糖基化终产物—牛血清白蛋白的制备和纯化
作者：孙子林 刘乃丰 弓玉祥 童嘉毅 王伯荣
单位：南京铁道医学院附属医院 (南京 210009)
关键词：糖基化终产物；纯化；凝胶层析
铁道医学990603 【摘要】 目的 制备高纯度的糖基化终产物(AGEs)用作免疫原或检测标准品。方法 牛血清白蛋白(BSA)与葡萄糖在体外共同孵育制备AGEs-BSA，经凝胶层析纯化后，应用荧光光谱和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。结果 纯化后AGEs-BSA与标准的AGEs-BSA电泳图谱基本一致；激发和发射光谱均为单峰，分别位于360 nm和446 nm。结论 应用凝胶层析纯化AGEs-BSA效果满意。
Preperation and purification of AGEs-BSA
Sun Zilin, Liu Naifeng, Gong Yuxiang, et al.
, 百拇医药
The Affiliated Hospital, Nanjing Railway Medical College, Nanjing 210009
【Abstract】 Objective To prepare high purity advanced glycation end products serving as immunogen or standard product.Methods AGEs-BSA was obtained by incubation of BSA with glucose, then purified by gel filtration chromatography and identified by SDS-PAGE and fluorescence spectra.Results The AGEs-BSA purified by us has almost the same picture as standard AGEs-BSA which was purified by perfusion chromatography and the monopeak of the excitation and emission spectra. The peak of the excitation and emission spectra was located at 360 nm and 446 nm respectively.Conclusion The purity of AGEs-BSA purified by gel filtration chromatography was satisfactory.
, 百拇医药
【Key words】 advanced glycation end products purification gel filtration chromatography
Railway Medical Journal,1999,27:361～363
糖基化终产物(advanced glycation end products, AGEs)是还原糖(如葡萄糖)与蛋白质、氨基酸等的游离氨基端通过一系列复杂的非酶促反应形成的结构多样的不可逆聚合物[1]，它们在糖尿病慢性并发症发生发展中的作用正越来越引起广泛关注[2]。获取高纯度的AGEs对于研究AGEs在体内体外的致病效应、制备特异的抗AGEs抗体、建立有关的AGEs检测方法等十分重要。作者应用牛血清白蛋白(BSA)与葡萄糖在体外共同孵育并加以纯化，制备AGEs-BSA，取得了满意的效果，介绍如下。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料
试剂：BSA(B M产品)，Sephadex-G 200(Pharmacia产品)，丙烯酰胺(Acr)、中分子量标准品为Promega产品，甲叉双丙烯酰胺(Bis，Fluka产品)，AGEs-BSA标准品由德国乌尔姆大学临床化学研究所提供，D-葡萄糖等其它试剂均为国产分析纯。
仪器及器材：752C型紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂)，650-60型荧光分光光度计(日本日立公司)，DF-C恒流恒压电泳仪(北京东方仪器厂)，BSZ-100自动部分收集器、蠕动泵(上海沪西分析仪器厂)。
1.2 方法
AGEs-BSA的制备：将BSA 20 g.L-1与500 mmol.L-1葡萄糖溶于pH 7.4、0.2 mol.L-1磷酸盐缓冲液(PBS)中，混匀、室温过夜放置，0.2μm 针头滤器过滤灭菌封口后置37℃避光孵育90d取出。
, 百拇医药
AGEs-BSA的纯化(凝胶层析)：称取Sephadex-G 200 3.0 g加入蒸馏水中煮沸8 h，用pH 7.4、0.02 mol.L-1PBS平衡10倍体积以上后装柱，连接蠕动泵和部分收集器，平衡过夜备用。次日取AGEs-BSA 4 ml缓慢加入柱床顶部。用pH 7.4、0.02 mol.L-1PBS洗脱，流速每20 min 3 ml。每管3 ml，收集35管。分别测定紫外280 nm吸光度和AGEs荧光值，收集第一峰浓缩，蛋白定量后过滤灭菌，冷冻保存于-20 ℃备用，少许样品稀释后电泳和荧光光谱扫描。
AGEs荧光测定及荧光光谱扫描：在日立650-60荧光分光光度计上测定荧光值 (pH 7.4、0.02 mol.L-1PBS用于调零，激发波长370 nm，狭缝3 nm，发射波长440 nm，狭缝3 nm)及荧光光谱扫描(设定激发波长370 nm扫描发射光谱；设定发射波长440 nm扫描激发光谱)。
, 百拇医药
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：制胶板固定、垂直放置，4周用1.5%琼脂封口。小心加入7.5%分离胶(30% Acryl / 0.8% Bis 7.2 ml，10% SDS 0.56 ml，pH 8.8、2 mol.L-1 Tris-HCl 7.0 ml，ddH2O 12.7 ml，TEMED 45 μl，2% 过硫酸铵 0.66 ml)。待凝胶聚合后，插入样品梳，加浓缩胶(30% Acryl / 0.8% Bis 1.0 ml，10% SDS 0.1 ml，pH 6.8、0.5 mol.L-1 Tris-HCl 2.5 ml，ddH2O 6.2 ml，TEMED 20 μl，2% 过硫酸铵 0.24 ml)。室温下30 min浓缩胶聚合，胶板固定于电泳槽，轻轻拔出样品梳，加样于样品槽，每槽20 μl，样品用pH 6.8、0.125 mol.L-1 Tris-HCl缓冲液充分透析后，以样品缓冲液(10%SDS 4 ml，pH 6.8、0.5 mol.L-1 Tris-HCl 2 ml,ddH2O 0.5 ml,甘油2 ml,0.1 %溴酚蓝0.5 ml，巯基乙醇1.0 ml)。稀释为1 g.L-1后沸水浴3 min。随之加入电极缓冲液 (pH 8.3、0.05 mol.L-1 Tris-甘氨酸，0.1% SDS)，接上电极开始电泳，约6 h完毕，游离凝胶后固定、染色、脱色、晾干拍照。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 洗脱曲线
Sephadex-G 200纯化AGEs-BSA的洗脱曲线呈双峰，第1峰荧光值和紫外280 nm OD值均显著高于第2峰，相对荧光值(FI/OD 280 nm)在初期即达顶峰，以后逐步下降(图1)。
2.2 荧光光谱
荧光光谱扫描显示未纯化AGEs-BSA激发光谱有两个峰(292 nm和360 nm)，发射光谱峰在446 nm；纯化的AGEs-BSA只有360 nm激发峰，发射峰同前(图2)。
2.3 电泳图谱
, 百拇医药
纯化的AGEs-BSA (FP)，经SDS-PAGE显示两条带，与标准AGEs-BSA (P-AGEs)电泳图谱一致。第1条带极淡，第2条带深而弥散，呈涂片状，在样品胶顶部染色最深，部分样品拒绝进入凝胶。与分子量标准 (PS)比较示第2条带分子量大于97.4 Kd。洗脱曲线第2峰 (SP)样品呈现1条带，与纯化AGEs-BSA第1条带电泳位置相近，分子量相当于单体BSA (图3)。
3 讨 论
近年来，有关AGEs致病作用的研究报道甚多。目前认为AGEs与糖尿病和尿毒症血管病变、老化、阿尔采末病等密切相关。有效检测血清或组织中AGEs水平对于进一步从整体水平研究AGEs与糖尿病并发症及其他疾病发生之间的关系具有非常重要的临床意义。为此，作者通过AGEs抗体制备建立了血清AGEs的免疫学检测方法[3]。为了保证抗体的特异性，作者将体外孵育制备的AGEs-BSA经过凝胶层析纯化后用作免疫原。
, 百拇医药
凝胶层析洗脱曲线显示蛋白 (OD 280 nm) 和AGEs荧光值 (FI) 均呈双峰，第1峰荧光值远高于第2峰，相对荧光值 (FI/OD 280 nm) 在初期即达顶峰，以后逐步下降，与Wu等[4]结果一致。提示AGEs-BSA分子大小是多种多样的，分子量越大，则相对荧光值越高。
荧光光谱扫描显示未纯化的AGEs-BSA激发光谱呈双峰，峰位分别为292 nm和360 nm，高峰在360 nm，发射峰在446 nm；纯化后的AGEs只有360 nm激发峰和446 nm发射峰，说明激发波长360 nm，发射波长446 nm是AGEs所特有的，与文献报道基本一致[5，6]。
纯化的AGEs-BSA在SDS-PAGE上呈涂片状，顶部有较深色带拒绝进入凝胶。进一步提示蛋白质糖基化后可形成各种各样大小不同的AGEs，分子量在97.4 Kd以上，最大可超过1000 Kd[4]。
, 百拇医药
运用凝胶过滤法纯化的AGEs-BSA，经SDS-PAGE显示2条带，除了位于凝胶顶部的深而弥散、呈涂片状的1条主带外，在相当于单体BSA位置有1条极淡的次带，与洗脱曲线第2峰蛋白带位置一致，说明纯化效果尚不完美。但其与标准的AGEs-BSA(系用含新型色谱材料的灌注凝胶法纯化)电泳图谱基本一致，荧光光谱显示最大激发波长360 nm，最大发射波长446 nm，符合AGEs特征，与纯化前荧光光谱比较，激发292 nm峰消失，说明纯化效果尚属满意。运用该AGEs-BSA免疫新西兰白兔获得的多克隆抗AGEs抗体特异性比较理想，其与体内外形成的各种AGEs拥有共同的抗原决定簇，以该抗体建立的ELISA系统可用于糖尿病人体内AGEs水平检测[3]。以高度特异的单克隆抗AGEs抗体作为配基进行亲合层析可望获取完全纯化的AGEs。
参考文献
1 Brownlee M.Advanced protein glycosylation in diabetes and aging.Annu Red Med,1995,46:223
, 百拇医药
2 Brownlee M.Lilly lecture 1993:Glycation and diabetic complications.Diabetes,1994, 43:836
3 孙子林，刘乃丰，刘必成，等.糖基化终产物抗血清的制备及应用.中华医学检验杂志，1999, 22(1):38
4 Wu JT, Tu MC, Zhung P. Advanced glycation end products (AGE): Characterization of the products from the reaction between D-glucose and serum albumin. J Clin Lab Anal,1996,10:21
5 WrÓbel K,WrÓbel K,Garay-Sevilla ME,et al.Novel analytical approach to monitoring advanced glycation end products in human serum with on-line spectrophotometric and spectrofluorometric detection in a flow system. Clin Chem,1997,43:1563
6 MÜnch G,Keis R,Weβels A,et al.Determination of advanced glycation end products in serum by fluorescence spectroscopy and competitive ELISA. Eur J Clin Chem Clin Biochem, 1997,35(9):669
收稿：1999-06-30 修回：1999-09-02, http://www.100md.com
单位：南京铁道医学院附属医院 (南京 210009)
关键词：糖基化终产物；纯化；凝胶层析
铁道医学990603 【摘要】 目的 制备高纯度的糖基化终产物(AGEs)用作免疫原或检测标准品。方法 牛血清白蛋白(BSA)与葡萄糖在体外共同孵育制备AGEs-BSA，经凝胶层析纯化后，应用荧光光谱和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。结果 纯化后AGEs-BSA与标准的AGEs-BSA电泳图谱基本一致；激发和发射光谱均为单峰，分别位于360 nm和446 nm。结论 应用凝胶层析纯化AGEs-BSA效果满意。
Preperation and purification of AGEs-BSA
Sun Zilin, Liu Naifeng, Gong Yuxiang, et al.
, 百拇医药
The Affiliated Hospital, Nanjing Railway Medical College, Nanjing 210009
【Abstract】 Objective To prepare high purity advanced glycation end products serving as immunogen or standard product.Methods AGEs-BSA was obtained by incubation of BSA with glucose, then purified by gel filtration chromatography and identified by SDS-PAGE and fluorescence spectra.Results The AGEs-BSA purified by us has almost the same picture as standard AGEs-BSA which was purified by perfusion chromatography and the monopeak of the excitation and emission spectra. The peak of the excitation and emission spectra was located at 360 nm and 446 nm respectively.Conclusion The purity of AGEs-BSA purified by gel filtration chromatography was satisfactory.
, 百拇医药
【Key words】 advanced glycation end products purification gel filtration chromatography
Railway Medical Journal,1999,27:361～363
糖基化终产物(advanced glycation end products, AGEs)是还原糖(如葡萄糖)与蛋白质、氨基酸等的游离氨基端通过一系列复杂的非酶促反应形成的结构多样的不可逆聚合物[1]，它们在糖尿病慢性并发症发生发展中的作用正越来越引起广泛关注[2]。获取高纯度的AGEs对于研究AGEs在体内体外的致病效应、制备特异的抗AGEs抗体、建立有关的AGEs检测方法等十分重要。作者应用牛血清白蛋白(BSA)与葡萄糖在体外共同孵育并加以纯化，制备AGEs-BSA，取得了满意的效果，介绍如下。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料
试剂：BSA(B M产品)，Sephadex-G 200(Pharmacia产品)，丙烯酰胺(Acr)、中分子量标准品为Promega产品，甲叉双丙烯酰胺(Bis，Fluka产品)，AGEs-BSA标准品由德国乌尔姆大学临床化学研究所提供，D-葡萄糖等其它试剂均为国产分析纯。
仪器及器材：752C型紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂)，650-60型荧光分光光度计(日本日立公司)，DF-C恒流恒压电泳仪(北京东方仪器厂)，BSZ-100自动部分收集器、蠕动泵(上海沪西分析仪器厂)。
1.2 方法
AGEs-BSA的制备：将BSA 20 g.L-1与500 mmol.L-1葡萄糖溶于pH 7.4、0.2 mol.L-1磷酸盐缓冲液(PBS)中，混匀、室温过夜放置，0.2μm 针头滤器过滤灭菌封口后置37℃避光孵育90d取出。
, 百拇医药
AGEs-BSA的纯化(凝胶层析)：称取Sephadex-G 200 3.0 g加入蒸馏水中煮沸8 h，用pH 7.4、0.02 mol.L-1PBS平衡10倍体积以上后装柱，连接蠕动泵和部分收集器，平衡过夜备用。次日取AGEs-BSA 4 ml缓慢加入柱床顶部。用pH 7.4、0.02 mol.L-1PBS洗脱，流速每20 min 3 ml。每管3 ml，收集35管。分别测定紫外280 nm吸光度和AGEs荧光值，收集第一峰浓缩，蛋白定量后过滤灭菌，冷冻保存于-20 ℃备用，少许样品稀释后电泳和荧光光谱扫描。
AGEs荧光测定及荧光光谱扫描：在日立650-60荧光分光光度计上测定荧光值 (pH 7.4、0.02 mol.L-1PBS用于调零，激发波长370 nm，狭缝3 nm，发射波长440 nm，狭缝3 nm)及荧光光谱扫描(设定激发波长370 nm扫描发射光谱；设定发射波长440 nm扫描激发光谱)。
, 百拇医药
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：制胶板固定、垂直放置，4周用1.5%琼脂封口。小心加入7.5%分离胶(30% Acryl / 0.8% Bis 7.2 ml，10% SDS 0.56 ml，pH 8.8、2 mol.L-1 Tris-HCl 7.0 ml，ddH2O 12.7 ml，TEMED 45 μl，2% 过硫酸铵 0.66 ml)。待凝胶聚合后，插入样品梳，加浓缩胶(30% Acryl / 0.8% Bis 1.0 ml，10% SDS 0.1 ml，pH 6.8、0.5 mol.L-1 Tris-HCl 2.5 ml，ddH2O 6.2 ml，TEMED 20 μl，2% 过硫酸铵 0.24 ml)。室温下30 min浓缩胶聚合，胶板固定于电泳槽，轻轻拔出样品梳，加样于样品槽，每槽20 μl，样品用pH 6.8、0.125 mol.L-1 Tris-HCl缓冲液充分透析后，以样品缓冲液(10%SDS 4 ml，pH 6.8、0.5 mol.L-1 Tris-HCl 2 ml,ddH2O 0.5 ml,甘油2 ml,0.1 %溴酚蓝0.5 ml，巯基乙醇1.0 ml)。稀释为1 g.L-1后沸水浴3 min。随之加入电极缓冲液 (pH 8.3、0.05 mol.L-1 Tris-甘氨酸，0.1% SDS)，接上电极开始电泳，约6 h完毕，游离凝胶后固定、染色、脱色、晾干拍照。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 洗脱曲线
Sephadex-G 200纯化AGEs-BSA的洗脱曲线呈双峰，第1峰荧光值和紫外280 nm OD值均显著高于第2峰，相对荧光值(FI/OD 280 nm)在初期即达顶峰，以后逐步下降(图1)。
2.2 荧光光谱
荧光光谱扫描显示未纯化AGEs-BSA激发光谱有两个峰(292 nm和360 nm)，发射光谱峰在446 nm；纯化的AGEs-BSA只有360 nm激发峰，发射峰同前(图2)。
2.3 电泳图谱
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纯化的AGEs-BSA (FP)，经SDS-PAGE显示两条带，与标准AGEs-BSA (P-AGEs)电泳图谱一致。第1条带极淡，第2条带深而弥散，呈涂片状，在样品胶顶部染色最深，部分样品拒绝进入凝胶。与分子量标准 (PS)比较示第2条带分子量大于97.4 Kd。洗脱曲线第2峰 (SP)样品呈现1条带，与纯化AGEs-BSA第1条带电泳位置相近，分子量相当于单体BSA (图3)。
3 讨 论
近年来，有关AGEs致病作用的研究报道甚多。目前认为AGEs与糖尿病和尿毒症血管病变、老化、阿尔采末病等密切相关。有效检测血清或组织中AGEs水平对于进一步从整体水平研究AGEs与糖尿病并发症及其他疾病发生之间的关系具有非常重要的临床意义。为此，作者通过AGEs抗体制备建立了血清AGEs的免疫学检测方法[3]。为了保证抗体的特异性，作者将体外孵育制备的AGEs-BSA经过凝胶层析纯化后用作免疫原。
, 百拇医药
凝胶层析洗脱曲线显示蛋白 (OD 280 nm) 和AGEs荧光值 (FI) 均呈双峰，第1峰荧光值远高于第2峰，相对荧光值 (FI/OD 280 nm) 在初期即达顶峰，以后逐步下降，与Wu等[4]结果一致。提示AGEs-BSA分子大小是多种多样的，分子量越大，则相对荧光值越高。
荧光光谱扫描显示未纯化的AGEs-BSA激发光谱呈双峰，峰位分别为292 nm和360 nm，高峰在360 nm，发射峰在446 nm；纯化后的AGEs只有360 nm激发峰和446 nm发射峰，说明激发波长360 nm，发射波长446 nm是AGEs所特有的，与文献报道基本一致[5，6]。
纯化的AGEs-BSA在SDS-PAGE上呈涂片状，顶部有较深色带拒绝进入凝胶。进一步提示蛋白质糖基化后可形成各种各样大小不同的AGEs，分子量在97.4 Kd以上，最大可超过1000 Kd[4]。
, 百拇医药
运用凝胶过滤法纯化的AGEs-BSA，经SDS-PAGE显示2条带，除了位于凝胶顶部的深而弥散、呈涂片状的1条主带外，在相当于单体BSA位置有1条极淡的次带，与洗脱曲线第2峰蛋白带位置一致，说明纯化效果尚不完美。但其与标准的AGEs-BSA(系用含新型色谱材料的灌注凝胶法纯化)电泳图谱基本一致，荧光光谱显示最大激发波长360 nm，最大发射波长446 nm，符合AGEs特征，与纯化前荧光光谱比较，激发292 nm峰消失，说明纯化效果尚属满意。运用该AGEs-BSA免疫新西兰白兔获得的多克隆抗AGEs抗体特异性比较理想，其与体内外形成的各种AGEs拥有共同的抗原决定簇，以该抗体建立的ELISA系统可用于糖尿病人体内AGEs水平检测[3]。以高度特异的单克隆抗AGEs抗体作为配基进行亲合层析可望获取完全纯化的AGEs。
参考文献
1 Brownlee M.Advanced protein glycosylation in diabetes and aging.Annu Red Med,1995,46:223
, 百拇医药
2 Brownlee M.Lilly lecture 1993:Glycation and diabetic complications.Diabetes,1994, 43:836
3 孙子林，刘乃丰，刘必成，等.糖基化终产物抗血清的制备及应用.中华医学检验杂志，1999, 22(1):38
4 Wu JT, Tu MC, Zhung P. Advanced glycation end products (AGE): Characterization of the products from the reaction between D-glucose and serum albumin. J Clin Lab Anal,1996,10:21
5 WrÓbel K,WrÓbel K,Garay-Sevilla ME,et al.Novel analytical approach to monitoring advanced glycation end products in human serum with on-line spectrophotometric and spectrofluorometric detection in a flow system. Clin Chem,1997,43:1563
6 MÜnch G,Keis R,Weβels A,et al.Determination of advanced glycation end products in serum by fluorescence spectroscopy and competitive ELISA. Eur J Clin Chem Clin Biochem, 1997,35(9):669
收稿：1999-06-30 修回：1999-09-02, http://www.100md.com