重氮乙酰丝氨酸诱导大鼠胰腺腺泡细胞癌癌前病变的实验研究
作者：徐 峰 曹 伟 寿楠海 姜希宏 徐克森
单位：徐 峰 寿楠海 姜希宏 徐克森 山东医科大学附属医院普外科(济南250012)；曹 伟 山东医科大学基础医学院药理学教研室
关键词：重氮乙酰丝氨酸；胰腺肿瘤；癌，腺泡细胞；DNA含量
肿瘤990613 中图分类号：R73-354 文章标识码：A 文章编号：1000-7431(1999)06-0358-03
胰腺腺泡细胞癌约占胰腺癌的10%～20%，早期诊断困难，治疗效果不佳，作者选用重氮乙酰丝氨酸(Azaserine)成功地建立了大鼠胰腺腺泡细胞癌癌前病变的动物模型，研究了该癌前病变的病理组织学、超微结构、DNA含量、倍体以及细胞周期等生物学特性，为进一步了解胰腺腺泡细胞癌的发生、发展和生物学特性提供了一种较好的模型。
, 百拇医药
材料和方法
一、实验动物及试剂 2周龄雄性Wistar大鼠，体重32.53 g±2.57 g，由山东医科大学实验动物中心提供。Azaserine等购自美国Sigma公司。
二、实验方法
(一)诱癌实验 大鼠随机分为2组，每组40只，均于2周龄时给药。Ⅰ组为生理盐水对照组，单次腹腔注射1 ml生理盐水；Ⅱ组为Azaserine组，单次腹腔注射溶于1 ml生理盐水的Azaserine 30 mg/kg体重。4月后处死所有大鼠，剖验各大鼠腹腔脏器，取出胰腺称重后，送病理和透射电镜检查。
(二)DNA含量检测 取少量新鲜胰腺组织，参照文献[1]介绍的方法，制备单细胞悬液，加入溴化乙啶染色液染色。应用FASCcan型流式细胞仪对样品进行测定。每份样品测试20 000个细胞，所得数据经随机软件分析计算出G0/G1期、S期、G2/M期细胞的构成比。细胞核DNA含量以DNA指数(DNA Index,DI)表示，DI=样品G0/G1峰均道值÷对照组织细胞G0/G1峰均道值。对照组为正常大鼠胰腺组织，规定DI=1±2CV即DI=1±0.1作为二倍体DNA含量的判断标准，此范围之外均为异倍体。根据细胞周期中各期细胞构成比，计算出细胞增殖指数(Proliferation Index,PI)，PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%，S期比例(S Phase Fraction ,SPF)，SPF=S/(G0/G1+S+G2/M)×100%。
, 百拇医药
(三)统计应用t检验、确切概率法处理数据。
结果
一、一般观察 实验过程中，Ⅰ组对照大鼠死亡1只，Ⅱ组死亡2只，均系大鼠间撕咬争斗致死，其余均良好生存至实验结束。实验开始6周后，与Ⅰ组大鼠相比，Ⅱ组大鼠开始出现性情急躁，易受惊吓，活动、摄食、饮水减少，体重减轻等变化。实验结束处死全部动物后，肉眼观察：Ⅰ组对照大鼠腹腔脏器无异常，Ⅱ组大鼠腹腔脏器也未见明显异常，但胰腺体积较对照组明显增大，部分大鼠胰腺可见散在分布的白色结节，其中5只大鼠结节直径约1.5 mm，12只大鼠结节直径约0.5 mm～1.0 mm。每只大鼠结节数自0～11个不等。Ⅰ组大鼠体重为513 g±43 g，胰腺重量1.25 g±0.14 g；Ⅱ组大鼠体重433 g±30 g，胰腺重量1.73 g±0.16 g。表明，Ⅱ组大鼠体重比Ⅰ组明显减轻(P<0.01)，胰腺重量明显增加(P<0.01)。
二、病理 光镜下对照组大鼠胰腺无异常发现，其外分泌部主要由大量的胰腺腺泡及其导管构成，腺泡由腺泡细胞组成，腺泡细胞呈锥形或柱形，细胞核圆形或椭圆形，位于细胞近基底部，核质清晰，核仁1～2个，常不明显，胞浆丰富，内含少量酶原颗粒，HE染色呈紫红色细颗粒状。
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Ⅱ组大鼠胰腺外分泌部组织结构紊乱，腺泡细胞发生重度不典型增生，排列紊乱，不形成腺泡结构；不典型增生的腺泡细胞聚集形成大小不一的结节，即胰腺腺泡细胞癌癌前病变AACN(Atypical Acinar Cellular Nodules)，发生率100%。AACN由十几到几十个细胞组成，细胞大小不一，形状不规则，呈三角形或多边形，细胞核明显增大，形状不规则。核仁明显，核染色质粗大，染色深，核浆比例失调，胞浆丰富。结节界限清楚或不清楚，间质内血管明显增生。每只大鼠所形成的AACN大小不一，数目不等，散布在整个胰腺中。
三、电镜观察 正常大鼠胰腺腺泡细胞呈锥体形或立方形，细胞界限清楚，侧缘较平直，腺泡腔清晰可见，管腔面可见少量短小的微绒毛。细胞核圆形，近基底部有1～2个较清楚的核仁，核膜完整，核膜下有一圈明显的异染色质，核膜孔分布均匀。胞质中粗面内质网较发达，规则排列成板层状或同心圆状。核糖体较多，高尔基体也较发达。线粒体较多，圆形或卵圆形，形态、结构正常，基质电子密度中等。胞质中散在分布少量中等电子密度的、成熟(基质深暗、界膜不清)或不成熟(基质浅淡、界膜清晰)的酶原颗粒，常有晕。
, 百拇医药
Ⅱ组大鼠胰腺腺泡细胞结构，均呈锥体形，腺泡腔消失，细胞间界限不清楚，可见紧密连接。细胞核明显增大畸形不规则，核膜凹陷，细胞浆深入核内形成“核袋”样结构。核膜孔分布不均匀，核内染色质增多、深染。粗面内质网排列不规则，失去板层状或同心圆状排列；线粒体嵴数目增加，电子密度降低。胞质中可见大量中等电子密度或高电子密度的酶原颗粒，有界膜，常无晕(见封三图5)。
四、DNA含量和细胞周期分析
(一)DNA含量和异倍体率 结果表明，Ⅰ组大鼠胰腺组织均为二倍体，Ⅱ组大鼠胰腺组织的异倍体率为55.3%，且DNA含量明显增加(P<0.01)(见表1)。
表1 DNA含量及倍体情况 组别
例数
DI值(
±s)
, 百拇医药
二倍体
异倍体
例数
百分数
例数
百分数
Ⅰ
39
1.00±0.07
39
100%
0
0%
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Ⅱ
38
1.65±0.64*
17
44.7%*
21
55.3%
注：与Ⅰ组相比，*P<0.01
(二)细胞周期分析 结果表明，与Ⅰ组相比，Ⅱ组大鼠S、G2/M、PI值均有显著性增加，P<0.01，而G0/G1则显著降低(见表2)。表2 细胞周期各时相分布和PI值(%，±s) 组别
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例数
G0/G1
S
G2/M
PI
Ⅰ
39
90.69±1.55
1.55±0.56
7.58±1.57
9.13±1.58
Ⅱ
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38
76.30±5.59*
8.65±1.59*
15.54±4.77*
23.71±5.19*
注：与Ⅰ组相比，*P<0.01
(三)DNA含量和SPF、PI值的关系 结果表明，与Ⅰ组相比，Ⅱ组二倍体大鼠DI值略增大，但无显著性差异，SPF、PI值均明显增大，P<0.01。Ⅱ组异倍体大鼠DI、SPF、PI值均明显增大，P<0.01(见表3)。
表3 DNA含量(±s)和SPF、PI值的关系(%，±s) 组别
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DNA倍体
例数
QI
SPF
PI
Ⅰ
二倍体
39
1.00±0.07
1.55±0.56
9.13±1.58
Ⅱ
二倍体
, 百拇医药
17
1.05±0.03
7.55±1.49*
23.36±5.21*
异倍体
21
1.87±0.48*
8.45±1.60*
24.00±6.00*
注：与Ⅰ组相比，*P<0.01讨论
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一、动物模型的建立 目前已有多种化学物质可用于建立胰腺腺泡细胞癌动物模型的实验性致癌剂，其中以重氮乙酰丝氨酸(Azaserine)应用最为广泛[2]。Azaserine是一种中性氨基酸，对胰腺具有高度亲和力。Longnecker等进行了深入细致的研究确定，选用远交系Wistar大鼠，于其胰腺DNA合成旺盛期(2，3或7周龄)时单次腹腔注射Azaserine 30 mg/kg，4个月即可诱发出胰腺腺泡细胞癌癌前病变AACN，6～8个月发展为腺瘤，13个月可形成腺泡细胞癌。
关于诱癌机制，多数研究认为Azaserine首先引起正常胰腺腺泡细胞DNA嘌呤或嘧啶的烷基化，导致N-糖苷键不稳定，造成DNA损伤，然后通过细胞增殖将这种改变固定下来，使正常腺泡细胞转变为潜伏性瘤细胞，这是一个特异性、不可逆的过程。潜伏性瘤细胞不断增殖形成了具有一定生物学及形态学特征的AACN，最终发展为腺泡细胞癌，这是一加速过程。
二、DNA含量测定与细胞增殖动力学
, 百拇医药
目前认为，DNA含量和倍体可以作为一个相对独立的直接反映细胞增殖能力和染色体数目、结构变化等生物学特性的指标。细胞在增殖过程中的不同阶段，核内DNA含量不同，一般来说，DNA含量变化发生在细胞形态变化之前，有人认为异倍体是判断癌前病变和恶性程度的标志之一。作者在实验中发现，对照组大鼠胰腺组织均为二倍体，而给予Azaserine的大鼠胰腺组织的DNA含量均明显增加，异倍体率较高，说明DNA含量和倍体确可反映癌前病变时期腺泡细胞生物学特性的变化。
从分子生物学来看，肿瘤的恶性程度与其增殖活性有关，细胞增殖速率与分化程度是肿瘤发生发展演变过程的决定因素。SPF、PI值是反映肿瘤生长及增殖活性的最佳指标，而且这种变化不仅发生在形态变化之前，也出现在DNA含量和倍体变化之前。本研究发现，对照组大鼠的胰腺处于相对静止状态，G0/G1期细胞百分率高达90.6%±1.5%，而处于增殖期的S期和G2/M期细胞百分率仅为9.1%±1.5%。给予Azaserine的大鼠其G0/G1期细胞比例显著降低，处于S期和G2/M期的细胞以及细胞增殖指数明显高于对照组，这与癌前病变时期细胞核内染色质增多核增大、核分裂增加等形态学表现相符合，同时说明，给予Azaserine使大鼠胰腺腺泡细胞的增殖能力大大增加。
, 百拇医药
图5 Azaserine组大鼠胰腺腺泡细胞的超微结构变化(×4800)
腺泡腔消失，细胞间界限不清，细胞核增大，粗面内质网排列不规则，线粒体嵴紊乱，基质空化，胞质中可见大量中等电子密度的酶原颗粒，有界膜，常无晕
作者简介：徐 峰，男，博士，主治医师。
参考文献
[1]Rugge M,Sonego F,Sessa F,et al.Nuclear DNA content and pathology in radically treated pancreatic carcinoma〔J〕.Cancer ,1996, 77(3):459
[1]徐 峰.外分泌胰腺癌动物模型〔J〕.国外医学外科学分册，1995，22(4)：208
(收稿日期：1998-02-16 修回日期：1998-05-05), 百拇医药
单位：徐 峰 寿楠海 姜希宏 徐克森 山东医科大学附属医院普外科(济南250012)；曹 伟 山东医科大学基础医学院药理学教研室
关键词：重氮乙酰丝氨酸；胰腺肿瘤；癌，腺泡细胞；DNA含量
肿瘤990613 中图分类号：R73-354 文章标识码：A 文章编号：1000-7431(1999)06-0358-03
胰腺腺泡细胞癌约占胰腺癌的10%～20%，早期诊断困难，治疗效果不佳，作者选用重氮乙酰丝氨酸(Azaserine)成功地建立了大鼠胰腺腺泡细胞癌癌前病变的动物模型，研究了该癌前病变的病理组织学、超微结构、DNA含量、倍体以及细胞周期等生物学特性，为进一步了解胰腺腺泡细胞癌的发生、发展和生物学特性提供了一种较好的模型。
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材料和方法
一、实验动物及试剂 2周龄雄性Wistar大鼠，体重32.53 g±2.57 g，由山东医科大学实验动物中心提供。Azaserine等购自美国Sigma公司。
二、实验方法
(一)诱癌实验 大鼠随机分为2组，每组40只，均于2周龄时给药。Ⅰ组为生理盐水对照组，单次腹腔注射1 ml生理盐水；Ⅱ组为Azaserine组，单次腹腔注射溶于1 ml生理盐水的Azaserine 30 mg/kg体重。4月后处死所有大鼠，剖验各大鼠腹腔脏器，取出胰腺称重后，送病理和透射电镜检查。
(二)DNA含量检测 取少量新鲜胰腺组织，参照文献[1]介绍的方法，制备单细胞悬液，加入溴化乙啶染色液染色。应用FASCcan型流式细胞仪对样品进行测定。每份样品测试20 000个细胞，所得数据经随机软件分析计算出G0/G1期、S期、G2/M期细胞的构成比。细胞核DNA含量以DNA指数(DNA Index,DI)表示，DI=样品G0/G1峰均道值÷对照组织细胞G0/G1峰均道值。对照组为正常大鼠胰腺组织，规定DI=1±2CV即DI=1±0.1作为二倍体DNA含量的判断标准，此范围之外均为异倍体。根据细胞周期中各期细胞构成比，计算出细胞增殖指数(Proliferation Index,PI)，PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%，S期比例(S Phase Fraction ,SPF)，SPF=S/(G0/G1+S+G2/M)×100%。
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(三)统计应用t检验、确切概率法处理数据。
结果
一、一般观察 实验过程中，Ⅰ组对照大鼠死亡1只，Ⅱ组死亡2只，均系大鼠间撕咬争斗致死，其余均良好生存至实验结束。实验开始6周后，与Ⅰ组大鼠相比，Ⅱ组大鼠开始出现性情急躁，易受惊吓，活动、摄食、饮水减少，体重减轻等变化。实验结束处死全部动物后，肉眼观察：Ⅰ组对照大鼠腹腔脏器无异常，Ⅱ组大鼠腹腔脏器也未见明显异常，但胰腺体积较对照组明显增大，部分大鼠胰腺可见散在分布的白色结节，其中5只大鼠结节直径约1.5 mm，12只大鼠结节直径约0.5 mm～1.0 mm。每只大鼠结节数自0～11个不等。Ⅰ组大鼠体重为513 g±43 g，胰腺重量1.25 g±0.14 g；Ⅱ组大鼠体重433 g±30 g，胰腺重量1.73 g±0.16 g。表明，Ⅱ组大鼠体重比Ⅰ组明显减轻(P<0.01)，胰腺重量明显增加(P<0.01)。
二、病理 光镜下对照组大鼠胰腺无异常发现，其外分泌部主要由大量的胰腺腺泡及其导管构成，腺泡由腺泡细胞组成，腺泡细胞呈锥形或柱形，细胞核圆形或椭圆形，位于细胞近基底部，核质清晰，核仁1～2个，常不明显，胞浆丰富，内含少量酶原颗粒，HE染色呈紫红色细颗粒状。
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Ⅱ组大鼠胰腺外分泌部组织结构紊乱，腺泡细胞发生重度不典型增生，排列紊乱，不形成腺泡结构；不典型增生的腺泡细胞聚集形成大小不一的结节，即胰腺腺泡细胞癌癌前病变AACN(Atypical Acinar Cellular Nodules)，发生率100%。AACN由十几到几十个细胞组成，细胞大小不一，形状不规则，呈三角形或多边形，细胞核明显增大，形状不规则。核仁明显，核染色质粗大，染色深，核浆比例失调，胞浆丰富。结节界限清楚或不清楚，间质内血管明显增生。每只大鼠所形成的AACN大小不一，数目不等，散布在整个胰腺中。
三、电镜观察 正常大鼠胰腺腺泡细胞呈锥体形或立方形，细胞界限清楚，侧缘较平直，腺泡腔清晰可见，管腔面可见少量短小的微绒毛。细胞核圆形，近基底部有1～2个较清楚的核仁，核膜完整，核膜下有一圈明显的异染色质，核膜孔分布均匀。胞质中粗面内质网较发达，规则排列成板层状或同心圆状。核糖体较多，高尔基体也较发达。线粒体较多，圆形或卵圆形，形态、结构正常，基质电子密度中等。胞质中散在分布少量中等电子密度的、成熟(基质深暗、界膜不清)或不成熟(基质浅淡、界膜清晰)的酶原颗粒，常有晕。
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Ⅱ组大鼠胰腺腺泡细胞结构，均呈锥体形，腺泡腔消失，细胞间界限不清楚，可见紧密连接。细胞核明显增大畸形不规则，核膜凹陷，细胞浆深入核内形成“核袋”样结构。核膜孔分布不均匀，核内染色质增多、深染。粗面内质网排列不规则，失去板层状或同心圆状排列；线粒体嵴数目增加，电子密度降低。胞质中可见大量中等电子密度或高电子密度的酶原颗粒，有界膜，常无晕(见封三图5)。
四、DNA含量和细胞周期分析
(一)DNA含量和异倍体率 结果表明，Ⅰ组大鼠胰腺组织均为二倍体，Ⅱ组大鼠胰腺组织的异倍体率为55.3%，且DNA含量明显增加(P<0.01)(见表1)。
表1 DNA含量及倍体情况 组别
例数
DI值(
±s), 百拇医药
二倍体
异倍体
例数
百分数
例数
百分数
Ⅰ
39
1.00±0.07
39
100%
0
0%
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Ⅱ
38
1.65±0.64*
17
44.7%*
21
55.3%
注：与Ⅰ组相比，*P<0.01
(二)细胞周期分析 结果表明，与Ⅰ组相比，Ⅱ组大鼠S、G2/M、PI值均有显著性增加，P<0.01，而G0/G1则显著降低(见表2)。表2 细胞周期各时相分布和PI值(%，
±s) 组别, http://www.100md.com
例数
G0/G1
S
G2/M
PI
Ⅰ
39
90.69±1.55
1.55±0.56
7.58±1.57
9.13±1.58
Ⅱ
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38
76.30±5.59*
8.65±1.59*
15.54±4.77*
23.71±5.19*
注：与Ⅰ组相比，*P<0.01
(三)DNA含量和SPF、PI值的关系 结果表明，与Ⅰ组相比，Ⅱ组二倍体大鼠DI值略增大，但无显著性差异，SPF、PI值均明显增大，P<0.01。Ⅱ组异倍体大鼠DI、SPF、PI值均明显增大，P<0.01(见表3)。
表3 DNA含量(
±s)和SPF、PI值的关系(%，±s) 组别, http://www.100md.com
DNA倍体
例数
QI
SPF
PI
Ⅰ
二倍体
39
1.00±0.07
1.55±0.56
9.13±1.58
Ⅱ
二倍体
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17
1.05±0.03
7.55±1.49*
23.36±5.21*
异倍体
21
1.87±0.48*
8.45±1.60*
24.00±6.00*
注：与Ⅰ组相比，*P<0.01讨论
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一、动物模型的建立 目前已有多种化学物质可用于建立胰腺腺泡细胞癌动物模型的实验性致癌剂，其中以重氮乙酰丝氨酸(Azaserine)应用最为广泛[2]。Azaserine是一种中性氨基酸，对胰腺具有高度亲和力。Longnecker等进行了深入细致的研究确定，选用远交系Wistar大鼠，于其胰腺DNA合成旺盛期(2，3或7周龄)时单次腹腔注射Azaserine 30 mg/kg，4个月即可诱发出胰腺腺泡细胞癌癌前病变AACN，6～8个月发展为腺瘤，13个月可形成腺泡细胞癌。
关于诱癌机制，多数研究认为Azaserine首先引起正常胰腺腺泡细胞DNA嘌呤或嘧啶的烷基化，导致N-糖苷键不稳定，造成DNA损伤，然后通过细胞增殖将这种改变固定下来，使正常腺泡细胞转变为潜伏性瘤细胞，这是一个特异性、不可逆的过程。潜伏性瘤细胞不断增殖形成了具有一定生物学及形态学特征的AACN，最终发展为腺泡细胞癌，这是一加速过程。
二、DNA含量测定与细胞增殖动力学
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目前认为，DNA含量和倍体可以作为一个相对独立的直接反映细胞增殖能力和染色体数目、结构变化等生物学特性的指标。细胞在增殖过程中的不同阶段，核内DNA含量不同，一般来说，DNA含量变化发生在细胞形态变化之前，有人认为异倍体是判断癌前病变和恶性程度的标志之一。作者在实验中发现，对照组大鼠胰腺组织均为二倍体，而给予Azaserine的大鼠胰腺组织的DNA含量均明显增加，异倍体率较高，说明DNA含量和倍体确可反映癌前病变时期腺泡细胞生物学特性的变化。
从分子生物学来看，肿瘤的恶性程度与其增殖活性有关，细胞增殖速率与分化程度是肿瘤发生发展演变过程的决定因素。SPF、PI值是反映肿瘤生长及增殖活性的最佳指标，而且这种变化不仅发生在形态变化之前，也出现在DNA含量和倍体变化之前。本研究发现，对照组大鼠的胰腺处于相对静止状态，G0/G1期细胞百分率高达90.6%±1.5%，而处于增殖期的S期和G2/M期细胞百分率仅为9.1%±1.5%。给予Azaserine的大鼠其G0/G1期细胞比例显著降低，处于S期和G2/M期的细胞以及细胞增殖指数明显高于对照组，这与癌前病变时期细胞核内染色质增多核增大、核分裂增加等形态学表现相符合，同时说明，给予Azaserine使大鼠胰腺腺泡细胞的增殖能力大大增加。
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图5 Azaserine组大鼠胰腺腺泡细胞的超微结构变化(×4800)
腺泡腔消失，细胞间界限不清，细胞核增大，粗面内质网排列不规则，线粒体嵴紊乱，基质空化，胞质中可见大量中等电子密度的酶原颗粒，有界膜，常无晕
作者简介：徐 峰，男，博士，主治医师。
参考文献
[1]Rugge M,Sonego F,Sessa F,et al.Nuclear DNA content and pathology in radically treated pancreatic carcinoma〔J〕.Cancer ,1996, 77(3):459
[1]徐 峰.外分泌胰腺癌动物模型〔J〕.国外医学外科学分册，1995，22(4)：208
(收稿日期：1998-02-16 修回日期：1998-05-05), 百拇医药