HPLC法测定人血清中丝裂霉素C的浓度
作者：黄振光 钟小斌 吴 闯 韦 艳 陆俊沛
单位：黄振光 钟小斌 吴 闯 (广西医科大学第一附属医院药剂科 南宁 530021); 韦 艳 陆俊沛 桂林医学院药学系实习生
关键词：
广西医科大学学报990656
丝裂霉素C(Mitomycin C，简称MMC)具有高度抗癌活性。临床常通过静脉大剂量给药治疗多种癌症，但有骨髓抑制、胃肠道反应等严重副作用[1]。近年来，为提高MMC局部药物浓度，降低血中浓度，用局部化疗越来越普遍[2，3]。HPLC法测定MMC血清浓度国内报道较少[4，5]，且操作困难。为了研究临床MMC剂量疗效及其副作用与浓度的关系，本文建立了反相HPLC法，用于测定结肠癌、直肠癌病人手术后，腹腔循环灌注不同时间点的血药浓度，方法简单、快速、准确。现报告如下。
, 百拇医药
1 材 料
1.1 仪器：日本岛津公司LC-6A液相色谱仪，SPD-6AV可变紫外检测器及C-R4A色谱数据处理机。
1.2 试药：MMC对照品(中国药品生物制品检定所，含量为99.4%);甲醇(优质纯，北京化工厂);乙酸乙酯(分析纯，北京化工三厂)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件：色谱柱:Shim-pack CLC-ODS柱;流动相:甲醇-水(35∶65，V/V);检测波长:365nm;流速:1 ml/min;柱温:35℃。
2.2 标准溶液制备：精密称取MMC对照品适量，加入甲醇，超声波振溶后，配成浓度为1 g/L标准液，用时稀释成不同浓度。
2.3 样品处理：取血清0.5 ml，加5 ml乙酸乙酯，旋涡器振荡4 min，离心10 min (3000 r/min)，分两次取有机层置尖底离心管中40℃以下N2吹干，提取物用100 μl流动相溶解，取40 μl进样。HPLC色谱图见图1，图2。
, 百拇医药
图1 空白血清图
图2 血清加标准液图
2.4 血清标准曲线：取空白血清0.5 ml，分别加不同量的MMC标准液，使血清浓度分别为5、20、50、100、200、400 μg/L，按样品处理项下操作测定。以MMC峰高(Y)对浓度(X)进行线性回归，得方程:Y=22.95+4.8107X，r=0.9997。最低检测浓度为5 μg/L。
2.5 方法回收率：空白血清中加MMC标准液，按样品处理项下操作测定，见表1。
表1 回收率试验结果(n=3) 加入MMC浓度
(ρB/μg.L-1)
, 百拇医药
测得MMC浓度
(ρB/μg.L-1)
回收率
(%)
20
17.71±0.48
88.55
100
104.92±3.95
104.92
200
201.13±6.88
, 百拇医药
100.07
2.6 精密度：分别在3个血药浓度水平进行日内和日间精密度试验，见表2。表2 分析精密度RSD(%) 浓度(ρB/μg.L-1)
日内(n=5)
日间(n=3)
20
4.91
3.37
100
3.51
2.98
200
, 百拇医药
4.61
3.65
2.7 干扰试验：在上述色谱条件下，考察部分抗癌药及围手术期所用药的干扰情况。安定、氯胺酮、阿托品、氟哌酸、阿霉素、恩丹西酮、足叶乙甙、氟尿嘧啶、MTX、阿糖胞苷、氨苄青霉素、头孢唑啉、头孢噻肟、链霉素、丁胺卡那霉素对MMC出峰均无干扰。
2.8 实际样品测定：应用本方法检测了12例结肠癌、直肠癌病人的MMC血药浓度。取手术后，腹腔循环灌注MMC溶液不同时间的血样共120份，测定结果均在线性范围内，其中达峰时间为60 min，峰平均值为(143.6±102.0)μg/L，说明本方法有良好的生物样品适应性。3 讨 论
HPLC法测定MMC血药浓度虽有文献报道，但提取液多采用氯仿-异丙醇[2，4]，较难吹干，提取杂质多，溶解液浑浊。本法采用乙酸乙酯为提取液，克服了以上缺点，且毒性小。文献报道提取液用高纯N2气[4]，或用普通N2气[6]吹干，本实验用两种气体作比较，测定结果无差异，而普通N2气较经济、易得。
, 百拇医药
MMC用体积分数为95%乙醇溶解并稀释出现双峰，而用甲醇无此现象，其分解可能与乙醇中还原高锰酸钾杂质的量有关。
本实验用甲醇-水为流动相，不用对色谱柱有损害作用的磷酸盐缓冲液[4]，可延长色谱柱寿命，且峰形尖锐对称。
血清中MMC经提取后用体积分数为100%甲醇溶解测定结果偏低，用流动相溶解测定结果较理想。
参 考 文 献
1 陈新谦主编.新编药物学.第13版.北京:人民卫生出版社，1992.444
2 Panteix G，Guillaumont M，Cherpin L，et al.Study of the pharmacokinetics of mitomycin C in humans during intraperitomeal chemohyperthermia with special mention of the concentration in local tissues.Oncology，1993，50:366
, 百拇医药
3 Kuzuya T，Yamauchi M，Ito A，et al.Pharmacokinetic characterisics of 5-fluorouracil and mitomycin C in inrtraperitoneal chemotherapy.J Pharm Pharmacol，1994，46:685
4 徐 峰，胡敏燕，石兴华.HPLC法测定人血清中丝裂霉素C.癌症，1991，10(3)：229
5 杨 煜，柳忠辉，付秀娟，等.高效液相色谱法测定血中丝裂霉素C.药物分析杂志，1996，16(2)：103
6 Dalton JT,Wientjes MG,Badalament RA,et al.Pharmacokinetics of intravesical mitomycin C in superficial bladder cancer patients.Cancer Research,1991,51:5144
收稿日期：1998-09-10, http://www.100md.com
单位：黄振光 钟小斌 吴 闯 (广西医科大学第一附属医院药剂科 南宁 530021); 韦 艳 陆俊沛 桂林医学院药学系实习生
关键词：
广西医科大学学报990656
丝裂霉素C(Mitomycin C，简称MMC)具有高度抗癌活性。临床常通过静脉大剂量给药治疗多种癌症，但有骨髓抑制、胃肠道反应等严重副作用[1]。近年来，为提高MMC局部药物浓度，降低血中浓度，用局部化疗越来越普遍[2，3]。HPLC法测定MMC血清浓度国内报道较少[4，5]，且操作困难。为了研究临床MMC剂量疗效及其副作用与浓度的关系，本文建立了反相HPLC法，用于测定结肠癌、直肠癌病人手术后，腹腔循环灌注不同时间点的血药浓度，方法简单、快速、准确。现报告如下。
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1 材 料
1.1 仪器：日本岛津公司LC-6A液相色谱仪，SPD-6AV可变紫外检测器及C-R4A色谱数据处理机。
1.2 试药：MMC对照品(中国药品生物制品检定所，含量为99.4%);甲醇(优质纯，北京化工厂);乙酸乙酯(分析纯，北京化工三厂)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件：色谱柱:Shim-pack CLC-ODS柱;流动相:甲醇-水(35∶65，V/V);检测波长:365nm;流速:1 ml/min;柱温:35℃。
2.2 标准溶液制备：精密称取MMC对照品适量，加入甲醇，超声波振溶后，配成浓度为1 g/L标准液，用时稀释成不同浓度。
2.3 样品处理：取血清0.5 ml，加5 ml乙酸乙酯，旋涡器振荡4 min，离心10 min (3000 r/min)，分两次取有机层置尖底离心管中40℃以下N2吹干，提取物用100 μl流动相溶解，取40 μl进样。HPLC色谱图见图1，图2。
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图1 空白血清图
图2 血清加标准液图
2.4 血清标准曲线：取空白血清0.5 ml，分别加不同量的MMC标准液，使血清浓度分别为5、20、50、100、200、400 μg/L，按样品处理项下操作测定。以MMC峰高(Y)对浓度(X)进行线性回归，得方程:Y=22.95+4.8107X，r=0.9997。最低检测浓度为5 μg/L。
2.5 方法回收率：空白血清中加MMC标准液，按样品处理项下操作测定，见表1。
表1 回收率试验结果(n=3) 加入MMC浓度
(ρB/μg.L-1)
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测得MMC浓度
(ρB/μg.L-1)
回收率
(%)
20
17.71±0.48
88.55
100
104.92±3.95
104.92
200
201.13±6.88
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100.07
2.6 精密度：分别在3个血药浓度水平进行日内和日间精密度试验，见表2。表2 分析精密度RSD(%) 浓度(ρB/μg.L-1)
日内(n=5)
日间(n=3)
20
4.91
3.37
100
3.51
2.98
200
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4.61
3.65
2.7 干扰试验：在上述色谱条件下，考察部分抗癌药及围手术期所用药的干扰情况。安定、氯胺酮、阿托品、氟哌酸、阿霉素、恩丹西酮、足叶乙甙、氟尿嘧啶、MTX、阿糖胞苷、氨苄青霉素、头孢唑啉、头孢噻肟、链霉素、丁胺卡那霉素对MMC出峰均无干扰。
2.8 实际样品测定：应用本方法检测了12例结肠癌、直肠癌病人的MMC血药浓度。取手术后，腹腔循环灌注MMC溶液不同时间的血样共120份，测定结果均在线性范围内，其中达峰时间为60 min，峰平均值为(143.6±102.0)μg/L，说明本方法有良好的生物样品适应性。3 讨 论
HPLC法测定MMC血药浓度虽有文献报道，但提取液多采用氯仿-异丙醇[2，4]，较难吹干，提取杂质多，溶解液浑浊。本法采用乙酸乙酯为提取液，克服了以上缺点，且毒性小。文献报道提取液用高纯N2气[4]，或用普通N2气[6]吹干，本实验用两种气体作比较，测定结果无差异，而普通N2气较经济、易得。
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MMC用体积分数为95%乙醇溶解并稀释出现双峰，而用甲醇无此现象，其分解可能与乙醇中还原高锰酸钾杂质的量有关。
本实验用甲醇-水为流动相，不用对色谱柱有损害作用的磷酸盐缓冲液[4]，可延长色谱柱寿命，且峰形尖锐对称。
血清中MMC经提取后用体积分数为100%甲醇溶解测定结果偏低，用流动相溶解测定结果较理想。
参 考 文 献
1 陈新谦主编.新编药物学.第13版.北京:人民卫生出版社，1992.444
2 Panteix G，Guillaumont M，Cherpin L，et al.Study of the pharmacokinetics of mitomycin C in humans during intraperitomeal chemohyperthermia with special mention of the concentration in local tissues.Oncology，1993，50:366
, 百拇医药
3 Kuzuya T，Yamauchi M，Ito A，et al.Pharmacokinetic characterisics of 5-fluorouracil and mitomycin C in inrtraperitoneal chemotherapy.J Pharm Pharmacol，1994，46:685
4 徐 峰，胡敏燕，石兴华.HPLC法测定人血清中丝裂霉素C.癌症，1991，10(3)：229
5 杨 煜，柳忠辉，付秀娟，等.高效液相色谱法测定血中丝裂霉素C.药物分析杂志，1996，16(2)：103
6 Dalton JT,Wientjes MG,Badalament RA,et al.Pharmacokinetics of intravesical mitomycin C in superficial bladder cancer patients.Cancer Research,1991,51:5144
收稿日期：1998-09-10, http://www.100md.com