八氯二丙醚对DNA交联作用的研究
作者：谈伟君 王心如 徐锡坤
单位：谈伟君 南京铁道医学院公共卫生学院 (南京 210009)；王心如 徐锡坤 南京医科大学公共卫生学院 (南京 210029)
关键词：八氯二丙醚；DNA交联；遗传毒性
铁道医学990612 【摘要】 目的 观察八氯二丙醚对DNA的直接损伤作用。方法 采用溴化乙锭荧光法测定其对小牛胸腺DNA双链间交联的形成作用。结果 每30 μg小牛胸腺DNA用200～800 μg的八氯二丙醚直接染毒，在37 ℃ 30 min时具有交联生成作用，并且具有剂量反应关系(r=0.991 1,P<0.01)。在受试剂量范围内，八氯二丙醚的DNA交联作用增加了4.27倍。结论 DNA交联作用可能是八氯二丙醚遗传毒性的一种形式。
八氯二丙醚(简称S2)是拟除虫菊酯及氨基甲酸酯类农药的优良增效剂[1]，由于其增效范围广，效果显著，毒性小而生产。它能减少主药用量，降低生产成本，因此在农药和蚊香中得到广泛使用。有研究表明：八氯二丙醚的Ames试验中TA100菌株加S9活化系统时，每皿50 μg和500 μg两个浓度的回变菌落数超过了阴性对照组的2倍，但无剂量反应关系，且含八氯二丙醚无烟蚊香的Ames试验出现了阳性结果[2]；其蚊香烟雾在一定浓度时对小鼠肺和睾丸细胞的DNA合成有一定影响[3]；小鼠骨髓细胞微核试验及精子畸形试验则为阴性结果。为了进一步观察八氯二丙醚的遗传毒性作用，我们采用溴化乙锭荧光法研究了S2对小牛胸腺DNA交联作用，现将结果报告如下。
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1 材料与方法
1.1 材料
八氯二丙醚：分子量377，比重1.62，纯度92.43%，由无锡嵩山助剂厂提供。小牛胸腺DNA：用Tris-EDTA缓冲液(10mM Tris,1mM EDTA,pH=8.0)配成3mg.ml-1，4 ℃保存。溴化乙锭：用EB缓冲液配成1 μg.ml-1溶液，pH＝12.0,临用前配制。
1.2 方法
八氯二丙醚剂量设置：称取八氯二丙醚用丙酮配制。设20、30、40、50、60、70、80 mg.ml-17个剂量组(相当于每30 μg DNA接触200、300、400、500、600、700、800 μg八氯二丙醚)；设对照组用丙酮。染毒方法：于洁净试管中分别加入10 μl小牛胸腺DNA，然后加入不同浓度的八氯二丙醚各10 μl，对照组加入丙酮10 μl。混匀后置37 ℃孵育30 min。DNA交联测定方法[4]：采用溴化乙锭荧光法。在染毒后的小牛胸腺DNA中加入2 ml溴化乙锭溶液，混匀后用930荧光光度计测定其相对荧光强度(激发波长530 nm；发射波长600 nm)，放置100 ℃水浴中8 min，室温下冷却10 min，以相同条件分别测定其相对荧光强度，按下列公式计算DNA交联率[5]：
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Ct=(Ft-Fn)/(1-Fn)×100%
式中： Ct: DNA交联率；
Ft: 实验组加热前后相对荧光强度比值；
Fn: 对照组加热前后相对荧光强度比值。
2 结 果
2.1 八氯二丙醚对小牛胸腺DNA交联生成作用结果
见表1。
表1 八氯二丙醚对小牛胸腺DNA的交联生成 八氯二丙醚/μg
(每30 μg DNA)
DNA交联率/%
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(
±s)
200
7.567±1.673
300
10.543±4.247
400
14.783±4.927
500
22.248 ±6.782
600
24.426 ±6.547
, 百拇医药
700
30.618 ±6.702
800
32.331 ±6.642
由表1可见，八氯二丙醚对小牛胸腺DNA具有交联生成作用，当染毒浓度为200 μg每30 μg DNA时，DNA交联率就增加了7.567%，当染毒浓度达到800 μg每30μg DNA时，DNA交联率增加了32.331%。
2.2 八氯二丙醚对小牛胸腺DNA交联形成的相关分析
经过相关回归分析，可以得到回归方程为：Y=0.044 3 x-1.798 6(r=0.991 1,P<0.01)。
3 讨 论
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遗传毒作用主要是由DNA的损伤引起。DNA损伤有断裂、交联和加合物形成等。DNA交联作用是外来化合物对DNA产生的一种损伤。由于DNA交联产生，使得DNA不能进行复制，严重时可造成细胞死亡，因此，DNA交联是具有重要价值的遗传毒性的分子生物标志[6]。我们采用溴化乙锭荧光法测定八氯二丙醚对DNA交联作用的影响，结果表明，随着八氯二丙醚浓度的增加(从每30 μg DNA接触200～800 μg八氯二丙醚),DNA交联率也随之增加，经相关回归分析发现：DNA交联率与八氯二丙醚浓度之间存在着剂量反应关系。提示八氯二丙醚在一定浓度时可以导致DNA交联率的增加。
采用溴化乙锭荧光法测定DNA交联率，快速、简便、无需同位素标记，对双链间DNA交联的测定有较高的特异性。其原理为：溴化乙锭与双链DNA结合所产生的荧光强度较单链DNA高20～30倍。将DNA水浴变性后，可明显降低荧光强度。但交联DNA由于双链DNA不能解链可使荧光强度增强。根据DNA变性前后的相对荧光强度比值，可以计算出DNA交联率。使用该法对EB缓冲液的pH值要求十分严格。根据文献报道，在正式试验前，我们将EB缓冲液的pH值设置成一个系列，从中找出纯品DNA水浴后前荧光强度比值最小的EB 缓冲液pH值，作为正式试验的EB缓冲液pH值。从研究结果看，该pH值与文献报道一致，也符合试验的预期要求。
, 百拇医药
本次试验所采用的八氯二丙醚浓度为每30 μg小牛胸腺DNA为200～800 μg，结果虽表明在该试验条件下，对DNA交联率有明显影响，但在实际生产和生活中，八氯二丙醚往往难以达到这样的浓度，更何况本次试验采用体外染毒法(八氯二丙醚与DNA直接接触30 min)，这与人体实际接触八氯二丙醚情况有差异，也缺乏代谢活化系统。为此，我们建议，进行体内试验，以观察八氯二丙醚对机体DNA损伤的实际情况，并采用其它敏感指标对八氯二丙醚使DNA损伤的可能性作进一步的研究。鉴于本试验结果提示八氯二丙醚对DNA交联率有影响，因此，对八氯二丙醚的生产和使用人员应该进行跟踪调查。
参考文献
1 陈学文.八氯二丙醚的使用. 蚊香通讯，1990,6(2)：9
2 唐萌，林大榕，谈伟君，等.八氯二丙醚及其蚊香烟雾的毒理学研究. 中国媒介生物学及控制杂志，1992,3(5)：263
, http://www.100md.com
3 谈伟君，唐萌，虞秀珍，等.八氯二丙醚的致突变性和致畸性研究. 环境与健康杂志，1997,14(3):107
4 Y Pu. Appearance of IL-la relates DAN inteestrand cross-links and cytotoxicity in cultured human keratinocytes exposed to sulfur mustard. J Appli Toxicol，1995，15(6):477
5 Dejong S. Zulstra JG. Timmer-Bosscha H,et al. Detection of DNA cross-link in tumor cells with the ethidium bromide fluorescence assay. Int J Cancer,1986,37:557
6 Morgan AR, Pulleyblank DE. Native and denatured DNA cross-linked and circular covalently-closed DNA analysed by a sensitive fluornmetric procedure. Biochem Biophys Res,1974，61:396
收稿：1999-06-30 修回：1999-09-01, http://www.100md.com
单位：谈伟君 南京铁道医学院公共卫生学院 (南京 210009)；王心如 徐锡坤 南京医科大学公共卫生学院 (南京 210029)
关键词：八氯二丙醚；DNA交联；遗传毒性
铁道医学990612 【摘要】 目的 观察八氯二丙醚对DNA的直接损伤作用。方法 采用溴化乙锭荧光法测定其对小牛胸腺DNA双链间交联的形成作用。结果 每30 μg小牛胸腺DNA用200～800 μg的八氯二丙醚直接染毒，在37 ℃ 30 min时具有交联生成作用，并且具有剂量反应关系(r=0.991 1,P<0.01)。在受试剂量范围内，八氯二丙醚的DNA交联作用增加了4.27倍。结论 DNA交联作用可能是八氯二丙醚遗传毒性的一种形式。
八氯二丙醚(简称S2)是拟除虫菊酯及氨基甲酸酯类农药的优良增效剂[1]，由于其增效范围广，效果显著，毒性小而生产。它能减少主药用量，降低生产成本，因此在农药和蚊香中得到广泛使用。有研究表明：八氯二丙醚的Ames试验中TA100菌株加S9活化系统时，每皿50 μg和500 μg两个浓度的回变菌落数超过了阴性对照组的2倍，但无剂量反应关系，且含八氯二丙醚无烟蚊香的Ames试验出现了阳性结果[2]；其蚊香烟雾在一定浓度时对小鼠肺和睾丸细胞的DNA合成有一定影响[3]；小鼠骨髓细胞微核试验及精子畸形试验则为阴性结果。为了进一步观察八氯二丙醚的遗传毒性作用，我们采用溴化乙锭荧光法研究了S2对小牛胸腺DNA交联作用，现将结果报告如下。
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1 材料与方法
1.1 材料
八氯二丙醚：分子量377，比重1.62，纯度92.43%，由无锡嵩山助剂厂提供。小牛胸腺DNA：用Tris-EDTA缓冲液(10mM Tris,1mM EDTA,pH=8.0)配成3mg.ml-1，4 ℃保存。溴化乙锭：用EB缓冲液配成1 μg.ml-1溶液，pH＝12.0,临用前配制。
1.2 方法
八氯二丙醚剂量设置：称取八氯二丙醚用丙酮配制。设20、30、40、50、60、70、80 mg.ml-17个剂量组(相当于每30 μg DNA接触200、300、400、500、600、700、800 μg八氯二丙醚)；设对照组用丙酮。染毒方法：于洁净试管中分别加入10 μl小牛胸腺DNA，然后加入不同浓度的八氯二丙醚各10 μl，对照组加入丙酮10 μl。混匀后置37 ℃孵育30 min。DNA交联测定方法[4]：采用溴化乙锭荧光法。在染毒后的小牛胸腺DNA中加入2 ml溴化乙锭溶液，混匀后用930荧光光度计测定其相对荧光强度(激发波长530 nm；发射波长600 nm)，放置100 ℃水浴中8 min，室温下冷却10 min，以相同条件分别测定其相对荧光强度，按下列公式计算DNA交联率[5]：
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Ct=(Ft-Fn)/(1-Fn)×100%
式中： Ct: DNA交联率；
Ft: 实验组加热前后相对荧光强度比值；
Fn: 对照组加热前后相对荧光强度比值。
2 结 果
2.1 八氯二丙醚对小牛胸腺DNA交联生成作用结果
见表1。
表1 八氯二丙醚对小牛胸腺DNA的交联生成 八氯二丙醚/μg
(每30 μg DNA)
DNA交联率/%
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(
±s)200
7.567±1.673
300
10.543±4.247
400
14.783±4.927
500
22.248 ±6.782
600
24.426 ±6.547
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700
30.618 ±6.702
800
32.331 ±6.642
由表1可见，八氯二丙醚对小牛胸腺DNA具有交联生成作用，当染毒浓度为200 μg每30 μg DNA时，DNA交联率就增加了7.567%，当染毒浓度达到800 μg每30μg DNA时，DNA交联率增加了32.331%。
2.2 八氯二丙醚对小牛胸腺DNA交联形成的相关分析
经过相关回归分析，可以得到回归方程为：Y=0.044 3 x-1.798 6(r=0.991 1,P<0.01)。
3 讨 论
, http://www.100md.com
遗传毒作用主要是由DNA的损伤引起。DNA损伤有断裂、交联和加合物形成等。DNA交联作用是外来化合物对DNA产生的一种损伤。由于DNA交联产生，使得DNA不能进行复制，严重时可造成细胞死亡，因此，DNA交联是具有重要价值的遗传毒性的分子生物标志[6]。我们采用溴化乙锭荧光法测定八氯二丙醚对DNA交联作用的影响，结果表明，随着八氯二丙醚浓度的增加(从每30 μg DNA接触200～800 μg八氯二丙醚),DNA交联率也随之增加，经相关回归分析发现：DNA交联率与八氯二丙醚浓度之间存在着剂量反应关系。提示八氯二丙醚在一定浓度时可以导致DNA交联率的增加。
采用溴化乙锭荧光法测定DNA交联率，快速、简便、无需同位素标记，对双链间DNA交联的测定有较高的特异性。其原理为：溴化乙锭与双链DNA结合所产生的荧光强度较单链DNA高20～30倍。将DNA水浴变性后，可明显降低荧光强度。但交联DNA由于双链DNA不能解链可使荧光强度增强。根据DNA变性前后的相对荧光强度比值，可以计算出DNA交联率。使用该法对EB缓冲液的pH值要求十分严格。根据文献报道，在正式试验前，我们将EB缓冲液的pH值设置成一个系列，从中找出纯品DNA水浴后前荧光强度比值最小的EB 缓冲液pH值，作为正式试验的EB缓冲液pH值。从研究结果看，该pH值与文献报道一致，也符合试验的预期要求。
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本次试验所采用的八氯二丙醚浓度为每30 μg小牛胸腺DNA为200～800 μg，结果虽表明在该试验条件下，对DNA交联率有明显影响，但在实际生产和生活中，八氯二丙醚往往难以达到这样的浓度，更何况本次试验采用体外染毒法(八氯二丙醚与DNA直接接触30 min)，这与人体实际接触八氯二丙醚情况有差异，也缺乏代谢活化系统。为此，我们建议，进行体内试验，以观察八氯二丙醚对机体DNA损伤的实际情况，并采用其它敏感指标对八氯二丙醚使DNA损伤的可能性作进一步的研究。鉴于本试验结果提示八氯二丙醚对DNA交联率有影响，因此，对八氯二丙醚的生产和使用人员应该进行跟踪调查。
参考文献
1 陈学文.八氯二丙醚的使用. 蚊香通讯，1990,6(2)：9
2 唐萌，林大榕，谈伟君，等.八氯二丙醚及其蚊香烟雾的毒理学研究. 中国媒介生物学及控制杂志，1992,3(5)：263
, http://www.100md.com
3 谈伟君，唐萌，虞秀珍，等.八氯二丙醚的致突变性和致畸性研究. 环境与健康杂志，1997,14(3):107
4 Y Pu. Appearance of IL-la relates DAN inteestrand cross-links and cytotoxicity in cultured human keratinocytes exposed to sulfur mustard. J Appli Toxicol，1995，15(6):477
5 Dejong S. Zulstra JG. Timmer-Bosscha H,et al. Detection of DNA cross-link in tumor cells with the ethidium bromide fluorescence assay. Int J Cancer,1986,37:557
6 Morgan AR, Pulleyblank DE. Native and denatured DNA cross-linked and circular covalently-closed DNA analysed by a sensitive fluornmetric procedure. Biochem Biophys Res,1974，61:396
收稿：1999-06-30 修回：1999-09-01, http://www.100md.com