口腔鳞癌和癌前病变中端粒酶活性的检测
作者：姚华 吴葆萱 吴求亮 张行
单位：姚华、吴求亮 杭州，浙江大学医学院附属第一医院口腔科；吴葆萱 附属第二医院口腔科；张行 附属第二医院肿瘤研究所
关键词：口腔粘膜；癌，鳞状细胞；端粒酶
中华口腔医学杂志990602 【摘要】 目的 探讨端粒酶活化在口腔粘膜鳞癌、癌前病变中的表达状况以及癌变过程中的作用。方法 采用端粒酶(telomerase) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)、酶联免疫吸附法和端粒重复放大 (telomere repeat amplification protocol , TRAP)电泳法对20例口腔粘膜鳞癌、10例口腔粘膜白斑、20例口腔粘膜扁平苔藓和10例正常口腔粘膜组织中的端粒酶活性分别进行了定量和定性检测。结果 口腔鳞癌中的端粒酶活性(0.128)显著高于癌前病变组(0.005 8,0.009 4)和正常组(0.001 4)，癌前病变组与正常组织的端粒酶活性基本一致。结论 端粒酶活化在口腔鳞癌发生、发展过程中起了重要作用，端粒酶可能是判断癌变潜能的良好分子生物学标记物。
, 百拇医药
Study and detection of telomerase activity in oral squamous cell carcinomas and precancerous lesions
YAO Hua*, WU Baoxuan, WU Qiuliang, et al.
*Department of Stomatology, The First Affiliated Hospital of Zhejiang Medical University ，Hangzhou 310003
【Abstract】 Objective To find out the expression of telomerase activity in oral squamous cell carcinomas (SCC) and oral precancerous lesions. Methods Telomerase activity was examined by telomerase PCR ELISA assay and telomere repeat amplification protocol (TRAP) electrophoresis. 60 fresh oral specimens were selected, including 20 oral SCC, 30 oral precancerous lesions (10 oral leukoplakia, LK, 20 oral lichen planus, LP) and 10 normal mucosa (NM). Results Telomerase activity detected in SCC (0.128) was highest among all of the tissues(LK: 0.054, LP: 0.009 4, NM: 0.001 4). Statistical difference was notable between SCC and LK, LP, NM (P<0.01). A little difference was detected between LK, LP and NM. No difference was found between LK, and LP (P>0.05). Conclusion Telomerase may play an important role during oncogenesis of oral precancerous lesions, and may be a good molecular biomarker for observing the cancerization ability of precancerous lesion and estimating its prognosis.
, 百拇医药
【Key words】 Mouth mucosa Carcinoma，squamous cell Telomerase
端粒酶(telomerase)是由RNA和相应蛋白质组成的复合体，它通过合成真核生物末端端粒重复序列，延长端粒，从而使细胞获得无限增殖能力。研究表明，正常体细胞几乎无端粒酶表达，而绝大多数永生细胞、恶性组织及少数增殖活跃细胞含有端粒酶[1]。端粒酶被认为是细胞永生及恶性化的关键因素。我们自1996年开始对口腔鳞癌和癌前病变中的端粒酶活性进行检测研究，现报道如下。
材料与方法
一、 材料收集
标本取自手术和门诊活检新鲜组织，共60例。口腔鳞癌、扁平苔藓各20例，口腔白斑、正常口腔粘膜各10例。所有标本从口腔内取下后置于-80℃冰箱待用。各病理组织均经常规病理切片，诊断明确。
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二、主要试剂
端粒酶试剂盒购自德国宝灵曼公司(cat.1854666)。
三、主要仪器
聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增仪 、稳压稳流定时电泳仪、 酶联免疫测定仪。
四、方法
1.端粒酶PCR 酶联免疫吸附(ELISA)法(酶标法)：①组织端粒酶RNA提取[2]： 取冻存组织约3 mm×3 mm×3 mm，迅速充分剪碎加入端粒酶裂解液80 μl，混匀成浆状，冰浴1.5至2小时后，4℃，12 000 r/min，离心20分钟，取上清液。②TRAP反应： 取上清液5 μl，PCR扩增液25μl，置于PCR扩增仪扩增。③杂交和酶联免疫吸附法： 取变性液20 μl和PCR产物5 μl移入无菌离心管，变性，加入225 μl杂交液混匀，取100 μl混匀后杂交液，加到条孔板中100 μl/孔，杂交；加入抗DIG过氧化酶2μl+98μl～100μl酶连接稀释液/孔，酶标；以后分别加入底物TMB100 μl/孔，终止液100 μl/孔，终止反应。④酶联免疫吸附测定： 读取波长450的A值。
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2.端粒重复放大(telomere repeat amplification protocol， TRAP)电泳法(10%聚丙烯酰胺凝胶电泳)：配胶，制凝胶板；PCR产物浓缩处理；取上述PCR浓缩产物10 μl和染料，加上样缓冲液5 μl，在10%不变性聚丙烯酰胺凝胶180 V稳压稳流电泳2小时；银染色，制成薄膜。
结果
一、端粒酶酶标法结果
口腔正常粘膜及癌前病变、鳞癌的端粒酶活性A值比较(表1,2)。从表1,2可见，口腔正常粘膜、白斑、扁平苔藓及鳞癌端粒酶A值依次增高。
表1 各组端粒酶活性统计 组 别
例 数
A均值
, 百拇医药
标准差
口腔鳞癌
20
0.128
0.146
口腔白斑
10
5.8×10-3
3.88×10-3
扁平苔藓
20
9.4×10-3
, http://www.100md.com
1.04×10-3
正常粘膜
10
1.4×10-3
3.27×10-3
表2 各组端粒酶活性两两比较结果 组别
t或t′
P值
SCC与LK
3.745
0.001**
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SCC与LP
3.630
0.002**
SCC与NM
3.880
0.001**
LK与NM
2.740
0.014*
LP与NM
3.135
0.004**
, http://www.100md.com
LK与LP
-1.355
0.187
注：SCC：口腔鳞癌；LK：口腔白斑；LP：扁平苔藓；NM：正常粘膜；采用成组t检验(方差不齐时用t′检验)、秩和检验；*P<0.05 ；** P<0.01 二、端粒酶电泳法(10%聚丙烯酰胺凝胶电泳)结果
阳性判断标准：出现梯状3条以上条带为阳性标准[2]；阴性判断标准：56℃热灭活的TRAP产物电泳结果为阴性标准。口腔正常粘膜及各病理状态组织电泳结果分析(表3,4)。20例口腔鳞癌有12例为阳性，其余各组均无明显阳性条带出现。
表3 各组组织凝胶电泳结果 组别
例数
, 百拇医药
阳性数
阳性率(%)
口腔鳞癌
20
12
60
口腔白斑
10
0
0
扁平苔藓
20
0
, http://www.100md.com 0
正常粘膜
10
0
0
表4 各组组织凝胶电泳两两比较结果 组别
t′
P值
口腔鳞癌与白斑
*
0.0014
口腔鳞癌与扁平苔藓
14.4
, 百拇医药
<0.0100
口腔鳞癌与正常粘膜
*
0.0117
注:*采用四格表确切概率检验,其余为四格表检验.
讨论
近年来,口腔鳞癌的发病呈上升趋势,有关口腔粘膜癌变机理及癌变潜能的研究已成为当今口腔科学的重要课题之一.端粒酶的发现,丰富了人们对恶性肿瘤的认为是迄今为止最具有人体肿瘤特异性和敏感性的分子标记物[3,4]
本研究的定量检测结果发现,口腔鳞癌中端粒酶活性显著升高,癌前病变中的端粒酶活性值略高于正常组织,但无统计学判别定性检测同样发现,口腔鳞癌中端粒酶活性表达率高达60%,而癌前病变政党组织均为阴性表态,支持定量检测结果.端粒酶的表达显现出肿瘤特异性.从组织学上看,口腔政党粘膜,癌前病变到鳞癌的细胞异型性逐渐增强,而端粒酶活性相应地增高,这提示在口腔癌前病变发展为鳞癌的过程中,端粒酶可能起了重要作用,它的活化可能是癌变发生的重要生物学步骤[5,6].我们推测:端粒酶活性与口腔正常粘膜和癌前病变发生癌变的分子机制有关，尤其是在癌变早期发挥关键作用，并随酶活性增高，肿瘤恶性程度增加，所以酶活性可作为判断癌变潜能的依据。这与其他人体组织中端粒酶研究结果一致[7,8]。
, 百拇医药
端粒酶RNA的活化是在细胞形态学改变之前出现的，所以，检测组织的端粒酶活性将可以在癌细胞发生的分子水平而非组织水平得到癌变信息，有助于早期判断癌变潜能。端粒酶无疑为临床依赖解剖和形态学的传统诊断方法带来新的思路，尤其对确定真正的手术安全边缘具有临床意义。同时，鉴于端粒酶在正常组织中无表达的特性，以端粒酶为靶点的抗端粒酶化疗，将提高肿瘤针对性，减少对正常组织的毒性，还可作为化疗效果的指针。本实验为抗端粒酶药物在口腔临床的应用提供了理论依据。实验还发现，电泳法可以对组织中的端粒酶活性进行定性检测，酶标法则可以从量上测到端粒酶活性的相对值，区别出不同组织间的差别。酶标法较电泳法更为敏感、精确。
总之，端粒酶的活化与口腔粘膜癌前病变发生癌变密切相关，可能是发生癌变的重要生物学步骤。端粒酶的活性对于估计口腔粘膜癌变潜能、鳞癌的早期诊断、判断预后有重要意义。
参考文献
1 Greider CW, Blackburn EH. Telomeres, telomerase and cancer. Sci Am，1996，274:92-97.
, http://www.100md.com
2 Saito T, Schneider A, Martel N, et al. Proliferation-associated regulation of telomerase activity in human endometrium and its potential implication in early cancer diagnosis. Biochem Biophys Res Commun，1997,231:610-614.
3 Califano J, Ahrendt SA, Meininger G, et al. Detection of telomerase activity in oral rinses from head and neck squamous cell carcinoma patients. Cancer Res，1996,56:5720-5722.
4 Mao L, E1-Naggar AK, Fan YH, et al. Telomerase activity in head and neck squamous cell carcinoma and adjacent tissues. Cancer Res, 1996, 56:5600-5604.
, 百拇医药
5 Shay JW, Gazdar AF. Telomerase in the early detection of cancer. J Clin Pathol, 1997, 50:106-109.
6 Murakami J, Nagai N, Ohama K, et al. Telomerase activity in ovarian tumors. Cancer，1997,80:1085-1092.
7 Albanell J, Lonardo F, Rusch V, et al. High telomerase activity in primary lung cancers : association with increased cell proliferation rates and advanced pathologic stage. J Natl Cancer Inst，1997,89:1609-1615.
8 Nouso K, Urabe Y, Higashi T, et al. Telomerase as a tool for the differential diagnosis of human hepatocellular carcinoma. Cancer，1996,78:232-236.
(收稿：1998-11-19 修回：1999-06-16), 百拇医药
单位：姚华、吴求亮 杭州，浙江大学医学院附属第一医院口腔科；吴葆萱 附属第二医院口腔科；张行 附属第二医院肿瘤研究所
关键词：口腔粘膜；癌，鳞状细胞；端粒酶
中华口腔医学杂志990602 【摘要】 目的 探讨端粒酶活化在口腔粘膜鳞癌、癌前病变中的表达状况以及癌变过程中的作用。方法 采用端粒酶(telomerase) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)、酶联免疫吸附法和端粒重复放大 (telomere repeat amplification protocol , TRAP)电泳法对20例口腔粘膜鳞癌、10例口腔粘膜白斑、20例口腔粘膜扁平苔藓和10例正常口腔粘膜组织中的端粒酶活性分别进行了定量和定性检测。结果 口腔鳞癌中的端粒酶活性(0.128)显著高于癌前病变组(0.005 8,0.009 4)和正常组(0.001 4)，癌前病变组与正常组织的端粒酶活性基本一致。结论 端粒酶活化在口腔鳞癌发生、发展过程中起了重要作用，端粒酶可能是判断癌变潜能的良好分子生物学标记物。
, 百拇医药
Study and detection of telomerase activity in oral squamous cell carcinomas and precancerous lesions
YAO Hua*, WU Baoxuan, WU Qiuliang, et al.
*Department of Stomatology, The First Affiliated Hospital of Zhejiang Medical University ，Hangzhou 310003
【Abstract】 Objective To find out the expression of telomerase activity in oral squamous cell carcinomas (SCC) and oral precancerous lesions. Methods Telomerase activity was examined by telomerase PCR ELISA assay and telomere repeat amplification protocol (TRAP) electrophoresis. 60 fresh oral specimens were selected, including 20 oral SCC, 30 oral precancerous lesions (10 oral leukoplakia, LK, 20 oral lichen planus, LP) and 10 normal mucosa (NM). Results Telomerase activity detected in SCC (0.128) was highest among all of the tissues(LK: 0.054, LP: 0.009 4, NM: 0.001 4). Statistical difference was notable between SCC and LK, LP, NM (P<0.01). A little difference was detected between LK, LP and NM. No difference was found between LK, and LP (P>0.05). Conclusion Telomerase may play an important role during oncogenesis of oral precancerous lesions, and may be a good molecular biomarker for observing the cancerization ability of precancerous lesion and estimating its prognosis.
, 百拇医药
【Key words】 Mouth mucosa Carcinoma，squamous cell Telomerase
端粒酶(telomerase)是由RNA和相应蛋白质组成的复合体，它通过合成真核生物末端端粒重复序列，延长端粒，从而使细胞获得无限增殖能力。研究表明，正常体细胞几乎无端粒酶表达，而绝大多数永生细胞、恶性组织及少数增殖活跃细胞含有端粒酶[1]。端粒酶被认为是细胞永生及恶性化的关键因素。我们自1996年开始对口腔鳞癌和癌前病变中的端粒酶活性进行检测研究，现报道如下。
材料与方法
一、 材料收集
标本取自手术和门诊活检新鲜组织，共60例。口腔鳞癌、扁平苔藓各20例，口腔白斑、正常口腔粘膜各10例。所有标本从口腔内取下后置于-80℃冰箱待用。各病理组织均经常规病理切片，诊断明确。
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二、主要试剂
端粒酶试剂盒购自德国宝灵曼公司(cat.1854666)。
三、主要仪器
聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增仪 、稳压稳流定时电泳仪、 酶联免疫测定仪。
四、方法
1.端粒酶PCR 酶联免疫吸附(ELISA)法(酶标法)：①组织端粒酶RNA提取[2]： 取冻存组织约3 mm×3 mm×3 mm，迅速充分剪碎加入端粒酶裂解液80 μl，混匀成浆状，冰浴1.5至2小时后，4℃，12 000 r/min，离心20分钟，取上清液。②TRAP反应： 取上清液5 μl，PCR扩增液25μl，置于PCR扩增仪扩增。③杂交和酶联免疫吸附法： 取变性液20 μl和PCR产物5 μl移入无菌离心管，变性，加入225 μl杂交液混匀，取100 μl混匀后杂交液，加到条孔板中100 μl/孔，杂交；加入抗DIG过氧化酶2μl+98μl～100μl酶连接稀释液/孔，酶标；以后分别加入底物TMB100 μl/孔，终止液100 μl/孔，终止反应。④酶联免疫吸附测定： 读取波长450的A值。
, http://www.100md.com
2.端粒重复放大(telomere repeat amplification protocol， TRAP)电泳法(10%聚丙烯酰胺凝胶电泳)：配胶，制凝胶板；PCR产物浓缩处理；取上述PCR浓缩产物10 μl和染料，加上样缓冲液5 μl，在10%不变性聚丙烯酰胺凝胶180 V稳压稳流电泳2小时；银染色，制成薄膜。
结果
一、端粒酶酶标法结果
口腔正常粘膜及癌前病变、鳞癌的端粒酶活性A值比较(表1,2)。从表1,2可见，口腔正常粘膜、白斑、扁平苔藓及鳞癌端粒酶A值依次增高。
表1 各组端粒酶活性统计 组 别
例 数
A均值
, 百拇医药
标准差
口腔鳞癌
20
0.128
0.146
口腔白斑
10
5.8×10-3
3.88×10-3
扁平苔藓
20
9.4×10-3
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1.04×10-3
正常粘膜
10
1.4×10-3
3.27×10-3
表2 各组端粒酶活性两两比较结果 组别
t或t′
P值
SCC与LK
3.745
0.001**
, http://www.100md.com
SCC与LP
3.630
0.002**
SCC与NM
3.880
0.001**
LK与NM
2.740
0.014*
LP与NM
3.135
0.004**
, http://www.100md.com
LK与LP
-1.355
0.187
注：SCC：口腔鳞癌；LK：口腔白斑；LP：扁平苔藓；NM：正常粘膜；采用成组t检验(方差不齐时用t′检验)、秩和检验；*P<0.05 ；** P<0.01 二、端粒酶电泳法(10%聚丙烯酰胺凝胶电泳)结果
阳性判断标准：出现梯状3条以上条带为阳性标准[2]；阴性判断标准：56℃热灭活的TRAP产物电泳结果为阴性标准。口腔正常粘膜及各病理状态组织电泳结果分析(表3,4)。20例口腔鳞癌有12例为阳性，其余各组均无明显阳性条带出现。
表3 各组组织凝胶电泳结果 组别
例数
, 百拇医药
阳性数
阳性率(%)
口腔鳞癌
20
12
60
口腔白斑
10
0
0
扁平苔藓
20
0
, http://www.100md.com 0
正常粘膜
10
0
0
表4 各组组织凝胶电泳两两比较结果 组别
t′
P值
口腔鳞癌与白斑
*
0.0014
口腔鳞癌与扁平苔藓
14.4
, 百拇医药
<0.0100
口腔鳞癌与正常粘膜
*
0.0117
注:*采用四格表确切概率检验,其余为四格表检验.
讨论
近年来,口腔鳞癌的发病呈上升趋势,有关口腔粘膜癌变机理及癌变潜能的研究已成为当今口腔科学的重要课题之一.端粒酶的发现,丰富了人们对恶性肿瘤的认为是迄今为止最具有人体肿瘤特异性和敏感性的分子标记物[3,4]
本研究的定量检测结果发现,口腔鳞癌中端粒酶活性显著升高,癌前病变中的端粒酶活性值略高于正常组织,但无统计学判别定性检测同样发现,口腔鳞癌中端粒酶活性表达率高达60%,而癌前病变政党组织均为阴性表态,支持定量检测结果.端粒酶的表达显现出肿瘤特异性.从组织学上看,口腔政党粘膜,癌前病变到鳞癌的细胞异型性逐渐增强,而端粒酶活性相应地增高,这提示在口腔癌前病变发展为鳞癌的过程中,端粒酶可能起了重要作用,它的活化可能是癌变发生的重要生物学步骤[5,6].我们推测:端粒酶活性与口腔正常粘膜和癌前病变发生癌变的分子机制有关，尤其是在癌变早期发挥关键作用，并随酶活性增高，肿瘤恶性程度增加，所以酶活性可作为判断癌变潜能的依据。这与其他人体组织中端粒酶研究结果一致[7,8]。
, 百拇医药
端粒酶RNA的活化是在细胞形态学改变之前出现的，所以，检测组织的端粒酶活性将可以在癌细胞发生的分子水平而非组织水平得到癌变信息，有助于早期判断癌变潜能。端粒酶无疑为临床依赖解剖和形态学的传统诊断方法带来新的思路，尤其对确定真正的手术安全边缘具有临床意义。同时，鉴于端粒酶在正常组织中无表达的特性，以端粒酶为靶点的抗端粒酶化疗，将提高肿瘤针对性，减少对正常组织的毒性，还可作为化疗效果的指针。本实验为抗端粒酶药物在口腔临床的应用提供了理论依据。实验还发现，电泳法可以对组织中的端粒酶活性进行定性检测，酶标法则可以从量上测到端粒酶活性的相对值，区别出不同组织间的差别。酶标法较电泳法更为敏感、精确。
总之，端粒酶的活化与口腔粘膜癌前病变发生癌变密切相关，可能是发生癌变的重要生物学步骤。端粒酶的活性对于估计口腔粘膜癌变潜能、鳞癌的早期诊断、判断预后有重要意义。
参考文献
1 Greider CW, Blackburn EH. Telomeres, telomerase and cancer. Sci Am，1996，274:92-97.
, http://www.100md.com
2 Saito T, Schneider A, Martel N, et al. Proliferation-associated regulation of telomerase activity in human endometrium and its potential implication in early cancer diagnosis. Biochem Biophys Res Commun，1997,231:610-614.
3 Califano J, Ahrendt SA, Meininger G, et al. Detection of telomerase activity in oral rinses from head and neck squamous cell carcinoma patients. Cancer Res，1996,56:5720-5722.
4 Mao L, E1-Naggar AK, Fan YH, et al. Telomerase activity in head and neck squamous cell carcinoma and adjacent tissues. Cancer Res, 1996, 56:5600-5604.
, 百拇医药
5 Shay JW, Gazdar AF. Telomerase in the early detection of cancer. J Clin Pathol, 1997, 50:106-109.
6 Murakami J, Nagai N, Ohama K, et al. Telomerase activity in ovarian tumors. Cancer，1997,80:1085-1092.
7 Albanell J, Lonardo F, Rusch V, et al. High telomerase activity in primary lung cancers : association with increased cell proliferation rates and advanced pathologic stage. J Natl Cancer Inst，1997,89:1609-1615.
8 Nouso K, Urabe Y, Higashi T, et al. Telomerase as a tool for the differential diagnosis of human hepatocellular carcinoma. Cancer，1996,78:232-236.
(收稿：1998-11-19 修回：1999-06-16), 百拇医药