鼠光感受器细胞层移植的方法及观察
作者：王薇 马美云 白芳 张惠蓉
单位：100083 北京医科大学第三医院眼科
关键词：细胞移植；；方法；；动物；实验
鼠光感受器细胞层移植的方法及观察 【摘要】 目的 研究视锥和视杆细胞与周围组织间在解剖结构及病理生理等方面的关系。方法 取20只同龄Wistar和RCS鼠作为供体和受体，利用视网膜切削技术取得视锥及视杆细胞层，并植入RCS鼠眼视网膜下。术后2周时摘除术眼，于光镜下观察并摄影。结果 术后2周，在视网膜完全复位的受体眼，移植的纯视锥和视杆细胞成活，可见移植细胞位于视网膜下腔的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)及内颗粒层之间，并与正常对照的视细胞呈相同的染色特点。结论 成片视网膜移殖所制备的动物模型，其视锥和视杆细胞具有正常的解剖位置并与RPE及内颗粒层组织相接，为进一步研究重建视神经间的解剖学联系及视神经的生理活动，提供了一种新的途径。
, 百拇医药
A study on transplantation of rat photoreceptor cell layer
WANG Wei, MA Meiyun, BAI Fang, et al. Department of Ophthalmology, Third Hospital of Beijing Medical University, Beijing 100083
【Abstract】 Objective To study the relationship between photoreceptors and other layers of the retina in the aspects of anatomical structure, physiology, pathology, etc.. Methods RCS rats were used as host animals, and the pure cone and rod layer of the donor retina was prepared from Wistar rat and was transplanted under the host retina where the cones and rods were degenerated. Results After 2 weeks of transplantation, the retinas of the host rats were reattached, and the transplanted cells were survival. The transplanted cells were in the subretinal space between the retinal pigment epithelium (RPE) and the inner unclear layer, and they had the staining characteristics similar to that of the normal control photoreceptos. Conclusion In the animal model of photoreceptor cell layer transplantation, the transplanted cells possess normal anatomical location and are connected with RPE and inner nuclear layer. The results provide a new route to investigate the re-establishment of anatomical association with the optic nerve and the physiological activity of the nerve.
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【Key words】 Cell transplantation Methods Animal，laboratory
视细胞(视锥、视杆细胞)的损伤，是造成视力丧失的直接原因。视细胞的生理及病理一直是临床研究的热点。视网膜移植技术的出现，为临床研究提供了一条新的途径。自80年代初，人们即发现可以将视网膜成功地移植到异体内。McLoon和Lund[1]尝试将胚胎视网膜移植入同种大鼠的脑组织中。del Cerro等[2]则完成了视网膜的眼内移植。但这些实践仅提供了视网膜全层组织的移植，未能得到视神经组织的确切解剖学对位，不能满足更深层的研究需求。我们于1997年利用视网膜移植技术制作纯视细胞层视网膜下移植动物模型，以期提供一种具有生理性解剖对位的动物模型，对其进行观察、探讨。
材料及方法
1.实验动物：供体Wistar鼠5只，体重约2 000 g；受体鼠选用RCS鼠(Royal College of Surgeons，RCS)10只，鼠龄为60天。均由北京医科大学实验动物部提供。对照组分3组，RCS鼠术眼的非移植部位为手术对照；RCS鼠非手术眼为未接受移植对照；供体Wistar鼠另眼为正常对照。
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2.试剂及仪器：细胞培养液；组织细胞振荡切削机(vibratome)；明胶(gelatin)；平衡盐溶液(BSS)；解剖显微镜。
3.手术方法：麻醉受体RCS鼠，术眼常规消毒，铺巾。取颞上方沿角膜缘的结膜切口，略向下分离暴露巩膜。用电止血器在相当于视网膜周边部烙一线样区后切开。小心将供体移植片移入移植器内，美蓝染色，移植器顶端加少量BSS，将移植器插入视网膜下，由助手轻推插芯，使移植物进入视网膜下。手术显微镜下见视网膜局部灰白色隆起，下方见蓝染的移植物。将结膜复位。眼睑间断缝合1针。视网膜板层片的移植：10只RCS鼠作为受体，其中双眼接受移植术者5只鼠，共15只眼。
4.视网膜板层片的制备：摘除Wistar鼠眼球，将眼球自锯齿缘处剪开做前、后节，清除视网膜表面的玻璃体，钝性剥离、游离视网膜。于5% 明胶漂浮，将视网膜平铺于30%明胶底托上，外核层在下，置BSS冰水浴内用振荡切削机进行切削。当切削视网膜过半后，将每次切削的视网膜组织置于载玻片上，于显微镜下观察，待镜下有散在的视细胞出现时，则明胶块上已切削到纯视细胞层(包括视锥、视杆层及外颗粒层)。将切削的纯细胞层及明胶底衬自明胶底托上切下，再按移植器的大小分割成小块，置于4°C细胞培养液中备用。随机选择2块置于DiI(1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethyl-indocarbocyanil perchlorate)溶液中浸泡1 h ，平衡盐溶液冲洗备用。
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5.移植器的制备：将透明胶片及硅胶做一中空可活动推芯的器械。其顶部略尖锐，使其可插入视网膜下。移植器约5 mm×3 mm×12 mm，也可根据受体眼球巩膜切口及移植片的大小而定。其内径光滑，勿使细胞与移植器直接接触。分别于术后2周时处死受体鼠，将眼球摘出，分别固定：(1)4% 甲醛溶液，3天后行酒精脱水，石蜡包埋，切片，片厚5～7 μm，HE染色，光学显微镜下观察；OPTON光学显微镜下摄影。(2)切成小块后置于4% 戊二醛溶液中4 h，磷酸缓冲液冲洗，置于锇酸中第2 次固定，75%～100%酒精逐级脱水，浸透，Epon 812包埋。半薄切片，片厚0.5～1.0 μm用甲苯胺蓝染色后，于光镜下观察并摄影。(3)DiI标识者固定后做冰冻切片，荧光显微镜下观察摄影。
结果
1.手术结果：术后2周，术眼均无感染。1/3的术眼可见晶体混浊，15只眼可找到移植的视细胞。其中12只眼视网膜在位，结构大致正常，视网膜下未见明胶存留，移植处视网膜未见出血等病变。2只眼视细胞未能植于正常部位，而分别被植于玻璃体内及脉络膜下，细胞呈团样生长；移植部位视网膜结构完全混乱，无原有结构。2例移植失败眼中，1例视网膜呈脱离状，视细胞移植片折叠，细胞形态与呈团样生长的视细胞相似。
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2.非移植鼠眼视网膜观察：正常对照Wistar鼠眼视网膜(图1)，光镜下见(0.5μm 树脂包埋切片)外颗粒层(ON)细胞核呈蓝紫色，排列密集。内颗粒层(IN)细胞核染色较淡，与RPE(P)细胞着染程度相同。RPE呈单层排列，核椭圆形，染色略深于胞浆。RCS鼠非手术眼及手术眼非移植部位此时视网膜外颗粒层、视锥杆层已完全萎缩消失，仅见个别细胞核深染(图2)。
图1 正常Wistar鼠对照眼视细胞层，P示RPE层，ON示外颗粒层，IN示内颗粒层 甲苯胺蓝染色×80
, http://www.100md.com 图2 60天RCS鼠对照眼视细胞层，P示RPE层，ON示外颗粒层，IN示内颗粒层 甲苯胺蓝染色×80
3.移植视网膜观察：DiI标识位于受体视网膜内，呈亮红色(图3)。在移植视细胞部位的视网膜，可清楚的观察到新增加的视细胞层，即外颗粒层(图4)，其细胞大小及形态与对照组相似，位于RPE及内颗粒层之间。但移植视细胞层较薄，多数标本中仅有1～3层细胞核。在甲苯胺蓝染色中，细胞核呈深蓝色。视锥视杆层明显增厚(图4)。
图3 2周时冰冻切片，DiI标识位于受体视网膜内，荧光显微镜下呈亮红色 ×100
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图4 示术后2周时的移植部位，ON示新增加的外颗粒层，视细胞数量较少但排列整齐，IN示内颗粒层 甲苯胺蓝染色×80
4.移植眼RPE状态：RPE在大多数标本内仍为单层排列。部分区域排列欠规律。光镜下与移植的视细胞层外节相邻。在解剖学对位正确的移植标本中，Bruch 膜未见明显变化。
讨论
1.视网膜移植概念的引入：异体视网膜板层移植技术是80年代后的新兴课题。目前仅在美国等少数实验室取得成功。为进一步探索视网膜的病理生理特点开创了一条全新的路径。许多学者将视网膜移植到脑组织、玻璃体或其他组织内[1-3]，仅能证明视网膜移植成活，但均未能利用其探讨移植视网膜的形态。
2.模型动物的选择：我们建立了移植视网膜视细胞层解剖学正确对位的动物模型。首先考虑受体动物的选择，RCS鼠是视网膜色素变性的动物模型鼠，利用RCS鼠做为受体动物的优点是其生后固定期限内视网膜视细胞层全部萎缩[4]，节省了重复光损伤等动物模型的时间及经费，且RCS鼠的视网膜视细胞层有其特殊的研究价值[5],对于进一步研究视细胞及RPE相互间的作用，RPE发生凋亡的机制等具有重要的意义；其缺点：RCS鼠眼球小，虹膜呈粉色，无黑色素，手术操作及观察困难。可能在视细胞移植后的一定时间内又重新出现视细胞的退化。这一问题限制了移植术后动物的存活时间。因此，我们选择术后2 周进行观察 。但是正常的视细胞在RCS鼠的眼内环境下是否出现萎缩有待进一步研究。
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3.本实验设计的特点：Ehinger等[6]报道，将胚胎视网膜移植到异种视网膜下，并可见视细胞呈玫瑰花环样生长。任佩贤等[7]探讨了类似的问题，观察了同种异体小鼠视网膜移植后非正常对位状态下视网膜细胞的生长及其结构特点：(1)移植的视网膜为全部神经层，且在供体视网膜下成团状生长，与RPE间无正常的位置关系；(2)受体视网膜亦为全部神经层，无法接受供体的位置，其生长形态与将视网膜全部神经层植于玻璃体内或眼内其他部位者差异无显著性，其生长模式难于满足进一步研究视网膜移植的诸多问题。本研究的动物模型是利用RCS鼠视细胞的缺失，并制作了纯单视细胞层，移植于视网膜RPE与内颗粒层之间，希望重新建立视网膜10层结构的位置关系，为研究视网膜各层间神经的联接，神经递质的传导等提供可用的动物模型。
本课题受国家自然科学基金资助(基金编号39570750)
参考文献
, 百拇医药
1 McLoon SC, Lund RD. Loss of ganglion cells in fetal retina trasplanted to rat cortex. Brain Res, 1984, 314:131-135.
2 del Cerro M,Gash DM,Rao GN，et al. Intraocular retinal transplants.Invest Ophthalmol Vis Sci，1985, 26:1182-1185.
3 McLoon SC, Lund RD.Specific projections of retina transplanted to rat brain. Exp Brain Res, 1980, 40:273-282.
4 Mullen RJ,LaVail MM.Inherited retinal dystrophy: primary defect in pigment epithelium determined with experimental rat chimeras. Science，1976, 192: 799-801.
, 百拇医药
5 Tso M, Zhang C, Abler AS.Apoptosis leads to photo receptor degeneration in ingerited retinal dystophy of RCS rat. Invest Ophthalmol Vis Sci，1994, 35:2693-2699.
6 Ehinger B,Bergstrom A,Seiler M, et al. Ultrastructure of human retinal cell transplants with long survival times in rats. Exp Eye Res，1991, 53:447-460.
7 任佩贤，彭清，刘舒亚.小鼠视网膜神经上皮层同种异体移植的初步观察. 中华眼底病杂志，1996, 12：236-238.
(收稿：1998-11-05 修回：1999-08-05), 百拇医药
单位：100083 北京医科大学第三医院眼科
关键词：细胞移植；；方法；；动物；实验
鼠光感受器细胞层移植的方法及观察 【摘要】 目的 研究视锥和视杆细胞与周围组织间在解剖结构及病理生理等方面的关系。方法 取20只同龄Wistar和RCS鼠作为供体和受体，利用视网膜切削技术取得视锥及视杆细胞层，并植入RCS鼠眼视网膜下。术后2周时摘除术眼，于光镜下观察并摄影。结果 术后2周，在视网膜完全复位的受体眼，移植的纯视锥和视杆细胞成活，可见移植细胞位于视网膜下腔的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)及内颗粒层之间，并与正常对照的视细胞呈相同的染色特点。结论 成片视网膜移殖所制备的动物模型，其视锥和视杆细胞具有正常的解剖位置并与RPE及内颗粒层组织相接，为进一步研究重建视神经间的解剖学联系及视神经的生理活动，提供了一种新的途径。
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A study on transplantation of rat photoreceptor cell layer
WANG Wei, MA Meiyun, BAI Fang, et al. Department of Ophthalmology, Third Hospital of Beijing Medical University, Beijing 100083
【Abstract】 Objective To study the relationship between photoreceptors and other layers of the retina in the aspects of anatomical structure, physiology, pathology, etc.. Methods RCS rats were used as host animals, and the pure cone and rod layer of the donor retina was prepared from Wistar rat and was transplanted under the host retina where the cones and rods were degenerated. Results After 2 weeks of transplantation, the retinas of the host rats were reattached, and the transplanted cells were survival. The transplanted cells were in the subretinal space between the retinal pigment epithelium (RPE) and the inner unclear layer, and they had the staining characteristics similar to that of the normal control photoreceptos. Conclusion In the animal model of photoreceptor cell layer transplantation, the transplanted cells possess normal anatomical location and are connected with RPE and inner nuclear layer. The results provide a new route to investigate the re-establishment of anatomical association with the optic nerve and the physiological activity of the nerve.
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【Key words】 Cell transplantation Methods Animal，laboratory
视细胞(视锥、视杆细胞)的损伤，是造成视力丧失的直接原因。视细胞的生理及病理一直是临床研究的热点。视网膜移植技术的出现，为临床研究提供了一条新的途径。自80年代初，人们即发现可以将视网膜成功地移植到异体内。McLoon和Lund[1]尝试将胚胎视网膜移植入同种大鼠的脑组织中。del Cerro等[2]则完成了视网膜的眼内移植。但这些实践仅提供了视网膜全层组织的移植，未能得到视神经组织的确切解剖学对位，不能满足更深层的研究需求。我们于1997年利用视网膜移植技术制作纯视细胞层视网膜下移植动物模型，以期提供一种具有生理性解剖对位的动物模型，对其进行观察、探讨。
材料及方法
1.实验动物：供体Wistar鼠5只，体重约2 000 g；受体鼠选用RCS鼠(Royal College of Surgeons，RCS)10只，鼠龄为60天。均由北京医科大学实验动物部提供。对照组分3组，RCS鼠术眼的非移植部位为手术对照；RCS鼠非手术眼为未接受移植对照；供体Wistar鼠另眼为正常对照。
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2.试剂及仪器：细胞培养液；组织细胞振荡切削机(vibratome)；明胶(gelatin)；平衡盐溶液(BSS)；解剖显微镜。
3.手术方法：麻醉受体RCS鼠，术眼常规消毒，铺巾。取颞上方沿角膜缘的结膜切口，略向下分离暴露巩膜。用电止血器在相当于视网膜周边部烙一线样区后切开。小心将供体移植片移入移植器内，美蓝染色，移植器顶端加少量BSS，将移植器插入视网膜下，由助手轻推插芯，使移植物进入视网膜下。手术显微镜下见视网膜局部灰白色隆起，下方见蓝染的移植物。将结膜复位。眼睑间断缝合1针。视网膜板层片的移植：10只RCS鼠作为受体，其中双眼接受移植术者5只鼠，共15只眼。
4.视网膜板层片的制备：摘除Wistar鼠眼球，将眼球自锯齿缘处剪开做前、后节，清除视网膜表面的玻璃体，钝性剥离、游离视网膜。于5% 明胶漂浮，将视网膜平铺于30%明胶底托上，外核层在下，置BSS冰水浴内用振荡切削机进行切削。当切削视网膜过半后，将每次切削的视网膜组织置于载玻片上，于显微镜下观察，待镜下有散在的视细胞出现时，则明胶块上已切削到纯视细胞层(包括视锥、视杆层及外颗粒层)。将切削的纯细胞层及明胶底衬自明胶底托上切下，再按移植器的大小分割成小块，置于4°C细胞培养液中备用。随机选择2块置于DiI(1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethyl-indocarbocyanil perchlorate)溶液中浸泡1 h ，平衡盐溶液冲洗备用。
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5.移植器的制备：将透明胶片及硅胶做一中空可活动推芯的器械。其顶部略尖锐，使其可插入视网膜下。移植器约5 mm×3 mm×12 mm，也可根据受体眼球巩膜切口及移植片的大小而定。其内径光滑，勿使细胞与移植器直接接触。分别于术后2周时处死受体鼠，将眼球摘出，分别固定：(1)4% 甲醛溶液，3天后行酒精脱水，石蜡包埋，切片，片厚5～7 μm，HE染色，光学显微镜下观察；OPTON光学显微镜下摄影。(2)切成小块后置于4% 戊二醛溶液中4 h，磷酸缓冲液冲洗，置于锇酸中第2 次固定，75%～100%酒精逐级脱水，浸透，Epon 812包埋。半薄切片，片厚0.5～1.0 μm用甲苯胺蓝染色后，于光镜下观察并摄影。(3)DiI标识者固定后做冰冻切片，荧光显微镜下观察摄影。
结果
1.手术结果：术后2周，术眼均无感染。1/3的术眼可见晶体混浊，15只眼可找到移植的视细胞。其中12只眼视网膜在位，结构大致正常，视网膜下未见明胶存留，移植处视网膜未见出血等病变。2只眼视细胞未能植于正常部位，而分别被植于玻璃体内及脉络膜下，细胞呈团样生长；移植部位视网膜结构完全混乱，无原有结构。2例移植失败眼中，1例视网膜呈脱离状，视细胞移植片折叠，细胞形态与呈团样生长的视细胞相似。
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2.非移植鼠眼视网膜观察：正常对照Wistar鼠眼视网膜(图1)，光镜下见(0.5μm 树脂包埋切片)外颗粒层(ON)细胞核呈蓝紫色，排列密集。内颗粒层(IN)细胞核染色较淡，与RPE(P)细胞着染程度相同。RPE呈单层排列，核椭圆形，染色略深于胞浆。RCS鼠非手术眼及手术眼非移植部位此时视网膜外颗粒层、视锥杆层已完全萎缩消失，仅见个别细胞核深染(图2)。
图1 正常Wistar鼠对照眼视细胞层，P示RPE层，ON示外颗粒层，IN示内颗粒层 甲苯胺蓝染色×80
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3.移植视网膜观察：DiI标识位于受体视网膜内，呈亮红色(图3)。在移植视细胞部位的视网膜，可清楚的观察到新增加的视细胞层，即外颗粒层(图4)，其细胞大小及形态与对照组相似，位于RPE及内颗粒层之间。但移植视细胞层较薄，多数标本中仅有1～3层细胞核。在甲苯胺蓝染色中，细胞核呈深蓝色。视锥视杆层明显增厚(图4)。
图3 2周时冰冻切片，DiI标识位于受体视网膜内，荧光显微镜下呈亮红色 ×100
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图4 示术后2周时的移植部位，ON示新增加的外颗粒层，视细胞数量较少但排列整齐，IN示内颗粒层 甲苯胺蓝染色×80
4.移植眼RPE状态：RPE在大多数标本内仍为单层排列。部分区域排列欠规律。光镜下与移植的视细胞层外节相邻。在解剖学对位正确的移植标本中，Bruch 膜未见明显变化。
讨论
1.视网膜移植概念的引入：异体视网膜板层移植技术是80年代后的新兴课题。目前仅在美国等少数实验室取得成功。为进一步探索视网膜的病理生理特点开创了一条全新的路径。许多学者将视网膜移植到脑组织、玻璃体或其他组织内[1-3]，仅能证明视网膜移植成活，但均未能利用其探讨移植视网膜的形态。
2.模型动物的选择：我们建立了移植视网膜视细胞层解剖学正确对位的动物模型。首先考虑受体动物的选择，RCS鼠是视网膜色素变性的动物模型鼠，利用RCS鼠做为受体动物的优点是其生后固定期限内视网膜视细胞层全部萎缩[4]，节省了重复光损伤等动物模型的时间及经费，且RCS鼠的视网膜视细胞层有其特殊的研究价值[5],对于进一步研究视细胞及RPE相互间的作用，RPE发生凋亡的机制等具有重要的意义；其缺点：RCS鼠眼球小，虹膜呈粉色，无黑色素，手术操作及观察困难。可能在视细胞移植后的一定时间内又重新出现视细胞的退化。这一问题限制了移植术后动物的存活时间。因此，我们选择术后2 周进行观察 。但是正常的视细胞在RCS鼠的眼内环境下是否出现萎缩有待进一步研究。
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3.本实验设计的特点：Ehinger等[6]报道，将胚胎视网膜移植到异种视网膜下，并可见视细胞呈玫瑰花环样生长。任佩贤等[7]探讨了类似的问题，观察了同种异体小鼠视网膜移植后非正常对位状态下视网膜细胞的生长及其结构特点：(1)移植的视网膜为全部神经层，且在供体视网膜下成团状生长，与RPE间无正常的位置关系；(2)受体视网膜亦为全部神经层，无法接受供体的位置，其生长形态与将视网膜全部神经层植于玻璃体内或眼内其他部位者差异无显著性，其生长模式难于满足进一步研究视网膜移植的诸多问题。本研究的动物模型是利用RCS鼠视细胞的缺失，并制作了纯单视细胞层，移植于视网膜RPE与内颗粒层之间，希望重新建立视网膜10层结构的位置关系，为研究视网膜各层间神经的联接，神经递质的传导等提供可用的动物模型。
本课题受国家自然科学基金资助(基金编号39570750)
参考文献
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1 McLoon SC, Lund RD. Loss of ganglion cells in fetal retina trasplanted to rat cortex. Brain Res, 1984, 314:131-135.
2 del Cerro M,Gash DM,Rao GN，et al. Intraocular retinal transplants.Invest Ophthalmol Vis Sci，1985, 26:1182-1185.
3 McLoon SC, Lund RD.Specific projections of retina transplanted to rat brain. Exp Brain Res, 1980, 40:273-282.
4 Mullen RJ,LaVail MM.Inherited retinal dystrophy: primary defect in pigment epithelium determined with experimental rat chimeras. Science，1976, 192: 799-801.
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5 Tso M, Zhang C, Abler AS.Apoptosis leads to photo receptor degeneration in ingerited retinal dystophy of RCS rat. Invest Ophthalmol Vis Sci，1994, 35:2693-2699.
6 Ehinger B,Bergstrom A,Seiler M, et al. Ultrastructure of human retinal cell transplants with long survival times in rats. Exp Eye Res，1991, 53:447-460.
7 任佩贤，彭清，刘舒亚.小鼠视网膜神经上皮层同种异体移植的初步观察. 中华眼底病杂志，1996, 12：236-238.
(收稿：1998-11-05 修回：1999-08-05), 百拇医药