠粘膜微粒体药物代谢酶也有明显的和类似的诱导作用。经PB和RFP诱导的小鼠，每克小肠组织P450含量高达正常肝P450的13% 和10%，被这两种诱导剂诱导的氨基比林N-脱甲基酶也分别达正常肝的6%和8%。肾组织也有较多的药物代谢酶，每克组织P450含量高达肝组织的18% ，上述诱导剂对肾P450个别亚族也有明显的影响。因而认为，PB一定程度的降低大部分肝切除致爆发性肝衰竭的死亡率和延长存活期主要与诱导肝药酶有关，此外，对肝外组织的药物代谢酶的诱导可能也起重要作用。
, 百拇医药
肝内鸟氨酸循环合成尿素是机体清除氨的主要代谢途径。大部分肝切除后肝脏清除氨的功能严重减退，注射NH4Cl后血氨显著升高，使大量α-酮戊二酸转变为谷氨酸，导致三羧酸循环中α-酮戊二酸耗竭，并消耗大量的ATP和减少ATP生成，因而出现氨性脑病以至死亡[1]。RFP对肝药酶、葡萄糖醛酸转移酶和谷胱甘肽还原酶均有明显的诱导作用，因而推测RFP可能通过增加催化鸟氨酸循环有关的酶如鸟氨酸氨基甲酰转移酶、氨基甲酰磷酸合成酶等的活性而加促血氨的清除，减轻氨中毒，延长肝切除和非肝切除氨中毒小鼠存活期及提高NH4Cl的致死量。PB也有明显作用，也可能通过类似的或相同的机制而发挥药理效应。
PB可诱导P4502E1，加促某些外源性物质如CCl4转化为肝毒性的CCl3[7，8]，引起肝细胞损伤。一般地，只要体内没有需经P4502E1转化为毒性代谢物的外源性物质存在，应用PB不应引起肝损伤加重。而RFP对某些物质如CCl4和醋氨酚肝损伤起显著的保护作用[9]。大剂量和长期应用RFP可导致肝毒性，但在一定的剂量和疗程内，可明显提高肝脏的功能而无明显的肝毒性。
, 百拇医药
因而认为，PB和RFP通过诱导肝药酶或(和)谷胱甘肽还原酶等酶，提高还原型谷胱甘肽的含量，同时，也诱导肝外组织药物代谢酶，从而显著地增强机体的物质代谢和解毒功能。由此提示，临床上肝药酶诱导剂也许能明显地降低肝切除、肝移植、肝硬化和病毒性肝炎等所致的肝衰竭死亡率，值得进一步探讨。
*广西区教育厅科研课题
参 考 文 献
1 梁扩寰主编.肝脏病学.北京：人民卫生出版社，1995.428～449，453～674
2 侯艳宁，胡文羽，李亚伟，等.黄芩甙对小鼠微粒体细胞色素P450的诱导.中国药理学会通讯，1998,15(3):60～62
3 Omura T，Takesue SA.New method for simultaneous purification of cytochrome b5 and NADPH-cytochrome c reductase from rat liver microsomes.J Biochem，1970,67：249～257
, 百拇医药
4 Omura T，Sato R.The carbon monoxide binding pigment of liver microsomes.J Biol Chem,1964，239:2 370～2 385
5 Imai Y，Ito A，Sato R.Evidence for biochemically different types of vesicles in the hepatic microsomal faction.J Biochem，1966，60:417～428
6 Huang R，Okuno H,Takasu M，et al.Comparison of effects of xenobiotics on extrahepatic and hepatic microsomal drug-metabolizing enzymes in mice.Environ Toxicol and Pharmacol，1996，1:123～130
, 百拇医药
7 Recknagel RO.Carbon tetrachloride hepatotoxicity:an example of lethal cleavage.CRC Crit Rew Toxicol，1973,2:263～268
8 Williams AT，Burk RF.Carbon tetrachloride hepatotoxicity:an example of free radical-mediated injury.Seminars Liver Dis，1990,10:279～282
9 Huang R,Okuno H,Takasu M,et al.Protective Effect of Rifampicin against acute liver injury induced by carbon tetrachloride in mice.Jpn J Pharmacol，1995,69:325～334
收稿日期：1999-04-01, 百拇医药
单位：(广西医科大学药理学教研室 南宁 530021)
关键词：苯巴比妥；利福平；暴发性肝衰竭；细胞色素P450；氨性肝昏迷
广西医科大学学报990602 摘要 目的：研究肝微粒体药物代谢酶(肝药酶)诱导剂苯巴比妥(PB)和利福平(RFP)对肝药酶和肝衰竭的影响。方法：观察PB和RFP对肝药酶细胞色素P450(P450)和细胞色素b5(Cyt.b5)的含量、苯胺羟化酶活性、肝切除暴发性肝衰竭死亡率和高血氨性肝昏迷存活期的影响。结果：PB和RFP能明显提高正常肝脏和部分肝切除后再生肝P450含量和苯胺羟化酶活性。在肝切除术后5h至9d内，经PB处置的小鼠暴发性肝衰竭死亡率低于空白对照组，分别为32.1%和49.2%。存活期也明显长于空白对照组，分别为(160.7±84.1)h和(128.9±92.6)h。此外，在肝切除小鼠中，PB和RFP组NH4Cl所致的高血氨性肝昏迷存活期分别为(60.8±22.5)h和(112.9±7.2)h，也明显长于空白对照组的(44.6±28.3)h。结论：PB和RFP能显著地诱导肝药酶，延长高血氨性肝昏迷的存活期，以及有一定的降低肝切除暴发性肝衰竭死亡率作用。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R969.2
EFFECT OF MICROSOMAL DRUG-METABOLIZING ENZYME
INDUCERS ON FULMINANT ILVER FAILURE
Huang Renbin,Banggula,Zang Linquan,et al.
(Department of Pharmacology,Guangxi Medical University,Nanning,530021)
Abstract Objective:To study the effect of hepatic microsomal drug-metabolizing enzyme inducers rifampin (RFP) and phenobarbital (PB) on fulminant liver failure.Methods:The effects of PB and RFP on the contents of microsomal drug-metabolizing enzyme cytochrome P450(P450) and cytochrome b5(Cyt.b5),the activity of aniline hydroxylase,the mortality of fulminant liver failure caused by hepatectomy,and the survival period of ammonemia hepatic coma induced by ammonium chloride were investigated.Results:The content of P450 and the activity of aniline hydroxylase were significantly increased in the normal liver and regenerated liver after partial hepatetomy by the treatment with PB and RFP.The mortality of fulminant liver failure by hepatetomy was 32.1% in mice treated with PB,compared to 49.2% in control within 5h to 9d after the hepatetomy.The survival period was longer in PB group than in control,(160.7±84.1)h and (128.9±92.6)h,respectively.In addition,the survival periods of ammonemia hepatic coma induced by NH4Cl in the groups treated with both PB and RFP were (60.8±22.5)h and (112.9±7.2)h,respectively,which were longer than that in control (44.6±28.3)h following the hepatetomy.Conclusion:PB and RFP could significantly induce microsomal drug-metabolizing enzyme and extend the survival period of ammonemia hepatic coma,and also decrease the mortality of fulminant liver failure by hepatetomy to some extent.
, 百拇医药
Key words phenobarbital;rifampin;fulminant liver failure;cytochrome P450;ammonemia hepatic coma
暴发性肝衰竭系由多种原因如病毒性肝炎和药物中毒等引起的急性大量肝细胞坏死，或肝细胞内细胞器严重功能障碍，致短期内发展至肝性脑病的一种综合症，大部分肝切除、肝移植和肝硬化也可导致暴发性肝衰竭。目前主要强调综合治疗，包括消除致病因素，纠正代谢紊乱、应用肝细胞生长因子以促进肝细胞再生和治疗并发症等，但治疗效果欠理想，死亡率可高达44～48%[1]。为此，我们试图寻找新的治疗方法，本文主要研究肝药酶诱导剂PB和RFP对正常肝脏和大部分肝切除后再生肝脏肝药酶的诱导作用及对部分肝切除暴发性肝衰竭和外源性高血氨性肝昏迷的治疗作用。
1 材料与方法
1.1材料
, 百拇医药
1.1.1 药品：苯巴比妥钠，每支0.1 g，上海中国第八制药厂生产，批号：79110624；利福平，每粒150 mg,上海衡山药业有限公司生产，批号：980501。
1.1.2 试剂：连二亚硫酸钠(Na2S2O4)，广东汕头新宁化工厂出品，批号：920816；辅酶Ⅱ(NADPH)，上海丽珠东风生物技术有限公司出品，批号：3007。
1.1.3 仪器：美国Beckman DU-640紫外可见光分光光度计。
1.1.4 动物：昆明系小鼠，体质量24～30 g，雌雄兼用，由广西医科大学实验动物中心提供。
1.2 方法
1.2.1 动物处理与肝微粒体的制备：将小鼠随机分为空白对照组、PB组(80 mg/kg,腹腔注射)和RFP组(100 mg/kg,灌胃)。空白对照组给予生理盐水。动物每天给药1次，连续8 d。第9天用乙醚麻醉，作大部分肝切除手术(约切除70%)。切除的肝脏用冰冻的质量浓度为1.15%KCl冲洗，滤纸吸干，称质量，加2倍肝质量的体积分数为15%甘油-20 mmol/L PBS(磷酸缓冲液，pH 7.4),匀浆，离心10 min(3000 r/min)，取上清液即得肝微粒体(MS)。于术后2、5和8 d再分别取再生肝，用同样的方法制备MS，整个过程均在0～4℃中进行。
, 百拇医药
1.2.2 P450和Cyt.b5含量及苯胺羟化酶活性测定：先用Beckman DU-640紫外可见光分光光度计扫描待测样品(100 μl MS +2 ml PBS)，确定扫描基线(调零)，然后在比色杯加入数毫克Na2S2O4，于400～500 nm 处扫描得到还原型Cyt.b5的吸收光谱曲线，记录430和490 nm处OD值[2，3]。调零，在比色杯通入一氧化碳 (CO) 30 s，于400～500 nm处扫描得到P450的吸收光谱曲线，记录450、420和490 nm处OD值[2，4]。苯胺羟化酶活性按Imai 等方法测定[5]。
1.2.3 PB和RFP对高血氨性肝昏迷的影响：将小鼠随机分为A、B两批。每批各分为空白对照组、PB组(80 mg/kg,腹腔注射)和RFP组(100 mg/kg,灌胃)。空白对照组给予生理盐水。动物每天给药1次，连续8 d。第9天A批各组均腹腔注射2.5% NH4Cl (每次0.005 ml/g),每5 min 1次，观察非肝切除动物中毒症状，记录动物死亡时间和NH4Cl致死用量。B批各组在乙醚麻醉下作大部分肝切除手术，于术后4 h按A批方法和剂量腹腔注射NH4Cl，观察肝切除动物中毒症状，记录动物死亡时间和NH4Cl致死量。
, http://www.100md.com
1.2.4 PB对肝切除暴发性肝衰竭的影响:将小鼠随机分为空白对照和PB组(80 mg/kg,腹腔注射)。动物每天给药1次，连续8 d。于第9天在乙醚麻醉下进行大部分肝切除手术。术后第1天PB剂量改为30 mg/kg，以后每天递增10 mg/kg 直至80 mg/kg，并连续3 d应用青霉素G(20万单位/kg,腹腔注射)以预防细菌感染。观察术后9 d内肝衰竭小鼠的死亡时间，计算小鼠的死亡率和存活期，非死亡小鼠以9 d(216 h)计算死亡时间。
1.2.5 统计方法：用t检验或χ2检验比较组间差异的显著性。P450和Cyt.b5含量用nmol/g liver(肝)及苯胺羟化酶活性用nmol/g liver/min表示。由于每组小鼠肝重有明显差异，故同时用nmol/100 g体质量(b.w.)或nmol/100 g b.w./min，以充分反映肝脏的功能。
2 结 果
, http://www.100md.com
2.1PB和RFP对P450，Cyt.b5和苯胺羟化酶的影响：部分肝切除术后的再生肝P450和Cyt.b5含量明显降低,而苯胺羟化酶活性明显。PB和RFP是很强的肝药酶诱导剂，能显著诱导正常肝脏和再生肝脏的P450。PB组术前(正常肝脏)及术后2，5和8 d的再生肝脏的P450含量(nmol/g liver)分别比空白对照组高121.9%，149.3%，190.1%和68.1%,RFP组比空白对照组分别高40.8%，26.1%，95.7%和24.5%(见表1)。PB对Cyt.b5的诱导作用较弱，以每克肝Cyt.b5含量(nmol/g liver)统计无明显差异。由于PB组肝重增加，按体质量计算Cyt.b5含量(nmol/100 g b.w.)，与对照组比较具有明显差异(P<0.05或P<0.01)，但RFP对Cyt.b5无明显的诱导作用(见表2)。PB对苯胺羟化酶也有明显的诱导作用，使正常肝和部分肝切除术后再生肝苯胺羟化酶活性显著提高，与空白对照组比较有明显差异，RFP对该酶也有一定的诱导作用见表3。
, 百拇医药
表1 PB和RFP对P450含量的影响(
±s) 组别剂量
(mg/kg)
P450(nmol/g liver)
术前
术后2 d
术后5 d
术后8 d
空白对照
0.053±0.011 (10)
0.024±0.005 (8)
, http://www.100md.com
0.030±0.006 (8)
0.048±0.029(10)
PB
80
0.118±0.016**(10)
0.060±0.014**(8)
0.087±0.015**(7)
0.081±0.013*(7)
RFP
100
, 百拇医药
0.075±0.010**(10)
0.031±0.048* (8)
0.059±0.009**(8)
0.060±0.033 (8)
与空白对照组比较：*P< 0.05；**P< 0.01；括号中的数值为动物数,术前值为切除肝的数值(下同)表2 PB和RFP对Cyt.b5含量的影响(
±s) 组别剂量
(mg/kg)
Cyt.b5(nmol/g liver)
, http://www.100md.com
术前
术后2 d
术后5 d
术后8 d
空白对照
0.128±0.034(10)
0.068±0.031(8)
0.069±0.022(8)
0.106±0.009(10)
PB
80
0.150±0.020(10)
, 百拇医药
0.076±0.024(8)
0.091±0.026(7)
0.108±0.038 (7)
RFP
100
0.142±0.031(10)
0.070±0.010(8)
0.068±0.013(8)
0.081±0.038 (8)
PB、PFP组与空白对照组比较：P>0.05表3 PB和RFP对苯胺羟化酶活性的影响(
±s) 组别, 百拇医药
剂量
(mg/kg)
苯胺羟化酶(nmol/g liver/min)
术前
术后2 d
术后5 d
空白对照
0.351±0.191(8)
0.465±0.268 (8)
0.394±0.244 (7)
PB
80
, 百拇医药
0.615±0.356(7)
1.343±0.569**(8)
0.927±0.416*(7)
RFP
100
0.564±0.381(8)
1.003±0.602 (8)
0.579±0.265 (8)
与空白对照组比较：*P<0.05；**P<0.01
2.2 PB和RFP对肝切除及非肝切除高血氨性肝昏迷的影响：小鼠大部分肝切除后肝功能严重减退或衰竭，连续多次腹腔注射NH4Cl后使血氨显著升高，出现昏迷、惊厥以至死亡。与空白对照组比较，PB和RFP能明显延长小鼠的存活期和提高NH4Cl致死量，尤以RFP作用显著。PB和RFP也明显延长非肝切除小鼠的存活期及提高NH4Cl的致死量，见表4。
, 百拇医药
表4 PB和RFP对肝切除和非肝切除氨性肝昏迷存活期和NH4Cl致死量的影响(
±s) 组别剂量
(mg/kg)
肝切除小鼠
非肝切除小鼠
n
存活期(t/min)
致死量(ml/kg)
n
存活期(t/min)
, 百拇医药
致死量(ml/kg)
空白对照
7
44.6±28.3
29.0±14.2
11
59.5±16.4
69.0±19.2
PB
80
8
60.8±22.5
41.0±12.2
, 百拇医药
10
74.6±11.5*
89.3±10.1**
RFP
100
10
112.9±7.2**
66.2±4.0**
11
73.3±10.3*
89.0±9.2**
, 百拇医药
与空白对照组比较：*P<0.05；**P<0.01;n为动物数
2.3 PB对大部分肝切除暴发性肝衰竭的影响:大部分肝切除可致暴发性肝衰竭，部分动物多在术后3 d内因肝衰竭而死亡。PB有一定程度的降低肝衰竭死亡率和延长动物的存活期，但与空白对照组比较，除术后5 h至9 d的死亡率有显著性差异外，其余时间的死亡率和动物存活期均无明显差异，见表5、表6。
表5 PB对肝切除暴发性肝衰竭死亡率的影响 组别
剂量
(mg/kg)
术后9 d内
术后5 h至9 d内
术后12 h至9 d内
, 百拇医药
实验数
死亡数
死亡率(%)
实验数
死亡数
死亡率(%)
实验数
死亡数
死亡率(%)
空白对照
65
34
52.3
, 百拇医药
61
30
49.2
57
26
45.6
PB
80
61
23
37.7
56
18
, http://www.100md.com 32.1*
53
15
28.3
与空白对照组比较：*P<0.05表6 PB对肝切除肝衰竭存活期的影响(
±s)组别
剂量
(mg/kg)
术后9 d内
术后5 h至9 d内
术后12 h至9 d内
, 百拇医药
n
生存期(t/h)
n
生存期(t/h)
n
生存期(t/h)
空白对照
65
119.1±95.2
61
128.9±92.6
57
135.4±90.4
, 百拇医药
PB
80
61
148.8±96.6
56
160.7±84.1
53
169.4±77.7
与空白对照组比较：P>0.05；非死亡动物以9 d(216 h)计；术后5 h至9 d和12 h至9 d分别是术后5 h前和12 h前死亡的动物不计在内3 讨 论
研究结果表明，PB和RFP对正常肝的P450和苯胺羟化酶均有明显的诱导作用，前者对Cyt.b5也有一定的诱导作用。这两种诱导剂也明显提高大部分肝切除后再生肝的P450和苯胺羟化酶的活性。RFP和PB均能显著提高非肝切除小鼠和大部分肝切除暴发性肝衰竭小鼠外源性高血氨性肝昏迷的存活期和NH4Cl致死量。此外，PB也有一定的降低部分肝切除暴发性肝衰竭死亡率和延长存活期作用。
, 百拇医药
苯巴比妥和利福平是典型的肝药酶诱导剂，通过诱导肝药酶P450、Cyt.b5和NADPH-Cyt.c还原酶等药物代谢酶[6]，提高肝脏的物质代谢功能，可加促外源性物质如药物和内源性物质如NH3的生物转化。苯巴比妥也可诱导肝细胞葡萄糖醛酸转移酶，用于治疗新生儿病理性黄疸，以促进胆红素与葡萄糖醛酸结合和排泄。近年，也有报道用苯巴比妥治疗肝硬化，可提高肝脏的功能，使物质代谢能力和血浆蛋白含量明显提高。由此表明，肝药酶诱导剂通过增加肝代谢酶的含量和活性，从而显著提高物质的生物转化能力和其它肝脏功能。此外，Huang等[6]研究发现PB和RFP除诱导肝药酶外，对肝外组织如小肠粘膜微粒体药物代谢酶也有明显的和类似的诱导作用。经PB和RFP诱导的小鼠，每克小肠组织P450含量高达正常肝P450的13% 和10%，被这两种诱导剂诱导的氨基比林N-脱甲基酶也分别达正常肝的6%和8%。肾组织也有较多的药物代谢酶，每克组织P450含量高达肝组织的18% ，上述诱导剂对肾P450个别亚族也有明显的影响。因而认为，PB一定程度的降低大部分肝切除致爆发性肝衰竭的死亡率和延长存活期主要与诱导肝药酶有关，此外，对肝外组织的药物代谢酶的诱导可能也起重要作用。
, 百拇医药
肝内鸟氨酸循环合成尿素是机体清除氨的主要代谢途径。大部分肝切除后肝脏清除氨的功能严重减退，注射NH4Cl后血氨显著升高，使大量α-酮戊二酸转变为谷氨酸，导致三羧酸循环中α-酮戊二酸耗竭，并消耗大量的ATP和减少ATP生成，因而出现氨性脑病以至死亡[1]。RFP对肝药酶、葡萄糖醛酸转移酶和谷胱甘肽还原酶均有明显的诱导作用，因而推测RFP可能通过增加催化鸟氨酸循环有关的酶如鸟氨酸氨基甲酰转移酶、氨基甲酰磷酸合成酶等的活性而加促血氨的清除，减轻氨中毒，延长肝切除和非肝切除氨中毒小鼠存活期及提高NH4Cl的致死量。PB也有明显作用，也可能通过类似的或相同的机制而发挥药理效应。
PB可诱导P4502E1，加促某些外源性物质如CCl4转化为肝毒性的CCl3[7，8]，引起肝细胞损伤。一般地，只要体内没有需经P4502E1转化为毒性代谢物的外源性物质存在，应用PB不应引起肝损伤加重。而RFP对某些物质如CCl4和醋氨酚肝损伤起显著的保护作用[9]。大剂量和长期应用RFP可导致肝毒性，但在一定的剂量和疗程内，可明显提高肝脏的功能而无明显的肝毒性。
, 百拇医药
因而认为，PB和RFP通过诱导肝药酶或(和)谷胱甘肽还原酶等酶，提高还原型谷胱甘肽的含量，同时，也诱导肝外组织药物代谢酶，从而显著地增强机体的物质代谢和解毒功能。由此提示，临床上肝药酶诱导剂也许能明显地降低肝切除、肝移植、肝硬化和病毒性肝炎等所致的肝衰竭死亡率，值得进一步探讨。
*广西区教育厅科研课题
参 考 文 献
1 梁扩寰主编.肝脏病学.北京：人民卫生出版社，1995.428～449，453～674
2 侯艳宁，胡文羽，李亚伟，等.黄芩甙对小鼠微粒体细胞色素P450的诱导.中国药理学会通讯，1998,15(3):60～62
3 Omura T，Takesue SA.New method for simultaneous purification of cytochrome b5 and NADPH-cytochrome c reductase from rat liver microsomes.J Biochem，1970,67：249～257
, 百拇医药
4 Omura T，Sato R.The carbon monoxide binding pigment of liver microsomes.J Biol Chem,1964，239:2 370～2 385
5 Imai Y，Ito A，Sato R.Evidence for biochemically different types of vesicles in the hepatic microsomal faction.J Biochem，1966，60:417～428
6 Huang R，Okuno H,Takasu M，et al.Comparison of effects of xenobiotics on extrahepatic and hepatic microsomal drug-metabolizing enzymes in mice.Environ Toxicol and Pharmacol，1996，1:123～130
, 百拇医药
7 Recknagel RO.Carbon tetrachloride hepatotoxicity:an example of lethal cleavage.CRC Crit Rew Toxicol，1973,2:263～268
8 Williams AT，Burk RF.Carbon tetrachloride hepatotoxicity:an example of free radical-mediated injury.Seminars Liver Dis，1990,10:279～282
9 Huang R,Okuno H,Takasu M,et al.Protective Effect of Rifampicin against acute liver injury induced by carbon tetrachloride in mice.Jpn J Pharmacol，1995,69:325～334
收稿日期：1999-04-01, 百拇医药