益气养血保元方对体外培养人肺癌细胞增殖的影响*
作者：陈 葳 程小丽 周冬枝 杨玉琮 张玉五
单位：陈 葳 程小丽 周冬枝 杨玉琮 张玉五(西安医科大学第一附属医院 西安 710061)
关键词：益气养血保元方；肺腺癌；细胞株；细胞周期；Ki67
摘 要 目的 通过益气养血保元方对培养人肺癌A549细胞生长的研究 摘 要 目的 通过益气养血保元方对培养人肺癌A549细胞生长的研究，证实该方对肺癌细胞增殖的影响。方法 采用噻唑蓝法测定药物对细胞的抑制作用，流式细胞术检测细胞周期和Ki167的表达。结果 发现益气养血保元方能抑制A549细胞的生长，IC50为0.50mg/ml。该药对A549细胞周期有影响，24h与48h均有S期细胞百分比增加趋势，Ki67表达明显降低。结论 益气养血保元方是通过干扰细胞周期而达到抑制细胞生长目的的。
肺癌发病率、病死率高，目前临床尚无理想的治疗方法。益气养血保元方是由黄芪、沙苑子、女贞子、丹参等组成，临床观察其对肿瘤病人有一定的疗效[1]，能增加荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞的功能[2]。本实验运用MTT法及流式细胞术分析其对人肺腺癌A549细胞增殖的影响。
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材料与方法
1 细胞株
A549是一贴壁生长，可持续传代的人肺腺癌细胞株，由本室保存。
2 药物
益气养血保元方由黄芪、沙苑子、女贞子、丹参等组成，由本院中医科按水煎醇沉法制备成制剂，生药含量为30mg/ml，pH7.0，灭菌冷藏备用。
3 培养基PRMI1640培养液(Gibco产品)
加10%新生小牛血清，青链霉素各100u/ml。
4 MTT(噻唑蓝)法测定药物抑制肿瘤作用
在96孔板中接种A549细胞5×104/ml37℃，5%CO2培养24h。采用直接加入法将药物分成8个浓度梯度，每个剂量设四个平行孔。于37℃，5%CO2培养48h，然后每孔加入50ulMTT(2mg/ml)同样条件培养4h，倾上清，每孔加入150ul二甲基亚砜(DMSO)，振荡混匀，酶标570nm检测OD值。
, 百拇医药
5 细胞周期分析
取药物作用48h的培养细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，PI(碘化丙啶)染色，流式细胞仪(Coulter)分析。
6 Ki67检测
取2×106药物处理48h的细胞，采用FITC标记的Ki67单克隆抗体(Dako公司)标记，流式细胞仪测定Ki67阳性细胞所占百分含量。
结果
1 益气养血保元方对A549细胞生长的影响
表1 益气养血保元方对A549生长的影响
浓度(mg/ml)
例数
, 百拇医药
(n)
OD
(
±s)
抑制率
(%)
0
8
1.394±0.101
0.008
8
1.303±0.052
, 百拇医药
6.52
0.016
8
1.252±0.094
10.19
0.032
8
1.207±0.020
13.41
0.064
8
1.061±0.046
23.89
, 百拇医药
0.128
8
0.927±0.038
33.51
0.256
8
0.820±0.044
41.18
0.512
8
0.679±0.020
51.29
1.024
, 百拇医药
8
0.239±0.008
82.86
表中可看出，益气养血保元方对人肺腺癌A549细胞有明显的抑制作用，并且有明确的量效关系，IC50为0.50mg/ml。
2 益气养血保元方对A549细胞周期的影响
表2 益气养血保元方对细胞周期的影响
组别
G0/G1
S
G2/M
例数(n)
, 百拇医药
对照组
81.87±0.71
11.25±0.68
6.95±1.06
9
Y0.25mg/ml
80.18±0.73**
9.90±0.46**
9.93±0.43**
9
Y0.50mg/ml
, 百拇医药
48.43±0.78**
47.72±4.00**
3.95±3.39*
9
注：与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。
表2可见，益气养血保元方处理的A549细胞，由于药物浓度的不同而有所不同。0.25mg/ml时，S期细胞百分比较对照组略有增加，而G2/M期细胞较对照组明显增加。而当0.50mg/ml时，出现明显的S期细胞百分比增加，G0/G1期及G2/M期细胞减少。
3 益气养血保元方对A549细胞Ki67表达的影响
表3 益气养血保元方对Ki67表达的影响
, http://www.100md.com
组别
例数(n)
Ki67阳性率(%)
对照组
6
17.4±1.02
Y0.25mg/ml
6
14.6±0.85**
Y0.50mg/ml
6
5.5±0.43**
, http://www.100md.com
注：与对照组比较：**P<0.01。
不同浓度的益气养血保元方作用的A549细胞Ki67的表达均有降低，并且有显著性的差别。
讨论
细胞从一次分裂结束到下一次分裂结束为一个周期，其中S期是细胞增殖周期中反映DNA复制的阶段。本研究采用流式细胞术分析了药物作用对A549细胞周期的影响，发现0.50mg/ml组S期细胞百分比明显增加，由对照组11.25%增加到47.70%，同时G0/G1期及G2/M期细胞减少，表明益气养血保元方有干扰细胞周期的作用。
目前检测增细胞核抗原的指标较多，其中主要有增殖细胞核抗原(PCNA)，DNA多聚酶及Ki67。Ki67单克隆抗体是针对处于增殖周期的人类细胞核抗原的抗体，其表达的强弱与细胞增殖程度呈正相关。Ki67抗原存在于细胞周期的G1、S、G2期，至分裂晚期Ki67抗原迅速消失，G0期无Ki67抗原的表达，Ki67抗原的半衰期短，细胞脱离增殖周期后迅速被降解，其检测的可靠性明显优于半衰期长的PCNA[3]。原发性肺癌PCNA的表达强弱与患者的生存期呈负相关，PCNA高表达的肺癌具有更高的侵袭力，预后差[4]。益气养血保元方作用的A549细胞虽然S期细胞百分比明显升高，G2/M期细胞减少，但从细胞周期分布图可以看出，大多数处于S期的细胞却不表达Ki67，提示益气养血保元可能使A549细胞发生周期阻滞，使其不表达Ki67。有研究表明益肺抗瘤饮在体外可抑制LAX-83人肺腺癌细胞的增殖，药物组Ki67的阳性率明显低于空白对照组[5]。
, 百拇医药
本研究表明，益气养血保元方对体外培养的人肺癌A549细胞确有抑制生长的作用，IC50为0.50mg/ml。它可能是通过干扰肿瘤细胞的细胞周期而达到抑制其增殖的目的。
* 陕西省自然科学基金资助课题
作者简介：陈葳，女，35岁，助理研究员。现在西安医科大学第一附属医院临床分子生物学中心。主要研究方向：肿瘤细胞与分子生物学。
参考文献
1.周小娟，等.益气养血保元胶囊配合化疗治疗恶性肿瘤167例临床观察.陕西中医 1996；5：87
2.张玉五，等.益气养血保元方对恶性肿瘤患者生存质量及小鼠巨噬细胞活性的影响.现代中医 1990；2：49
3.Getdes J,et al.Cell cycle analysis of a cell proliferation associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki67,J Immunol 1984;133:1710
4.朱红，等.原发性肺癌增殖细胞核抗原表达及DNA含量测定的研究.中华结核和呼吸杂志 1996；19(5)：314
5.许玲，等.益肺抗瘤饮抑制肺癌细胞增殖的实验研究.中国中西医结合杂志 1996；16(8)：486, 百拇医药
单位：陈 葳 程小丽 周冬枝 杨玉琮 张玉五(西安医科大学第一附属医院 西安 710061)
关键词：益气养血保元方；肺腺癌；细胞株；细胞周期；Ki67
摘 要 目的 通过益气养血保元方对培养人肺癌A549细胞生长的研究 摘 要 目的 通过益气养血保元方对培养人肺癌A549细胞生长的研究，证实该方对肺癌细胞增殖的影响。方法 采用噻唑蓝法测定药物对细胞的抑制作用，流式细胞术检测细胞周期和Ki167的表达。结果 发现益气养血保元方能抑制A549细胞的生长，IC50为0.50mg/ml。该药对A549细胞周期有影响，24h与48h均有S期细胞百分比增加趋势，Ki67表达明显降低。结论 益气养血保元方是通过干扰细胞周期而达到抑制细胞生长目的的。
肺癌发病率、病死率高，目前临床尚无理想的治疗方法。益气养血保元方是由黄芪、沙苑子、女贞子、丹参等组成，临床观察其对肿瘤病人有一定的疗效[1]，能增加荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞的功能[2]。本实验运用MTT法及流式细胞术分析其对人肺腺癌A549细胞增殖的影响。
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材料与方法
1 细胞株
A549是一贴壁生长，可持续传代的人肺腺癌细胞株，由本室保存。
2 药物
益气养血保元方由黄芪、沙苑子、女贞子、丹参等组成，由本院中医科按水煎醇沉法制备成制剂，生药含量为30mg/ml，pH7.0，灭菌冷藏备用。
3 培养基PRMI1640培养液(Gibco产品)
加10%新生小牛血清，青链霉素各100u/ml。
4 MTT(噻唑蓝)法测定药物抑制肿瘤作用
在96孔板中接种A549细胞5×104/ml37℃，5%CO2培养24h。采用直接加入法将药物分成8个浓度梯度，每个剂量设四个平行孔。于37℃，5%CO2培养48h，然后每孔加入50ulMTT(2mg/ml)同样条件培养4h，倾上清，每孔加入150ul二甲基亚砜(DMSO)，振荡混匀，酶标570nm检测OD值。
, 百拇医药
5 细胞周期分析
取药物作用48h的培养细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，PI(碘化丙啶)染色，流式细胞仪(Coulter)分析。
6 Ki67检测
取2×106药物处理48h的细胞，采用FITC标记的Ki67单克隆抗体(Dako公司)标记，流式细胞仪测定Ki67阳性细胞所占百分含量。
结果
1 益气养血保元方对A549细胞生长的影响
表1 益气养血保元方对A549生长的影响
浓度(mg/ml)
例数
, 百拇医药
(n)
OD
(
±s)抑制率
(%)
0
8
1.394±0.101
0.008
8
1.303±0.052
, 百拇医药
6.52
0.016
8
1.252±0.094
10.19
0.032
8
1.207±0.020
13.41
0.064
8
1.061±0.046
23.89
, 百拇医药
0.128
8
0.927±0.038
33.51
0.256
8
0.820±0.044
41.18
0.512
8
0.679±0.020
51.29
1.024
, 百拇医药
8
0.239±0.008
82.86
表中可看出，益气养血保元方对人肺腺癌A549细胞有明显的抑制作用，并且有明确的量效关系，IC50为0.50mg/ml。
2 益气养血保元方对A549细胞周期的影响
表2 益气养血保元方对细胞周期的影响
组别
G0/G1
S
G2/M
例数(n)
, 百拇医药
对照组
81.87±0.71
11.25±0.68
6.95±1.06
9
Y0.25mg/ml
80.18±0.73**
9.90±0.46**
9.93±0.43**
9
Y0.50mg/ml
, 百拇医药
48.43±0.78**
47.72±4.00**
3.95±3.39*
9
注：与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。
表2可见，益气养血保元方处理的A549细胞，由于药物浓度的不同而有所不同。0.25mg/ml时，S期细胞百分比较对照组略有增加，而G2/M期细胞较对照组明显增加。而当0.50mg/ml时，出现明显的S期细胞百分比增加，G0/G1期及G2/M期细胞减少。
3 益气养血保元方对A549细胞Ki67表达的影响
表3 益气养血保元方对Ki67表达的影响
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组别
例数(n)
Ki67阳性率(%)
对照组
6
17.4±1.02
Y0.25mg/ml
6
14.6±0.85**
Y0.50mg/ml
6
5.5±0.43**
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注：与对照组比较：**P<0.01。
不同浓度的益气养血保元方作用的A549细胞Ki67的表达均有降低，并且有显著性的差别。
讨论
细胞从一次分裂结束到下一次分裂结束为一个周期，其中S期是细胞增殖周期中反映DNA复制的阶段。本研究采用流式细胞术分析了药物作用对A549细胞周期的影响，发现0.50mg/ml组S期细胞百分比明显增加，由对照组11.25%增加到47.70%，同时G0/G1期及G2/M期细胞减少，表明益气养血保元方有干扰细胞周期的作用。
目前检测增细胞核抗原的指标较多，其中主要有增殖细胞核抗原(PCNA)，DNA多聚酶及Ki67。Ki67单克隆抗体是针对处于增殖周期的人类细胞核抗原的抗体，其表达的强弱与细胞增殖程度呈正相关。Ki67抗原存在于细胞周期的G1、S、G2期，至分裂晚期Ki67抗原迅速消失，G0期无Ki67抗原的表达，Ki67抗原的半衰期短，细胞脱离增殖周期后迅速被降解，其检测的可靠性明显优于半衰期长的PCNA[3]。原发性肺癌PCNA的表达强弱与患者的生存期呈负相关，PCNA高表达的肺癌具有更高的侵袭力，预后差[4]。益气养血保元方作用的A549细胞虽然S期细胞百分比明显升高，G2/M期细胞减少，但从细胞周期分布图可以看出，大多数处于S期的细胞却不表达Ki67，提示益气养血保元可能使A549细胞发生周期阻滞，使其不表达Ki67。有研究表明益肺抗瘤饮在体外可抑制LAX-83人肺腺癌细胞的增殖，药物组Ki67的阳性率明显低于空白对照组[5]。
, 百拇医药
本研究表明，益气养血保元方对体外培养的人肺癌A549细胞确有抑制生长的作用，IC50为0.50mg/ml。它可能是通过干扰肿瘤细胞的细胞周期而达到抑制其增殖的目的。
* 陕西省自然科学基金资助课题
作者简介：陈葳，女，35岁，助理研究员。现在西安医科大学第一附属医院临床分子生物学中心。主要研究方向：肿瘤细胞与分子生物学。
参考文献
1.周小娟，等.益气养血保元胶囊配合化疗治疗恶性肿瘤167例临床观察.陕西中医 1996；5：87
2.张玉五，等.益气养血保元方对恶性肿瘤患者生存质量及小鼠巨噬细胞活性的影响.现代中医 1990；2：49
3.Getdes J,et al.Cell cycle analysis of a cell proliferation associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki67,J Immunol 1984;133:1710
4.朱红，等.原发性肺癌增殖细胞核抗原表达及DNA含量测定的研究.中华结核和呼吸杂志 1996；19(5)：314
5.许玲，等.益肺抗瘤饮抑制肺癌细胞增殖的实验研究.中国中西医结合杂志 1996；16(8)：486, 百拇医药