聚合酶链式反应检测胆囊结石患者胆汁细菌DNA及意义
作者：高 鹏 方驰华
单位：高 鹏(广州解放军第177医院普通外科 510317)；方驰华(广州第一军医大学珠江医院肝胆外科 510282)
关键词：胆囊；结石；胆汁；细菌；聚合酶链反应
宁夏医学杂志990605 【摘要】 目的 研究胆囊结石患者胆汁细菌DNA，探讨胆结石形成与细菌感染的关系。方法 采用聚合酶链式反应(PCR)，对70例胆囊结石患者胆汁中5种细菌DNA进行研究。结果 5种细菌中细菌DNA存在56例，其中单菌DNA29例，双菌DNA19例，多菌DNA8例；首次在胆汁中检测出幽门螺杆菌。结论 胆结石患者胆汁中存在多种细菌DNA；胆结石核心形成可能与细菌感染有关。
Test and significance on bacteria deoxyribonucleic acid of bile in gallstones patients with polymerase chain reaction
, 百拇医药
Gao Peng，Fang Chihua.
(Dept. of general surg.the PLA 177 Hosp.，Guangzhou)
【Abstract】 Objectives To study bile bacteria deoxyribonucleic acid (DNA) in gallstones patients and to detect relationship between gallstones form and bacteria infection.Methods Bile DNA of bacteria has been studied in 64 gallstones patients with poly-merase chain reaction (PCR).Results DNA of bacteria was 56 patients in five bacteria，on which DNA of simple bacterium，double bactreia and multiple bacteria was 29 patients，19 patients and 10 patients，respectively.DNA of helicobacter pylori was first tested in bile.Conclusions There was DNA of multiple bacteria in bile.Gallstones nuclear form was related to bacteria infection.
, 百拇医药
【Key words】 Gallbladder，calculi；Bileacids and salts；Bacterial；Polymerase chain reaction
在胆汁细菌学的研究中，多以普通培养法，其培养需要时间长，阳性率低。为了探索一种快速、准确的方法，本文采用聚合酶链式反应—脱氧核糖核酸(PCR-DNA)扩增技术对胆囊结石患者的胆汁细菌DNA进行研究。
1 对象和方法
1.1 对象：70例患者中，男26例，女44例；年龄18～71岁，平均43.62±12.02岁。经B超检查诊断单纯胆囊结石，同期施行腹腔镜胆囊切除术(LC)，患者近半年来无急性发作史。
1.2 方法
1.2.1 标本采集：完成LC，经脐穿刺孔取出胆囊，无菌注射器穿刺抽取胆汁3～5ml置于无菌试管内，置-29℃保存，待测。
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1.2.2 细菌引物：大肠埃氏杆菌、伤寒杆菌、幽门螺杆菌、变形杆菌、克雷伯氏杆菌及阳标对照来自解放军基因研究所(见附表)。
1.2.3 PCR-DNA扩增：采用解放军基因研究所的DTC-3C型扩增仪。取胆汁60μl、处理液40μl混匀后煮沸20分钟，14000×g离心5分钟，取上清5μl加入引物中，放入扩增仪进行循环，共38次。取扩增好引物13μl，点样，琼酯糖、TAE电泳，并与阳标对照。
1.2.4 处理液和反应液：①处理液，蛋白酶K60mg/L，0.45%Tween-20，0.45%TritonX-100，PCR缓冲液，14000×g离心，取上清液为模板；②反应液，5×反应缓冲液5μl，混合10×dNTP2.5μl，引物5.0μl，无菌双蒸水6.5μl，加入备用模板5.0μl，无菌石蜡油30μl，Taq-DNA聚合酶1.5U。
附表 5种需氧细菌引物、扩增片段长度情况 细菌
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引物
编号
引物序列
扩增片段
长度(bp)
大肠埃氏杆菌
1
5′TCTCTATGTGCATACGGAG3′
320
2
5′CCATACTGATTGCCGCAA3
伤寒杆菌
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3
5′ACTGCTAAAACCACTACT3′
458
4
5′TTAACGCAGTAAAGAGAG3′
幽门螺杆菌
5
5′GCCAATGGTAAATTAGTT3′
411
6
5′CTCCTTAATTGTTTTTAC3′
变形杆菌
, 百拇医药
7
5′CTGGTAGGTATGGTGAGG3′
320
8
5′CCAGGCCAACAATTATTTCC3′
克雷伯氏杆菌
9
5′GCTGATCTTGACTATGTGGTG
288
10
5′GGCTCAGGATCTGTCCTTCGG
, 百拇医药
2 结果
检测胆汁70例，存在细菌DNA56例。单菌DNA29例，其中大肠埃氏杆菌6例、伤寒杆菌5例、幽门螺杆菌2例、变形杆菌4例、克雷伯氏杆菌12例；双菌DNA19例，其中大肠杆菌+幽门杆菌5例、幽门螺杆菌+克雷伯氏杆菌3例、大肠杆菌+克雷伯氏杆菌4例、幽门螺杆菌+伤寒杆菌4例、大肠杆菌+变形杆菌2例、伤寒杆菌+变形杆菌1例；多菌DNA8例，其中幽门螺杆菌+大肠杆菌+变形杆菌3例、大肠杆菌+克雷伯氏杆菌+变形杆菌1例、幽门螺杆菌+伤寒杆菌+克雷伯氏杆菌2例、幽门螺杆菌+伤寒杆菌+大肠杆菌+变形杆菌1例。
就5种细菌DNA单个出现的情况而言，22例标本中有大肠杆菌DNA，22例中有克雷伯氏杆菌DNA，11例存在伤寒杆菌DNA，11例存在变形杆菌DNA，20例存在幽门螺杆菌DNA。
3 讨论
3.1 PCR-DNA扩增技术对胆汁细菌检测的价值：一般认为，正常情况下胆汁是无菌的，胆汁内发现细菌被认为是来自门静脉或直接从肠道经Oddi氏括约肌返流入胆道。门静脉血管内可以培养出肠道内细菌，但由于肝脏免疫机制和枯否细胞的吞噬功能，细菌在进入胆道系统前即被消失。本组从基因水平研究发现5种细菌DNA存在56例，占80%，结果显著高于文献报道〔1，2〕。可以推测，随着检测细菌DNA增多，检测率会更高。由此可见，PCR-DNA扩增对胆道感染细菌检测有着重要价值。
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3.2 胆汁细菌DNA与胆结石核心形成的关系：目前认为，胆囊结石形成是由于胆汁中的胆固醇从溶液中沉淀 析出，聚积形成结石。细菌感染后，胆囊粘膜和胆汁发生炎性改变，细菌产生有损害粘膜上皮的酶和有害物质，粘膜上皮增生，粘液物质增加并形成网状结构，在结石形成各个阶段都起作用〔3〕。此外，大肠杆菌等细菌产生β-葡萄糖醛酸酶，将卵磷酯、结合胆汁酸降解为脂肪酸和游离脂肪酸，从而消耗了胆汁的胆盐和卵磷脂，使得胆固醇沉积。本组中，细菌DNA检测率高达80%，由此可见，胆道细菌感染与胆结石核心形成有密切关系。
3.3 胆汁中幽门螺杆菌的检测及意义：幽门螺杆菌是急、慢性胃炎和胃十二指肠溃疡的主要致病菌。关于胆囊胆汁、粘膜幽门螺杆菌研究未见文献报道。本研究首次从胆汁、粘膜和结石中均检测出幽门螺杆菌DNA，但在门静脉血中未检测出该菌DNA，证明该菌是经Oddi氏括约肌逆流进入胆道。至于该菌对胆囊粘膜损害的机理，病理改变、成石作用有待进一步研究。
参考文献
1 韩耀辉，魏子冬，李克敏，等.胆道疾病的胆汁细菌学研究(附150例临床分析).天津医药，1989，17(10)：623
2 黎沾良，顾万清.胆石症病人术中胆汁细菌培养225例分析.中华外科杂志，1985，23(4)：229
3 黄志强.胆囊结石.见吴阶平，裘法祖主编. 黄家驷外科学.第四版.北京：人民卫生出版社，1986.1250～1260
责编：杨自革
(收稿：1998—11—06), http://www.100md.com
单位：高 鹏(广州解放军第177医院普通外科 510317)；方驰华(广州第一军医大学珠江医院肝胆外科 510282)
关键词：胆囊；结石；胆汁；细菌；聚合酶链反应
宁夏医学杂志990605 【摘要】 目的 研究胆囊结石患者胆汁细菌DNA，探讨胆结石形成与细菌感染的关系。方法 采用聚合酶链式反应(PCR)，对70例胆囊结石患者胆汁中5种细菌DNA进行研究。结果 5种细菌中细菌DNA存在56例，其中单菌DNA29例，双菌DNA19例，多菌DNA8例；首次在胆汁中检测出幽门螺杆菌。结论 胆结石患者胆汁中存在多种细菌DNA；胆结石核心形成可能与细菌感染有关。
Test and significance on bacteria deoxyribonucleic acid of bile in gallstones patients with polymerase chain reaction
, 百拇医药
Gao Peng，Fang Chihua.
(Dept. of general surg.the PLA 177 Hosp.，Guangzhou)
【Abstract】 Objectives To study bile bacteria deoxyribonucleic acid (DNA) in gallstones patients and to detect relationship between gallstones form and bacteria infection.Methods Bile DNA of bacteria has been studied in 64 gallstones patients with poly-merase chain reaction (PCR).Results DNA of bacteria was 56 patients in five bacteria，on which DNA of simple bacterium，double bactreia and multiple bacteria was 29 patients，19 patients and 10 patients，respectively.DNA of helicobacter pylori was first tested in bile.Conclusions There was DNA of multiple bacteria in bile.Gallstones nuclear form was related to bacteria infection.
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【Key words】 Gallbladder，calculi；Bileacids and salts；Bacterial；Polymerase chain reaction
在胆汁细菌学的研究中，多以普通培养法，其培养需要时间长，阳性率低。为了探索一种快速、准确的方法，本文采用聚合酶链式反应—脱氧核糖核酸(PCR-DNA)扩增技术对胆囊结石患者的胆汁细菌DNA进行研究。
1 对象和方法
1.1 对象：70例患者中，男26例，女44例；年龄18～71岁，平均43.62±12.02岁。经B超检查诊断单纯胆囊结石，同期施行腹腔镜胆囊切除术(LC)，患者近半年来无急性发作史。
1.2 方法
1.2.1 标本采集：完成LC，经脐穿刺孔取出胆囊，无菌注射器穿刺抽取胆汁3～5ml置于无菌试管内，置-29℃保存，待测。
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1.2.2 细菌引物：大肠埃氏杆菌、伤寒杆菌、幽门螺杆菌、变形杆菌、克雷伯氏杆菌及阳标对照来自解放军基因研究所(见附表)。
1.2.3 PCR-DNA扩增：采用解放军基因研究所的DTC-3C型扩增仪。取胆汁60μl、处理液40μl混匀后煮沸20分钟，14000×g离心5分钟，取上清5μl加入引物中，放入扩增仪进行循环，共38次。取扩增好引物13μl，点样，琼酯糖、TAE电泳，并与阳标对照。
1.2.4 处理液和反应液：①处理液，蛋白酶K60mg/L，0.45%Tween-20，0.45%TritonX-100，PCR缓冲液，14000×g离心，取上清液为模板；②反应液，5×反应缓冲液5μl，混合10×dNTP2.5μl，引物5.0μl，无菌双蒸水6.5μl，加入备用模板5.0μl，无菌石蜡油30μl，Taq-DNA聚合酶1.5U。
附表 5种需氧细菌引物、扩增片段长度情况 细菌
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引物
编号
引物序列
扩增片段
长度(bp)
大肠埃氏杆菌
1
5′TCTCTATGTGCATACGGAG3′
320
2
5′CCATACTGATTGCCGCAA3
伤寒杆菌
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3
5′ACTGCTAAAACCACTACT3′
458
4
5′TTAACGCAGTAAAGAGAG3′
幽门螺杆菌
5
5′GCCAATGGTAAATTAGTT3′
411
6
5′CTCCTTAATTGTTTTTAC3′
变形杆菌
, 百拇医药
7
5′CTGGTAGGTATGGTGAGG3′
320
8
5′CCAGGCCAACAATTATTTCC3′
克雷伯氏杆菌
9
5′GCTGATCTTGACTATGTGGTG
288
10
5′GGCTCAGGATCTGTCCTTCGG
, 百拇医药
2 结果
检测胆汁70例，存在细菌DNA56例。单菌DNA29例，其中大肠埃氏杆菌6例、伤寒杆菌5例、幽门螺杆菌2例、变形杆菌4例、克雷伯氏杆菌12例；双菌DNA19例，其中大肠杆菌+幽门杆菌5例、幽门螺杆菌+克雷伯氏杆菌3例、大肠杆菌+克雷伯氏杆菌4例、幽门螺杆菌+伤寒杆菌4例、大肠杆菌+变形杆菌2例、伤寒杆菌+变形杆菌1例；多菌DNA8例，其中幽门螺杆菌+大肠杆菌+变形杆菌3例、大肠杆菌+克雷伯氏杆菌+变形杆菌1例、幽门螺杆菌+伤寒杆菌+克雷伯氏杆菌2例、幽门螺杆菌+伤寒杆菌+大肠杆菌+变形杆菌1例。
就5种细菌DNA单个出现的情况而言，22例标本中有大肠杆菌DNA，22例中有克雷伯氏杆菌DNA，11例存在伤寒杆菌DNA，11例存在变形杆菌DNA，20例存在幽门螺杆菌DNA。
3 讨论
3.1 PCR-DNA扩增技术对胆汁细菌检测的价值：一般认为，正常情况下胆汁是无菌的，胆汁内发现细菌被认为是来自门静脉或直接从肠道经Oddi氏括约肌返流入胆道。门静脉血管内可以培养出肠道内细菌，但由于肝脏免疫机制和枯否细胞的吞噬功能，细菌在进入胆道系统前即被消失。本组从基因水平研究发现5种细菌DNA存在56例，占80%，结果显著高于文献报道〔1，2〕。可以推测，随着检测细菌DNA增多，检测率会更高。由此可见，PCR-DNA扩增对胆道感染细菌检测有着重要价值。
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3.2 胆汁细菌DNA与胆结石核心形成的关系：目前认为，胆囊结石形成是由于胆汁中的胆固醇从溶液中沉淀 析出，聚积形成结石。细菌感染后，胆囊粘膜和胆汁发生炎性改变，细菌产生有损害粘膜上皮的酶和有害物质，粘膜上皮增生，粘液物质增加并形成网状结构，在结石形成各个阶段都起作用〔3〕。此外，大肠杆菌等细菌产生β-葡萄糖醛酸酶，将卵磷酯、结合胆汁酸降解为脂肪酸和游离脂肪酸，从而消耗了胆汁的胆盐和卵磷脂，使得胆固醇沉积。本组中，细菌DNA检测率高达80%，由此可见，胆道细菌感染与胆结石核心形成有密切关系。
3.3 胆汁中幽门螺杆菌的检测及意义：幽门螺杆菌是急、慢性胃炎和胃十二指肠溃疡的主要致病菌。关于胆囊胆汁、粘膜幽门螺杆菌研究未见文献报道。本研究首次从胆汁、粘膜和结石中均检测出幽门螺杆菌DNA，但在门静脉血中未检测出该菌DNA，证明该菌是经Oddi氏括约肌逆流进入胆道。至于该菌对胆囊粘膜损害的机理，病理改变、成石作用有待进一步研究。
参考文献
1 韩耀辉，魏子冬，李克敏，等.胆道疾病的胆汁细菌学研究(附150例临床分析).天津医药，1989，17(10)：623
2 黎沾良，顾万清.胆石症病人术中胆汁细菌培养225例分析.中华外科杂志，1985，23(4)：229
3 黄志强.胆囊结石.见吴阶平，裘法祖主编. 黄家驷外科学.第四版.北京：人民卫生出版社，1986.1250～1260
责编：杨自革
(收稿：1998—11—06), http://www.100md.com