寿星宝对大鼠60Coγ射线照射所致自由基代谢损伤的实验研究*
作者：方朝晖 染兴伦 韩明向 周宜轩
单位：方朝晖 染兴伦 韩明向 周宜轩(安徽中医学院附属医院内科 合肥 230031)
关键词：寿星宝；辐射；自由基损伤
中国中医基础医学杂志990607 摘 要 目的 为探索寿星宝冲剂对延缓衰老的作用机制。方法 采用60Coγ射线照射Wistar大鼠制作“虚—瘀”证的模型，并设寿星宝治疗组、亚硫酸钠阳性对照组和空白对照组。观察各组血清脂质过氧化物(LPO,Lipid peroxide)的含量及红细胞超氧化物歧化酶(SOD,Superoxide dismutas)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—px,Glutathione peroxidase)、过氧化氢酶(CAT，Catate)、过氧化物酶(POD,peroxidase)的活性。结果 (1)60coγ射线照射可致各组大鼠LPO含量明显升高(P<0.01)，SOD GSH-PX CAT POD活性明显降低(P<0.05，P<0.01)；(2)寿星宝能改善“虚-瘀”的症状，并可明显降低LPO含量(P<0.01)，提高SOD、GSH-PX、CAT,POD各酶活性，(P<0.05，P<0.01)，且与亚硫酸钠组作用相近(P>0.05)。结论 寿星宝可通过提高机体内清除自由基的酶的活性而达到抗氧化、清除自由基、对抗辐射损伤的目的。
, 百拇医药
中国图书分类号 R161.7
外界环境的诸多理化因素，如电离辐射、大气污染、吸烟等都可使生物体内产生大量外源性的自由基，其中尤以电离辐射为著。随着现代科技水平的发展，各种电离辐射的损伤更易发生。自由基代谢与衰老有密切的关系。我们已经观察到寿星宝冲剂具有明确的清除氧自由基的作用[1、2]。本实验是运用60Coγ射线照射大鼠诱导自由基损伤反应作为动物衰老的“虚——瘀”模型，观察寿星宝对抗电离辐射的作用，从而进一步揭示中医益气活血法抗衰老的部分实质。
材料与方法
1 材料
1.1 实验动物
选用健康的18月～22月龄Wister大白鼠40只，体重180g～250g，雌雄各半，由安徽省医学研究所标准动物房提供。
, http://www.100md.com
1.2 实验用药及试剂
寿星宝冲剂(由生晒参、细生地、丹参等10味中药组成)，安徽省中医学院抗衰老研究所研制，合肥市中药总厂生产。红细胞SOD检测药盒由武汉海军抗衰老研究中心提供，还原型谷胱甘肽及CAT标准品为上海生化研究所产品，5-5′-二硫对硝基苯(DTNB)为Fluka产品，H2O2由北京化学试剂厂生产，其余试剂均为国产化学分析纯。
1.3 主要仪器
BME-1生物医学数据处理计算机和7211分光光度计。
2 动物分组
实验动物40只，随机分为4组。1)辐射组：用生理盐水灌胃，每日1mL/100g体重，连续灌胃3周，用60Coγ射线600rad照射，继续以生理盐水灌胃2周；2)寿星宝组：用寿星宝液灌胃，每日1mL/1cog体重含寿星宝0.108g/mL，相当于成人用量的6倍，60Coγ射线照射量及疗程均同辐射组；3)亚硫酸钠组：用亚硫酸钠灌胃，每日1ml/100g体重，含亚硫酸钠30mg/mL60Coγ射线照射量及疗程亦均同辐射组；4)正常对照组：除以生理盐水灌胃，每日1mL/100g体重外，不给予其他任何处理。
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3 方法及观察指标
以上各组动物在灌胃5周后，断头取血，分别进行下述检测：
3.1 血清过氧化脂质(LPO)
用TBA显色法直接测定[3]。
3.2 红细胞超氧化物歧化酶(SOD)活力测定
用邻苯三酚自氧化法[4]。
3.3 全血谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力测定
用改良的Hafeman法[5]。
3.4 红细胞过氧化氢酶(CAT)活力测定
, 百拇医药
用过硼酸盐作底物滴定法[6]。
3.5 红细胞过氧化物酶(POD)活力测定
用3，3′-二氨基联苯胺显色法[7]。
结果
1 对照射大鼠存活率的影响(见表1)
表1 寿星宝对照射大鼠存活率的影响 组 别
动物数
照射后3周内
存活率
(%)
存活数
, 百拇医药
死亡数
辐 射 组
10
2
8
20
寿星宝组
10
7
3
70
亚硫酸钠组
10
8
, http://www.100md.com
2
80
正常对照组
10
10
0
100
由表1可知，辐射组大鼠的存活率仅为20%，而寿星宝组为70%，亚硫酸钠组的存活率为80%，说明寿星宝能明显提高辐射大鼠的存活率与辐射组相比有显著的差异(P<0.01)，与亚硫酸钠组相比，无显著性差异(P>0.05)。
2 对辐射大鼠症状和体征的影响(见表2)
表2 寿星宝对辐射大鼠症状和体征的影响(照射后3周内) 组 别
, 百拇医药
动物
数
神疲
懒动
食欲
减退
黑粪
皮肤粘
膜瘀斑
辐 射 组
10
10
10
10
, 百拇医药
10
9
寿星宝组
10
4
4
3
5
2
亚硫酸钠组
10
4
3
3
, 百拇医药
5
2
正常对照组
10
1
0
1
0
0
由表2可见，寿星宝组大鼠多数症状较轻，发生率低，出现时间推迟。上述症状和体征与辐射组相比有显著性差异(P<0.01)。而与亚硫酸钠组及正常对照组相比，则无显著差异(P>0.05)。
3 对辐射大鼠自由基代谢的影响(见表3)
, 百拇医药
表3 寿星宝对辐射大鼠自由基代谢的影响 组 别
动物数
SOD
(u/mL)
GSH-PX
(u/mg.Hb)
CAT
(u/mL)
POD
(u/mg.Hb)
LPO
(nmol/mL)
, 百拇医药
辐 射 组
10
207.4±58.5
94.3±17.4
50.6±7.4
41.3±4.6
10.67±1.32
寿星宝组
10
255.8±56.4**△△
126.4±38.7**
, 百拇医药 66.3±7.1**
45.5±6.3*
8.12±1.14**△
亚硫酸钠组
10
368.6±59.3**△
125.6±32.3**
67.3±4.6**
46.3±5.1*
8.03±1.28**△
, http://www.100md.com
正常对照组
10
385.8±56.4**
123.5±28.6**
68.1±8.3*
46.6±6.7*
7.32±1.97**
注：与辐射组比较：*P<0.05，**P<0.01；与正常对照组比较：△P<0.05，△△P<0.01。
由表3可见，辐射组与正常对照组相比，SOD含量、GSH-PX含量、CAT含量均明显降低(P<0.01)。寿星宝组、亚硫酸钠组SOD含量、GSH-PX含量均高于辐射组，POD的含量也显著高于辐射组(P<0.05)，LPO含量则低于辐射组(P<0.01)，但均未达到正常水平。
, http://www.100md.com
讨论
自由基首先是由Gomberg在1900年证实其存在的，而Harman的衰老自由基学说二战后原子弹爆炸所致放射病的基础上建立起来的。新近已有不少学者以此为指导，通过放射性辐射造成实验动物的自由基损伤，加速衰老进程的原理，建立了衰老的自由基损伤模型[8]。另有报道放射线可导致人体内白细胞显著降低、细胞核异常、血小板减少、免疫功能降低，并出现食欲减退，睡眠失调，性功能减退等多种精神、神经症状，此属中医之虚证范畴[9]。另有研究指出，放射损伤尚可出现符合中医血瘀证变化的血液流变学异常和微循环变化等[10]。
用60Coγ射线照射大鼠发现照射大鼠的存活率明显降低，且出现了符合气虚血瘀证变化的神疲、懒动、食欲减退及皮肤粘膜瘀斑，说明用60Coγ射线照射大鼠制作中医学“虚——瘀”模型是成功的，与有关文献报道一致[9、10]。
, http://www.100md.com
我们通过对老年人证候学调查而提出的衰老的“虚——瘀”模式，即衰老的主要证候学特点是气虚阴亏血瘀。以此为理论指导，拟益气养阴活血为法组方而成的寿星宝冲剂，经实验和临床研究初步证实了基具有明确的改善“虚——瘀”症状及改善自由基代谢的作用[11]。此外我们认为自由基清除剂在整个自由基的清除过程中是起协同作用的。以往的研究多注重于对LPO和SOD活性及两者相互关系的研究，但对GSH-PX、CAT及POD等其它自由基清除剂的研究较少，这在阐明自由基理论，特别是终止自由基链锁反应中的总体协同作用是不全面的。本实验是用60Coγ射线照射大鼠制作自由基损伤及中医的“虚——瘀”模型观察红细胞SOD、GSH-PX、CAT、POD及血清LPO的含量变化。放射组中各酶含量均明显低于正常对照组，这是由于放射线的作用，使机体产生或诱导产生大量自由基造成的。抗衰老中药复方寿星宝冲剂可明显改善辐射大鼠的气虚血瘀症状和体征，并能明显地改善因辐射所致的自由基损伤，提高机体内清除自由基各活性酶的含量，进而阻止自由基的链锁反应，达到清除自由基，对抗辐射的目的，与公认的抗氧化药物亚硫酸钠无明显统计学差异(P>0.05)。同时也从另一角度阐明了中医衰老的“虚——瘀”理论及益气活血作用在抗衰老研究中的重要作用，表明了寿星宝的抗衰老作用及其主要机理。
, 百拇医药
* 国家中医药管理局重点基金资助项目
作者简介：方朝晖，男，31岁，北京中医药大学博士研究生，安徽中医学院第一附属医院老年病内科主治医师，讲师。专业方向：中医药延缓衰老的临床与实验研究。曾发表专业学术论文20余篇。通讯地址：安徽省合肥市安徽中医学院第一附属医院。邮编：230031，电话：(0551)～2816764～2305。
参考文献
1.韩明向，李平，魏江磊，等.寿星宝对大鼠体外肝匀浆生成过氧化物的影响.安徽中医学院学报 1992；11(1)：55
2.韩明向，李平.中医虚证与红细胞内SOD活性相关性的研究.安徽中医学院学报 1991；10(4)：64
3.陈须志，金有余，李常淳.过氧化脂质TBA显色的三种方法学比较.临床检验杂志 1984；2(4)：8
, 百拇医药
4.丁克祥，钟水先，姚树人.微量指血超氧化物歧化酶快速测定法的研究.老年学杂志 1987；7(2)：42
5.张嘉麟，方允中.血清中谷胱甘肽过氧化物酶活力微量测定.中华医学检验杂志 1985；8(4)：199
6.白秀起，戴工禾.过硼酸盐作底物滴定法测定红细胞及心肌组织中过氧化氢酶活力.白求恩医科大学学报 1989；15(1)：34
7.Herzog V.A new sensitive colorimetric assay for peroxidase using 3,3 Diamino-benzidine as hydrogen donor.Anal Bia-chem.1973；55:554～562
8.刘中申，李廷利，吕亚彬.刺玫果抗辐射研究.中医药学报 1989；(4)：37
9.叶根耀.急慢性放射损伤及防护知识.第1版.北京：原子能出版社，1980：41～63
10.王洪复，陈永明，袁龙宝，等.益气祛瘀治疗急性放射病的实验观察.中西医结合杂志 1984；4(6)：359
11.李益新，方允中，刘智峰.超氧化物歧化酶的辐射失活与自由基作用关系的研究.生物化学与生物物理进展 1983；10(3)：38
(收稿日期 1998—06—28 修回日期 1998—12—15), 百拇医药
单位：方朝晖 染兴伦 韩明向 周宜轩(安徽中医学院附属医院内科 合肥 230031)
关键词：寿星宝；辐射；自由基损伤
中国中医基础医学杂志990607 摘 要 目的 为探索寿星宝冲剂对延缓衰老的作用机制。方法 采用60Coγ射线照射Wistar大鼠制作“虚—瘀”证的模型，并设寿星宝治疗组、亚硫酸钠阳性对照组和空白对照组。观察各组血清脂质过氧化物(LPO,Lipid peroxide)的含量及红细胞超氧化物歧化酶(SOD,Superoxide dismutas)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—px,Glutathione peroxidase)、过氧化氢酶(CAT，Catate)、过氧化物酶(POD,peroxidase)的活性。结果 (1)60coγ射线照射可致各组大鼠LPO含量明显升高(P<0.01)，SOD GSH-PX CAT POD活性明显降低(P<0.05，P<0.01)；(2)寿星宝能改善“虚-瘀”的症状，并可明显降低LPO含量(P<0.01)，提高SOD、GSH-PX、CAT,POD各酶活性，(P<0.05，P<0.01)，且与亚硫酸钠组作用相近(P>0.05)。结论 寿星宝可通过提高机体内清除自由基的酶的活性而达到抗氧化、清除自由基、对抗辐射损伤的目的。
, 百拇医药
中国图书分类号 R161.7
外界环境的诸多理化因素，如电离辐射、大气污染、吸烟等都可使生物体内产生大量外源性的自由基，其中尤以电离辐射为著。随着现代科技水平的发展，各种电离辐射的损伤更易发生。自由基代谢与衰老有密切的关系。我们已经观察到寿星宝冲剂具有明确的清除氧自由基的作用[1、2]。本实验是运用60Coγ射线照射大鼠诱导自由基损伤反应作为动物衰老的“虚——瘀”模型，观察寿星宝对抗电离辐射的作用，从而进一步揭示中医益气活血法抗衰老的部分实质。
材料与方法
1 材料
1.1 实验动物
选用健康的18月～22月龄Wister大白鼠40只，体重180g～250g，雌雄各半，由安徽省医学研究所标准动物房提供。
, http://www.100md.com
1.2 实验用药及试剂
寿星宝冲剂(由生晒参、细生地、丹参等10味中药组成)，安徽省中医学院抗衰老研究所研制，合肥市中药总厂生产。红细胞SOD检测药盒由武汉海军抗衰老研究中心提供，还原型谷胱甘肽及CAT标准品为上海生化研究所产品，5-5′-二硫对硝基苯(DTNB)为Fluka产品，H2O2由北京化学试剂厂生产，其余试剂均为国产化学分析纯。
1.3 主要仪器
BME-1生物医学数据处理计算机和7211分光光度计。
2 动物分组
实验动物40只，随机分为4组。1)辐射组：用生理盐水灌胃，每日1mL/100g体重，连续灌胃3周，用60Coγ射线600rad照射，继续以生理盐水灌胃2周；2)寿星宝组：用寿星宝液灌胃，每日1mL/1cog体重含寿星宝0.108g/mL，相当于成人用量的6倍，60Coγ射线照射量及疗程均同辐射组；3)亚硫酸钠组：用亚硫酸钠灌胃，每日1ml/100g体重，含亚硫酸钠30mg/mL60Coγ射线照射量及疗程亦均同辐射组；4)正常对照组：除以生理盐水灌胃，每日1mL/100g体重外，不给予其他任何处理。
, http://www.100md.com
3 方法及观察指标
以上各组动物在灌胃5周后，断头取血，分别进行下述检测：
3.1 血清过氧化脂质(LPO)
用TBA显色法直接测定[3]。
3.2 红细胞超氧化物歧化酶(SOD)活力测定
用邻苯三酚自氧化法[4]。
3.3 全血谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力测定
用改良的Hafeman法[5]。
3.4 红细胞过氧化氢酶(CAT)活力测定
, 百拇医药
用过硼酸盐作底物滴定法[6]。
3.5 红细胞过氧化物酶(POD)活力测定
用3，3′-二氨基联苯胺显色法[7]。
结果
1 对照射大鼠存活率的影响(见表1)
表1 寿星宝对照射大鼠存活率的影响 组 别
动物数
照射后3周内
存活率
(%)
存活数
, 百拇医药
死亡数
辐 射 组
10
2
8
20
寿星宝组
10
7
3
70
亚硫酸钠组
10
8
, http://www.100md.com
2
80
正常对照组
10
10
0
100
由表1可知，辐射组大鼠的存活率仅为20%，而寿星宝组为70%，亚硫酸钠组的存活率为80%，说明寿星宝能明显提高辐射大鼠的存活率与辐射组相比有显著的差异(P<0.01)，与亚硫酸钠组相比，无显著性差异(P>0.05)。
2 对辐射大鼠症状和体征的影响(见表2)
表2 寿星宝对辐射大鼠症状和体征的影响(照射后3周内) 组 别
, 百拇医药
动物
数
神疲
懒动
食欲
减退
黑粪
皮肤粘
膜瘀斑
辐 射 组
10
10
10
10
, 百拇医药
10
9
寿星宝组
10
4
4
3
5
2
亚硫酸钠组
10
4
3
3
, 百拇医药
5
2
正常对照组
10
1
0
1
0
0
由表2可见，寿星宝组大鼠多数症状较轻，发生率低，出现时间推迟。上述症状和体征与辐射组相比有显著性差异(P<0.01)。而与亚硫酸钠组及正常对照组相比，则无显著差异(P>0.05)。
3 对辐射大鼠自由基代谢的影响(见表3)
, 百拇医药
表3 寿星宝对辐射大鼠自由基代谢的影响 组 别
动物数
SOD
(u/mL)
GSH-PX
(u/mg.Hb)
CAT
(u/mL)
POD
(u/mg.Hb)
LPO
(nmol/mL)
, 百拇医药
辐 射 组
10
207.4±58.5
94.3±17.4
50.6±7.4
41.3±4.6
10.67±1.32
寿星宝组
10
255.8±56.4**△△
126.4±38.7**
, 百拇医药 66.3±7.1**
45.5±6.3*
8.12±1.14**△
亚硫酸钠组
10
368.6±59.3**△
125.6±32.3**
67.3±4.6**
46.3±5.1*
8.03±1.28**△
, http://www.100md.com
正常对照组
10
385.8±56.4**
123.5±28.6**
68.1±8.3*
46.6±6.7*
7.32±1.97**
注：与辐射组比较：*P<0.05，**P<0.01；与正常对照组比较：△P<0.05，△△P<0.01。
由表3可见，辐射组与正常对照组相比，SOD含量、GSH-PX含量、CAT含量均明显降低(P<0.01)。寿星宝组、亚硫酸钠组SOD含量、GSH-PX含量均高于辐射组，POD的含量也显著高于辐射组(P<0.05)，LPO含量则低于辐射组(P<0.01)，但均未达到正常水平。
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讨论
自由基首先是由Gomberg在1900年证实其存在的，而Harman的衰老自由基学说二战后原子弹爆炸所致放射病的基础上建立起来的。新近已有不少学者以此为指导，通过放射性辐射造成实验动物的自由基损伤，加速衰老进程的原理，建立了衰老的自由基损伤模型[8]。另有报道放射线可导致人体内白细胞显著降低、细胞核异常、血小板减少、免疫功能降低，并出现食欲减退，睡眠失调，性功能减退等多种精神、神经症状，此属中医之虚证范畴[9]。另有研究指出，放射损伤尚可出现符合中医血瘀证变化的血液流变学异常和微循环变化等[10]。
用60Coγ射线照射大鼠发现照射大鼠的存活率明显降低，且出现了符合气虚血瘀证变化的神疲、懒动、食欲减退及皮肤粘膜瘀斑，说明用60Coγ射线照射大鼠制作中医学“虚——瘀”模型是成功的，与有关文献报道一致[9、10]。
, http://www.100md.com
我们通过对老年人证候学调查而提出的衰老的“虚——瘀”模式，即衰老的主要证候学特点是气虚阴亏血瘀。以此为理论指导，拟益气养阴活血为法组方而成的寿星宝冲剂，经实验和临床研究初步证实了基具有明确的改善“虚——瘀”症状及改善自由基代谢的作用[11]。此外我们认为自由基清除剂在整个自由基的清除过程中是起协同作用的。以往的研究多注重于对LPO和SOD活性及两者相互关系的研究，但对GSH-PX、CAT及POD等其它自由基清除剂的研究较少，这在阐明自由基理论，特别是终止自由基链锁反应中的总体协同作用是不全面的。本实验是用60Coγ射线照射大鼠制作自由基损伤及中医的“虚——瘀”模型观察红细胞SOD、GSH-PX、CAT、POD及血清LPO的含量变化。放射组中各酶含量均明显低于正常对照组，这是由于放射线的作用，使机体产生或诱导产生大量自由基造成的。抗衰老中药复方寿星宝冲剂可明显改善辐射大鼠的气虚血瘀症状和体征，并能明显地改善因辐射所致的自由基损伤，提高机体内清除自由基各活性酶的含量，进而阻止自由基的链锁反应，达到清除自由基，对抗辐射的目的，与公认的抗氧化药物亚硫酸钠无明显统计学差异(P>0.05)。同时也从另一角度阐明了中医衰老的“虚——瘀”理论及益气活血作用在抗衰老研究中的重要作用，表明了寿星宝的抗衰老作用及其主要机理。
, 百拇医药
* 国家中医药管理局重点基金资助项目
作者简介：方朝晖，男，31岁，北京中医药大学博士研究生，安徽中医学院第一附属医院老年病内科主治医师，讲师。专业方向：中医药延缓衰老的临床与实验研究。曾发表专业学术论文20余篇。通讯地址：安徽省合肥市安徽中医学院第一附属医院。邮编：230031，电话：(0551)～2816764～2305。
参考文献
1.韩明向，李平，魏江磊，等.寿星宝对大鼠体外肝匀浆生成过氧化物的影响.安徽中医学院学报 1992；11(1)：55
2.韩明向，李平.中医虚证与红细胞内SOD活性相关性的研究.安徽中医学院学报 1991；10(4)：64
3.陈须志，金有余，李常淳.过氧化脂质TBA显色的三种方法学比较.临床检验杂志 1984；2(4)：8
, 百拇医药
4.丁克祥，钟水先，姚树人.微量指血超氧化物歧化酶快速测定法的研究.老年学杂志 1987；7(2)：42
5.张嘉麟，方允中.血清中谷胱甘肽过氧化物酶活力微量测定.中华医学检验杂志 1985；8(4)：199
6.白秀起，戴工禾.过硼酸盐作底物滴定法测定红细胞及心肌组织中过氧化氢酶活力.白求恩医科大学学报 1989；15(1)：34
7.Herzog V.A new sensitive colorimetric assay for peroxidase using 3,3 Diamino-benzidine as hydrogen donor.Anal Bia-chem.1973；55:554～562
8.刘中申，李廷利，吕亚彬.刺玫果抗辐射研究.中医药学报 1989；(4)：37
9.叶根耀.急慢性放射损伤及防护知识.第1版.北京：原子能出版社，1980：41～63
10.王洪复，陈永明，袁龙宝，等.益气祛瘀治疗急性放射病的实验观察.中西医结合杂志 1984；4(6)：359
11.李益新，方允中，刘智峰.超氧化物歧化酶的辐射失活与自由基作用关系的研究.生物化学与生物物理进展 1983；10(3)：38
(收稿日期 1998—06—28 修回日期 1998—12—15), 百拇医药