青椒碱对DEN诱发大鼠肝癌抑制作用的流式细胞光度术分析
作者：白锦雯 张颖 吴菁
单位：北京中医药大学组织胚胎学教研室 北京100029
关键词：DNA；流式细胞仪；二乙基亚硝胺；肝癌细胞;青椒碱
北京中医药大学学报990613 摘要：用二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌为动物模型，采用流式细胞术(FCM)观察中药青椒碱对肝细胞DNA合成的影响。实验结果表明治疗组S期细胞数较模型组明显减少，而G1期细胞增多，说明青椒碱可阻止癌前病变肝细胞由G1期向S期进程，使其DNA合成受到抑制，阻止细胞分裂，从而对实验性肝癌起到治疗作用。
Flow Cytometric Analysis of the Schinifoline's Inhibition
on Rat Hepatoma Cell Induced by DEN
, 百拇医药
Bai Jinwen (白锦雯), Zhang Ying(张 颖), Wu Jing (吴 菁)
(Beijing University of Traditioanl Chinese Medicine, Beijing 100029)
ABSTRACT：In this paper, rat hepatoma was induced by diethylnitrosamine(DEN). The effects of schinifoline on DNA synthesis in hepatoma cell was observed by means of Flow Cytometry. It was showed that schinifoline could help to relieve the cell's quantity on S phase and increase it during G1 phase to S phase. So, schinifoline can treat experimental hepatocarcinogenisis by inhibiting hepatoma cell's DNA synthesis and preventing the cytodiaeresis.
, 百拇医药
KEY WORDS: DNA; Flow Cytometry; Diethylnitrosamine; Hepatoma Cell; Schinifoline
本实验所用中药青椒碱是从芸香科青花椒的果皮经氯仿抽提的中性成分，其内含有四喹啉酮类结构的化学成分，该类化合物具有抗肿瘤作用[1]。以往的实验证明，青椒碱对肝癌细胞有一定的阻抑作用和逆转作用。为进一步探讨上述作用机理，我们收集各实验组动物肝脏分离肝细胞，应用流式细胞术(FCM)分析青椒碱对癌前病变肝细胞DNA合成和细胞周期的影响。
1 材料与方法
1.1 动物
Wistar大鼠15只，雌雄兼用，购于中国中医研究院动物室。
1.2 药物
, 百拇医药
青椒碱，由北京中医药大学中药学院中药化学教研室提供。用1%羧甲基纤维素(CMC)配成2%混悬液。
1.3 动物分组与肝癌动物模型的复制
将大鼠随机分为对照、诱癌和治疗3个组。对照组不做任何处理。诱癌组与治疗组分别于第1天经腹腔一次性注射致癌启动剂二乙基亚硝胺(DEN，Sigma公司制品，配制成1%DEN生理盐水溶液)200 mg/kg体重，10 d后第1次口服促癌剂50%CCl4橄榄油溶液2 mL/kg体重，隔3 d第2次口服CCl4。于实验第4周起自由饮服0.05%苯巴比妥水溶液30 d，治疗组同时每日灌服青椒碱200 mg/kg体重，共20 d。第16周取材进行肝细胞分离。
1.4 肝细胞的分离、纯化
大鼠经腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，暴露肝脏，门静脉插管，在无菌条件下以恒温灌流泵先后灌注冲洗液和0.05%Ι型胶原酶溶液各10 min，按Seglen改良法分离肝细胞[2]。
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1.5 流式细胞仪检测各组肝细胞周期时相变化
向装有分离纯化肝细胞的试管内加入3～4 mL无Ca2+、Mg2+PBS液，离心3 min。弃去上清，约留0.5 mL细胞悬液，振荡使细胞分散。用移液管将细胞迅速注入4℃70%冷乙醇中，置4℃冰箱固定至少18 h。调整上述细胞悬液浓度至109L-1，加入RNA酶A(每样品50 mg/L)，37℃水浴中孵育30 min后，立即放入冰箱中，终止RNA酶的作用。加入碘化丙啶(50 mg/L)，进行DNA染色，并以人末梢血淋巴细胞作为内参标准，上机前以尼龙网过滤。BECTON FACS420流式细胞仪测定单个细胞DNA含量，得出细胞周期的百分比，t检验统计分析。
2 结果
从细胞频率对于DNA相对含量的组方图可以看出，正常大鼠肝脏中含有三种具有不同DNA含量倍体水平的肝细胞群体。第一个峰为二倍体(2C)DNA含量，第二个峰是四倍体(4C)DNA含量细胞群(G1/G0期细胞)，第三个峰为八倍体(8C)DNA含量的细胞群，第二与第三峰之间是S期，为4C～8C的DNA含量细胞群。结果显示，正常大鼠肝脏以4C肝细胞群体为主，2C及8C肝细胞均较少。该结果与其他研究者的结果是一致的[3]。模型组肝细胞DNA含量发生明显改变，主要表现在G1期与S期。4C(G1期)肝细胞比例下降，4C～8C间(S期)的肝细胞明显增多，与对照组相比有显著差异。治疗组G1期肝细胞比例有所回升，S期肝细胞数目明显减少，与模型组相比有显著差异(见表1)。
, 百拇医药
表1 G1/G0期及S期各组肝细胞百分率的变化 (x±s)
组别
n
G1/G0
S
对照组
5
71.70±2.35
4.20±0.50
模型组
5
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57.87±2.06△
13.90±0.80△△
治疗组
5
64.13±1.46***
6.07±1.05****
与对照组比较△P<0.05 △△P<0.01；与模型组比较***P<0.05 ****P<0.01
3 讨论
DNA是细胞繁殖遗传的物质基础，肿瘤细胞快速增长和分裂，其DNA含量增高程度可视为反映肿瘤细胞增殖能力的重要指标[3]。细胞增殖是通过细胞周期来实现的。我们以往的工作已证明中药青椒碱对实验性癌前病变肝细胞有一定的逆转作用[4，5]。
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本实验用FCM的DNA分析技术探索青椒碱的抗癌机制，实验结果显示肝细胞在正常状态下，绝大多数处于G0期[6]。模型组经DEN启动癌变后，CCl4和苯巴比妥作为促癌剂使得处于G1/G0期的肝细胞进入S期，G1期细胞数减少，S期细胞数明显高于对照组，提示其DNA合成旺盛。实验结果还显示，经中药青椒碱治疗后的S期细胞较模型组明显减少，而G1/G0期细胞增多，说明青椒碱可以阻止肝细胞从G1期向S期进程，使DNA合成受到抑制和阻断，造成G1期细胞的堆积。一般认为，G1期物质代谢活跃，细胞体积增大，进行RNA和蛋白质合成，与DNA合成启动有关，是调控细胞增殖的重要环节。G1期可能存在一限制点(R点)，细胞处于不利条件时就停止在R点，则细胞无法从G1期进入S期[6]。已有学者论述，如细胞被阻断在G1期，更能有效地控制肿瘤的增殖[7]。因而我们认为抑制DNA合成，阻止细胞分裂，是青椒碱的抗癌作用机理之一。
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*国家自然科学基金资助项目，课题号：39370843
作者简介：白锦雯，女，35岁，医学硕士，讲师。
参考文献
1 刘锁兰，魏璐雪.青花椒化学成分的研究.化学学报，1991，26(1)：836
2 Seglen PO.Preparation of isolated rat liver cells. In：Prescott DM. Methods in Cell Biology.New York：Academic Press，1987.29～83
3 丛文铭，吴孟超，张秀忠.肝癌细胞核DNA含量的定量测定及其临床意义.第二军医大学学报，1988，9(2)：108
4 叶百宽，张颖，何基渊，等.青椒碱对大鼠肝癌细胞逆转影响的实验研究.北京中医药大学学报，1996，19(增刊)：32～35
5 白锦雯，张 颖，赵丽云，等.青椒碱对DEN诱发大鼠肝癌治疗作用的研究——原代培养肝细胞组化定量观察.北京中医药大学学报，1996，19(增刊)：29～31
6 汪堃仁.细胞生物学.北京：北京师范大学出版社，1990.389
7 杨兼辉.细胞动力学与肿瘤药物治疗.见：朱世能主编.肿瘤基础理论.上海：上海科学技术出版社，1986.177
(收稿日期：1999-04-12), 百拇医药
单位：北京中医药大学组织胚胎学教研室 北京100029
关键词：DNA；流式细胞仪；二乙基亚硝胺；肝癌细胞;青椒碱
北京中医药大学学报990613 摘要：用二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌为动物模型，采用流式细胞术(FCM)观察中药青椒碱对肝细胞DNA合成的影响。实验结果表明治疗组S期细胞数较模型组明显减少，而G1期细胞增多，说明青椒碱可阻止癌前病变肝细胞由G1期向S期进程，使其DNA合成受到抑制，阻止细胞分裂，从而对实验性肝癌起到治疗作用。
Flow Cytometric Analysis of the Schinifoline's Inhibition
on Rat Hepatoma Cell Induced by DEN
, 百拇医药
Bai Jinwen (白锦雯), Zhang Ying(张 颖), Wu Jing (吴 菁)
(Beijing University of Traditioanl Chinese Medicine, Beijing 100029)
ABSTRACT：In this paper, rat hepatoma was induced by diethylnitrosamine(DEN). The effects of schinifoline on DNA synthesis in hepatoma cell was observed by means of Flow Cytometry. It was showed that schinifoline could help to relieve the cell's quantity on S phase and increase it during G1 phase to S phase. So, schinifoline can treat experimental hepatocarcinogenisis by inhibiting hepatoma cell's DNA synthesis and preventing the cytodiaeresis.
, 百拇医药
KEY WORDS: DNA; Flow Cytometry; Diethylnitrosamine; Hepatoma Cell; Schinifoline
本实验所用中药青椒碱是从芸香科青花椒的果皮经氯仿抽提的中性成分，其内含有四喹啉酮类结构的化学成分，该类化合物具有抗肿瘤作用[1]。以往的实验证明，青椒碱对肝癌细胞有一定的阻抑作用和逆转作用。为进一步探讨上述作用机理，我们收集各实验组动物肝脏分离肝细胞，应用流式细胞术(FCM)分析青椒碱对癌前病变肝细胞DNA合成和细胞周期的影响。
1 材料与方法
1.1 动物
Wistar大鼠15只，雌雄兼用，购于中国中医研究院动物室。
1.2 药物
, 百拇医药
青椒碱，由北京中医药大学中药学院中药化学教研室提供。用1%羧甲基纤维素(CMC)配成2%混悬液。
1.3 动物分组与肝癌动物模型的复制
将大鼠随机分为对照、诱癌和治疗3个组。对照组不做任何处理。诱癌组与治疗组分别于第1天经腹腔一次性注射致癌启动剂二乙基亚硝胺(DEN，Sigma公司制品，配制成1%DEN生理盐水溶液)200 mg/kg体重，10 d后第1次口服促癌剂50%CCl4橄榄油溶液2 mL/kg体重，隔3 d第2次口服CCl4。于实验第4周起自由饮服0.05%苯巴比妥水溶液30 d，治疗组同时每日灌服青椒碱200 mg/kg体重，共20 d。第16周取材进行肝细胞分离。
1.4 肝细胞的分离、纯化
大鼠经腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，暴露肝脏，门静脉插管，在无菌条件下以恒温灌流泵先后灌注冲洗液和0.05%Ι型胶原酶溶液各10 min，按Seglen改良法分离肝细胞[2]。
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1.5 流式细胞仪检测各组肝细胞周期时相变化
向装有分离纯化肝细胞的试管内加入3～4 mL无Ca2+、Mg2+PBS液，离心3 min。弃去上清，约留0.5 mL细胞悬液，振荡使细胞分散。用移液管将细胞迅速注入4℃70%冷乙醇中，置4℃冰箱固定至少18 h。调整上述细胞悬液浓度至109L-1，加入RNA酶A(每样品50 mg/L)，37℃水浴中孵育30 min后，立即放入冰箱中，终止RNA酶的作用。加入碘化丙啶(50 mg/L)，进行DNA染色，并以人末梢血淋巴细胞作为内参标准，上机前以尼龙网过滤。BECTON FACS420流式细胞仪测定单个细胞DNA含量，得出细胞周期的百分比，t检验统计分析。
2 结果
从细胞频率对于DNA相对含量的组方图可以看出，正常大鼠肝脏中含有三种具有不同DNA含量倍体水平的肝细胞群体。第一个峰为二倍体(2C)DNA含量，第二个峰是四倍体(4C)DNA含量细胞群(G1/G0期细胞)，第三个峰为八倍体(8C)DNA含量的细胞群，第二与第三峰之间是S期，为4C～8C的DNA含量细胞群。结果显示，正常大鼠肝脏以4C肝细胞群体为主，2C及8C肝细胞均较少。该结果与其他研究者的结果是一致的[3]。模型组肝细胞DNA含量发生明显改变，主要表现在G1期与S期。4C(G1期)肝细胞比例下降，4C～8C间(S期)的肝细胞明显增多，与对照组相比有显著差异。治疗组G1期肝细胞比例有所回升，S期肝细胞数目明显减少，与模型组相比有显著差异(见表1)。
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表1 G1/G0期及S期各组肝细胞百分率的变化 (x±s)
组别
n
G1/G0
S
对照组
5
71.70±2.35
4.20±0.50
模型组
5
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57.87±2.06△
13.90±0.80△△
治疗组
5
64.13±1.46***
6.07±1.05****
与对照组比较△P<0.05 △△P<0.01；与模型组比较***P<0.05 ****P<0.01
3 讨论
DNA是细胞繁殖遗传的物质基础，肿瘤细胞快速增长和分裂，其DNA含量增高程度可视为反映肿瘤细胞增殖能力的重要指标[3]。细胞增殖是通过细胞周期来实现的。我们以往的工作已证明中药青椒碱对实验性癌前病变肝细胞有一定的逆转作用[4，5]。
, http://www.100md.com
本实验用FCM的DNA分析技术探索青椒碱的抗癌机制，实验结果显示肝细胞在正常状态下，绝大多数处于G0期[6]。模型组经DEN启动癌变后，CCl4和苯巴比妥作为促癌剂使得处于G1/G0期的肝细胞进入S期，G1期细胞数减少，S期细胞数明显高于对照组，提示其DNA合成旺盛。实验结果还显示，经中药青椒碱治疗后的S期细胞较模型组明显减少，而G1/G0期细胞增多，说明青椒碱可以阻止肝细胞从G1期向S期进程，使DNA合成受到抑制和阻断，造成G1期细胞的堆积。一般认为，G1期物质代谢活跃，细胞体积增大，进行RNA和蛋白质合成，与DNA合成启动有关，是调控细胞增殖的重要环节。G1期可能存在一限制点(R点)，细胞处于不利条件时就停止在R点，则细胞无法从G1期进入S期[6]。已有学者论述，如细胞被阻断在G1期，更能有效地控制肿瘤的增殖[7]。因而我们认为抑制DNA合成，阻止细胞分裂，是青椒碱的抗癌作用机理之一。
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*国家自然科学基金资助项目，课题号：39370843
作者简介：白锦雯，女，35岁，医学硕士，讲师。
参考文献
1 刘锁兰，魏璐雪.青花椒化学成分的研究.化学学报，1991，26(1)：836
2 Seglen PO.Preparation of isolated rat liver cells. In：Prescott DM. Methods in Cell Biology.New York：Academic Press，1987.29～83
3 丛文铭，吴孟超，张秀忠.肝癌细胞核DNA含量的定量测定及其临床意义.第二军医大学学报，1988，9(2)：108
4 叶百宽，张颖，何基渊，等.青椒碱对大鼠肝癌细胞逆转影响的实验研究.北京中医药大学学报，1996，19(增刊)：32～35
5 白锦雯，张 颖，赵丽云，等.青椒碱对DEN诱发大鼠肝癌治疗作用的研究——原代培养肝细胞组化定量观察.北京中医药大学学报，1996，19(增刊)：29～31
6 汪堃仁.细胞生物学.北京：北京师范大学出版社，1990.389
7 杨兼辉.细胞动力学与肿瘤药物治疗.见：朱世能主编.肿瘤基础理论.上海：上海科学技术出版社，1986.177
(收稿日期：1999-04-12), 百拇医药