肝炎病人血清、外周血单核细胞及肝脏中GBV-C/HGV负链RNA的检测
作者：聂青和李梦东 胡大荣 朱永红 陈国致
单位：聂青和李梦东 胡大荣 朱永红 陈国致 第三军医大学附属西南医院全军传染病专科中心 重庆，400038
关键词：GB病毒C型；庚型肝炎病毒；逆转录-巢式多聚酶链反应；外周血单核细胞；病毒复制
第三军医大学学报990711
提 要 目的：研究27例肝炎病人血清、外周血单核细胞(PBMC)及肝脏中GBV-C/HGV正链及负链RNA(复制中间体)的存在状况。方法：应用逆转录-巢式多聚酶链反应技术检测GBV-C/HGV正、负链RNA。结果：27例病人中21例病人血清、7例PBMC、10例肝组织中检测到GBV-C/HGV正链RNA，其中2例单一GBV-C/HGV感染者肝组织中检测到负链RNA，在27例病人血清及PBMC中均未检测到负链RNA。结论：GBV-C/HGV是一种嗜肝病毒，肝脏可能是其复制的主要场所之一，但GBV-C/HGV与HCV混合感染时，在PBMC及肝脏中尚未发现该病毒复制的证据。
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中图法分类号 R394;R512.6
Detection of minus-stranded GBV-C/HGV RNA in the serum, liver and peripheral blood mononuclear cells in patients with hepatitis
Nie Qinghe, Li Mengdong, Hu Darong, Zhu Yonghong, Chen Guozhi
(Department of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400038)
Abstract Objective: To investigate the presence of plus- and minus-stranded HGV RNA in the serum, liver and peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Methods: Plus- and minus-stranded HGV RNA was detected with reverse-transcription nested polymerase chain reaction in 27 patients with hepatitis. Results: Plus-stranded HGV RNA was found in 21 cases in serum 10 cases in liver sample and 7 cases in PBMC. No minus stranded HGV RNA was found in serum and PBMC. Minus-stranded HGV RNA was detectal in 2 cases infected only with GBV-C/HGV in the liver sample. Plus-stranded HGV RNA was found in 10 of 21 liver samples from the patients with positive detection of HGV RNA in the serum and 2 of minus-stranded positive samples. No minus-stranded HGV RNA was found in the serum and PBMC. Conclusion: GBV-C/HGV is a hepatotropic virus that replicates in the human liver.
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Key words GB virus C; hepatitis G virus; RT-nPCR; viral replication
庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV)是否有致病性的研究是十分重要的课题。目前对GBV-C/HGV的寄居部位及复制场所也尚未阐明。资料表明，GBV-C/HGV与HCV均为单股正链RNA病毒，其复制过程相似。因此，检测病毒负链RNA可以作为细胞内病毒复制的指标[1，2]。我们检测同一患者血清、外周血淋巴-单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)及肝组织中GBV-C/HGV正、负链RNA，力求探讨GBV-C/HGV的组织亲和性，试图为其致病性的研究提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 研究对象
选择经RT-nPCR试验检测血清GBV-C/HGV RNA阳性肝炎病人21例，其中单一GBV-C/HGV感染者8例；另选慢性丙型肝炎6例(血清GBV-C/HGV RNA阴性，抗HCV及HCV RNA阳性)。本组研究对象共27例，为血清、PBMC及肝组织3种标本齐全的病人，年龄18～39岁，男性19例，女性8例。
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1.2 RT-nPCR引物序列
参照Saito等[3]报道的引物序列。
外引物 HG166 5′-CCACTATAGGTGGGTCTTAA-3′
外引物 HG380R 5′-CCACTGGTCCTTGTCAACTC-3′
内引物 HG166 5′-CCACTATAGGTGGGTCTTAA-3′
内引物 HG341R 5′-TGGTCAAGAGAGACATTGAA
GGG-3′
第二次巢式PCR扩增产物长度为210 bp。
, 百拇医药 1.3 肝组织中总RNA的提取
参照Chomzynski等[4]介绍的异硫氰酸胍∶酚∶氯仿提取法，略有改动。具体操作过程如下：①取40 mg肝组织，用无菌生理盐水冲洗3次后，置于无菌玻璃匀浆管中；②加入600μl变性母液(4 mol/L异硫氰酸胍，25 mmol/L柠檬酸钠；pH7.0,0.5%十二烷基磺酸钠和6 μl β-巯基乙醇)，电动匀浆3次，每次30 s；③匀浆后在冰水中超声震荡1 min；④将此匀浆液移至1.5 ml Eppendorf管中，加入2 mol/L NaAc(pH4.0)60 μl，饱和酚600 μl，氯仿∶异戊醇(49∶1)400 μl，混匀后置冰浴15 min，4°C 10 000×g离心15 min，取上清加等体积氯仿再提取一次。再取水相加等体积异丙醇-20°C沉淀过夜；⑤-70°C沉淀30 min，4°C 10 000×g离心20 min，弃去液体，以75%冰冷乙醇600μl漂洗沉淀，同上离心10 min，弃去乙醇；⑥沉淀物以半导体冻干机抽干，溶于焦碳酸二乙酯(Diethyl pyrocarbonate,DEPC)处理的水中，于-70°C冻存作为统一待检样品。
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1.4 淋巴-单核细胞分离及总RNA的提取
1.4.1淋巴-单核细胞的分离 按文献[5]的方法略有改动。具体操作过程如下：①取抗凝静脉血5ml，用RPMI 1640液将之1∶1稀释。②取比重为1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺分层液4ml，放入15 mm×150 mm试管中。③用毛细吸管吸取稀释血液，在离分层液面上1cm处，沿试管壁慢慢加入8ml左右。④用水平离心机500×g离心30 min，将毛细吸管轻轻插到血浆与分离液界面的白膜状层，沿试管壁周缘吸出界面层细胞，移入另一无菌试管中。⑤加5倍左右的RPMI 1640液，充分混匀，200×g离心15 min，弃去RPMI 1640液，将沉淀细胞用RPMI 1640液重悬后反复洗涤4次。将最后一次洗涤液留取，-70°C贮存统一待检。⑥加500 μl重蒸水后，冰浴条件下用MSE超声波粉碎仪振动1min。在4°C下20000×g离心15 min，吸去上清液400 μl后-70°C贮存统一待检。
1.4.2 GBV-C/HGV RNA的提取 采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法。
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1.5 血清中RNA的提取
取待检血清100 μl加300 μl裂解液(4.2 mmol/L异硫氰酸胍；0.5%十二烷基磺酸钠；2.5 mmol/L Tris,25 mmol/L柠檬酸钠，0.1 mmol/L β-巯基乙醇)混匀，置45 min，然后加入2mmol/醋酸钠50 μl，酚500 μl和氯仿∶异戊醇(24∶1)100 μl，混匀，静置10 min，取上清，移置另一离心管中，并加入等体积的异丙醇，置-20°C过夜。然后10 000×g离心20 min，沉淀物用真空干燥备用。
1.6 GBV-C/HGV负链RNA的检测
参照Saito等[3]和Takehara等[6]介绍的方法，略有改动。具体操作过程如下：
1.6.1 逆转录反应 反应体积20 μl。将待检样品和不含酶、RNasin的反应混合液分别先在93°C变性6 min，再将此待检样品10 μl加入到含10 μl反应混合液(含10×PCR缓冲液2 μl、4种2 mmol/L dNTP 4 μl、与负链GBV-C/HGV RNA互补的有义外引物10 pM、RNasin 20U及AMV逆转录酶5U)的反应管中，盖上石蜡油，离心混匀集中。于42°C反应40 min，接着于95°C变性20 min，使逆转录酶充分灭活。
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1.6.2 第1轮PCR 反应体积40 μl。在上述逆转录反应产物管中加入反应混合液20 μl(含10×PCR缓冲液2 μl、与正链GBV-C/HGV RNA互补的反应外引物10 pM及Taq DNA聚合酶2U)，离心混匀，进入PCR循环。参数为：①94°C 1 min,50°C 1 min,72°C 2 min，循环3周；②继之94°C 30 s,50°C 40 s,70°C 40 s(每周递增1 s)，循环37周；③最后于72°C延伸6 min。
1.6.3 第2轮PCR 反应体积40 μl。由4 μl第1轮PCR产物和36μl反应混合液(含10×PCR缓冲液4 μl、每种2 mmol/L dNTP 4 μl、两条内引物各10 pM、Taq DNA聚合酶2U)组成。参数为：①94°C 1 min, 50°C 1 min, 70°C 2 min，循环3周；②继之94°C 30 s, 50°C 40 s,70°C 40 s(每周递增1 s)，循环37周；③最后于72°C延伸反应6 min结束。以上温育反应均在Bransteadl Thermolyne公司出品的自动化热循环仪上进行。
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1.6.4 GBV-C/HGV负链RNA的RT-nPCR扩增产物分析 取第2轮PCR扩增产物10μl加入含溴乙锭的2%琼脂糖凝胶中电泳。
2 结果
2.1 GBV-C/HGV负链RNA检测的特异性
为防止假阳性的出现，每次试验中均随机插入2例正常人血清或PBMC。18例正常人血清、PBMC均按实验组病人血清、PBMC一样提取RNA，然后进行RT-nPCR检测，结果未发现有非特异性扩增带出现。检测肝组织时取2例正常人肝组织同实验组病人肝组织进行RNA提取及RT-nPCR检测，结果为阴性。
2.2 检测结果见表1
2.3 重复性试验 将10例肝组织中检出GBV-C/HGV RNA的提取液，冰壶内存放迅速移置本院消化内科实验室，按原实验方案及实验条件进行RT-nPCR检测，以上温育反应均在美国PE公司480型自动化热循环仪上进行。检测结果同前，10例肝组织中GBV-C/HGV RNA阳性和2例单一感染组病人肝组织中GBV-C/HGV负链RNA阳性。
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2.4 PBMC最后一次洗涤液检测
将最后一次冲洗PBMC的RPMI 1640液体，按上述方法提取RNA、RT-nPCR检测，结果未检出GBV-C/HGV RNA。
表1 肝炎病人GBV-C/HGV负链RNA检测结果
Tab 1 Results of GBV-C/HGV RNA detection
in hepatitis patients Type of
infection
Case
Serum
PBMC
, 百拇医药
Liver
Plus
Minus
Plus
Minus
Plus
Minus
Co-infection
13
13
0
4
0
, 百拇医药
6
0
Single-infection
8
8
0
3
0
4
2
Chronic hepatitis C
6
0
, 百拇医药
0
0
0
0
0
Total
27
21
0
7
0
10
2
3 讨论
, 百拇医药
自从肝炎病人血清中克隆成功GBV-C及HGV以来，该病毒的定居及复制场所已成为病毒学专家们感兴趣的课题。Karayiannis等[7]于1997年初报道了在GBV-C/HGV RNA阳性病人PBMC中检测到该病毒RNA，并提出了HGV可能类似CMV或EBV，肝脏不是其特定寄居及侵袭场所，只是在某种条件下可致肝脏损害而已。继而，Madejon等[8]报道，在慢性肝病患者的血清，外周血单核细胞和肝脏内均检测到正链GBV-C/HGV RNA，但仅在肝脏检测到负链RNA。Saito等[3]从6例肝炎病人肝脏检测到HGV负链RNA，其中2例病人的血清和1例病人的外周血单核细胞也检测到HGV负链RNA。上述两篇报道的作者们认为GBV-C/HGV是在肝脏复制的嗜肝病毒。但Laskus等[9]的研究得出完全相反的结论，10例血清HGV RNA阳性慢性肝病患者中，9例HCV RNA也为阳性，6例在肝脏检测到正链HGV RNA，均未检测到负链HGV RNA。与此同时，9例均在肝脏检测到正链HCV RNA者，其中7例也检测到负链HCV RNA，提示至少在与HCV合并感染者中，肝脏不是HGV复制部位。Laskus等[10]继续报道在美国不明原因肝硬化病人中检测到6例血清HGV RNA阳性，其中5例在肝脏中检测到正链HGV RNA，6例均未检测到负链HGV RNA，再次证明肝脏不是HGV的复制场所的观点。最近，Radkowski等[11]报道9例血清GBV-C/HGV RNA阳性病人中，5例病人外周血单核细胞中检测到正链GBV-C/HGV RNA，病人PBMC中均未检测到负链GBV-C/HGV RNA，结论认为PBMC不是GBV-C/HGV的复制场所。上述3篇论文[9～11]的报道均出自美国匹兹堡医学中心同一实验室的结果，其可信程度有待证实。国内目前尚未见关于GBV-C/HGV复制研究的报道。
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由于PCR技术具有极高的灵敏度，只要肝组织中存在微量来自血液的病毒就可能出现阳性反应。Takehara等[6]应用RT-PCR技术研究9例慢性肝炎、肝硬化患者的肝组织、血清和PBMC中负链HCV RNA，发现它只存在于肝组织中，而血清、PBMC中则为阴性，说明这种技术可以避免肝组织中的HCV RNA是来自血液的污染。实践证明，检测负链HCV RNA能较准确地反映受检组织中HCV的存在与复制状况。HCV负链RNA检测的成功，给我们的研究带来启示。单纯检测肝组织中正链GBV-C/HGV RNA的方法，难以确切反映肝组织中GBV-C/HGV的存在与复制状况。从理论上讲，与正链GBV-C/HGV RNA相互补的负链RNA(复制中间体)只存在于有病毒复制的组织和细胞，检测患者肝组织中的负链GBV-C/HGV RNA可以避免肝组织来自血液循环毒粒的污染，能够准确地反映受检患者肝组织中GBV-C/HGV RNA的复制状况。
我们参照Takehara等及Saito等介绍的方法，在逆转录反应时仅加入与负链GBV-C/HGV RNA互补的有义外引物，等逆转录反应结束，将逆转录酶变性灭活后再加入反义外引物，然后进行巢式PCR扩增。结果发现2例单一GBV-C/HGV感染者肝组织中存在GBV-C/HGV负链RNA，而对照血清及正常人肝组织检测均阴性。这2例病人血清、PBMC及肝组织中GBV-C/HGV正链RNA均为阳性，但未能从血清、PBMC中检出负链RNA。如用血液污染来解释这个结果显然是不合适的。由于从单一GBV-C/HGV感染者获得肝组织标本十分困难，虽然本研究例数太少，难以得出肯定性结论，但重复性试验证实确实在单一GBV-C/HGV感染者肝组织中检出负链RNA，提示肝脏可能是GBV-C/HGV复制的场所之一，至少在单一GBV-C/HGV感染病人中如此，也说明GBV-C/HGV对肝脏是有亲和性的。
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RT-nPCR的技术要求相对较高，操作过程中要谨防污染，实验过程应随时插入至少2例阳性对照，以保证实验的特异性。本组实验在同时检测丙型肝炎病人的血清、PBMC及肝脏标本时，均未检出GBV-C/HGV RNA，加之18例正常人对照以及PBMC洗涤液的检测结果均为阴性，为本实验的特异性提供了保证。
从目前资料分析，多家报道了GBV-C/HGV RNA阳性病人PBMC中可检测到GBV-C/HGV RNA[3，7～12]。这些研究结果如象Alter[13]所言检测病人PBMC及肝脏中的GBV-C/HGV RNA均采用RT-PCR法，PCR反应阳性有可能来源于污染的血或肝细胞外的其它组织细胞，这一论断似难以令人信服，何况上述研究均进行了特异性确证实验。至于GBV-C/HGV感染者PBMC中有GBV-C/HGV RNA存在究竟有何意义，尚值得进一步探讨。
*聂青和，男，37岁，副主任医师，博士，现在第四军医大学附属唐都医院传染科 西安，710038
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参考文献
1 Lanford R E, Chavez D, Chisari F V, et al. Lack of detection of negative-strand hepatitis C virus RNA in peripheral blood mononuclear cells and other extrahepatic tissues by the highly strand-specific rTth reverse transcriptase PCR. J Virology,1995,69(12):8079
2 Lanford R E, Sureau C, Jacob J R,et al. Demonstration of in vitro infection of chimpanzee hepatocytes with hepatitis C virus using strand-specific RT/PCR. Virology,1994,202(2):606
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5 Yoffe B, Noonan C A, Melnick J L, et al. Hepatitis B virus DNA in mononuclear cells and analysis of cell subsets for the presence of replicative intermediates of viral DNA. J Infect Dis,1986,153(3):471
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6 Takehara T, Hayashi N, Mita E, et al. Detection of the minus strand of hepatitis C virus RNA by reverse transcription and polymerase chain reaction:Implications of hepatitis C virus replication in infected tissue. Hepatology,1992,15:387
7 Karayiannis P, Hadziyannis S J, Kim J, et al. Hepatitis G virus infection: Clinical characteristics and response to interferon. J Viral Hepatitis,1997,4(1):37
8 Medejon A, Fogeda M, Bartolome J, et al. GB virus C RNA in serum, liver, and peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic hepatitis B, C and D. Gastroenterology,1997,113(2):573
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9 Laskus T, Radkowski M, Wang L F, et al. Lack of evidence for hepatitis G virus replication in the livers of patients coinfected with hepatitis C and G viruses. J Virol,1997,71(10):7804
10 Laskus T, Wang L F, Radkowski M, et al. Hepatitis G virus infection in American patients with cryptogenic cirrhosis: No evidence for liver replication. J Infect Dis,1997,176(6):1491
11 Radkowski M, Wang L F, Vargas H, et al. Lack of evidence for GB virus C/hepatitis G virus replication in peripheral blood mononuclear cells. J Hepatol,1998,28(2):179
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12 Sheng L, Soumillon A, Peerlinck K, et al. Hepatitis G virus RNA in serum and peripheral blood mononuclear cells and its relation to HCV-RNA in patients with lotting disorders. Thromb Haemost,1997,77(5):868
13 Alter H J. G-pers, where′d you get those papers? A reassessment of the literature on the hepatitis G virus. Transfusion,1997,37(6):569
收稿：1998-06-01；修回：1998-12-29, 百拇医药
单位：聂青和李梦东 胡大荣 朱永红 陈国致 第三军医大学附属西南医院全军传染病专科中心 重庆，400038
关键词：GB病毒C型；庚型肝炎病毒；逆转录-巢式多聚酶链反应；外周血单核细胞；病毒复制
第三军医大学学报990711
提 要 目的：研究27例肝炎病人血清、外周血单核细胞(PBMC)及肝脏中GBV-C/HGV正链及负链RNA(复制中间体)的存在状况。方法：应用逆转录-巢式多聚酶链反应技术检测GBV-C/HGV正、负链RNA。结果：27例病人中21例病人血清、7例PBMC、10例肝组织中检测到GBV-C/HGV正链RNA，其中2例单一GBV-C/HGV感染者肝组织中检测到负链RNA，在27例病人血清及PBMC中均未检测到负链RNA。结论：GBV-C/HGV是一种嗜肝病毒，肝脏可能是其复制的主要场所之一，但GBV-C/HGV与HCV混合感染时，在PBMC及肝脏中尚未发现该病毒复制的证据。
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中图法分类号 R394;R512.6
Detection of minus-stranded GBV-C/HGV RNA in the serum, liver and peripheral blood mononuclear cells in patients with hepatitis
Nie Qinghe, Li Mengdong, Hu Darong, Zhu Yonghong, Chen Guozhi
(Department of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400038)
Abstract Objective: To investigate the presence of plus- and minus-stranded HGV RNA in the serum, liver and peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Methods: Plus- and minus-stranded HGV RNA was detected with reverse-transcription nested polymerase chain reaction in 27 patients with hepatitis. Results: Plus-stranded HGV RNA was found in 21 cases in serum 10 cases in liver sample and 7 cases in PBMC. No minus stranded HGV RNA was found in serum and PBMC. Minus-stranded HGV RNA was detectal in 2 cases infected only with GBV-C/HGV in the liver sample. Plus-stranded HGV RNA was found in 10 of 21 liver samples from the patients with positive detection of HGV RNA in the serum and 2 of minus-stranded positive samples. No minus-stranded HGV RNA was found in the serum and PBMC. Conclusion: GBV-C/HGV is a hepatotropic virus that replicates in the human liver.
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Key words GB virus C; hepatitis G virus; RT-nPCR; viral replication
庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV)是否有致病性的研究是十分重要的课题。目前对GBV-C/HGV的寄居部位及复制场所也尚未阐明。资料表明，GBV-C/HGV与HCV均为单股正链RNA病毒，其复制过程相似。因此，检测病毒负链RNA可以作为细胞内病毒复制的指标[1，2]。我们检测同一患者血清、外周血淋巴-单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)及肝组织中GBV-C/HGV正、负链RNA，力求探讨GBV-C/HGV的组织亲和性，试图为其致病性的研究提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 研究对象
选择经RT-nPCR试验检测血清GBV-C/HGV RNA阳性肝炎病人21例，其中单一GBV-C/HGV感染者8例；另选慢性丙型肝炎6例(血清GBV-C/HGV RNA阴性，抗HCV及HCV RNA阳性)。本组研究对象共27例，为血清、PBMC及肝组织3种标本齐全的病人，年龄18～39岁，男性19例，女性8例。
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1.2 RT-nPCR引物序列
参照Saito等[3]报道的引物序列。
外引物 HG166 5′-CCACTATAGGTGGGTCTTAA-3′
外引物 HG380R 5′-CCACTGGTCCTTGTCAACTC-3′
内引物 HG166 5′-CCACTATAGGTGGGTCTTAA-3′
内引物 HG341R 5′-TGGTCAAGAGAGACATTGAA
GGG-3′
第二次巢式PCR扩增产物长度为210 bp。
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参照Chomzynski等[4]介绍的异硫氰酸胍∶酚∶氯仿提取法，略有改动。具体操作过程如下：①取40 mg肝组织，用无菌生理盐水冲洗3次后，置于无菌玻璃匀浆管中；②加入600μl变性母液(4 mol/L异硫氰酸胍，25 mmol/L柠檬酸钠；pH7.0,0.5%十二烷基磺酸钠和6 μl β-巯基乙醇)，电动匀浆3次，每次30 s；③匀浆后在冰水中超声震荡1 min；④将此匀浆液移至1.5 ml Eppendorf管中，加入2 mol/L NaAc(pH4.0)60 μl，饱和酚600 μl，氯仿∶异戊醇(49∶1)400 μl，混匀后置冰浴15 min，4°C 10 000×g离心15 min，取上清加等体积氯仿再提取一次。再取水相加等体积异丙醇-20°C沉淀过夜；⑤-70°C沉淀30 min，4°C 10 000×g离心20 min，弃去液体，以75%冰冷乙醇600μl漂洗沉淀，同上离心10 min，弃去乙醇；⑥沉淀物以半导体冻干机抽干，溶于焦碳酸二乙酯(Diethyl pyrocarbonate,DEPC)处理的水中，于-70°C冻存作为统一待检样品。
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1.4 淋巴-单核细胞分离及总RNA的提取
1.4.1淋巴-单核细胞的分离 按文献[5]的方法略有改动。具体操作过程如下：①取抗凝静脉血5ml，用RPMI 1640液将之1∶1稀释。②取比重为1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺分层液4ml，放入15 mm×150 mm试管中。③用毛细吸管吸取稀释血液，在离分层液面上1cm处，沿试管壁慢慢加入8ml左右。④用水平离心机500×g离心30 min，将毛细吸管轻轻插到血浆与分离液界面的白膜状层，沿试管壁周缘吸出界面层细胞，移入另一无菌试管中。⑤加5倍左右的RPMI 1640液，充分混匀，200×g离心15 min，弃去RPMI 1640液，将沉淀细胞用RPMI 1640液重悬后反复洗涤4次。将最后一次洗涤液留取，-70°C贮存统一待检。⑥加500 μl重蒸水后，冰浴条件下用MSE超声波粉碎仪振动1min。在4°C下20000×g离心15 min，吸去上清液400 μl后-70°C贮存统一待检。
1.4.2 GBV-C/HGV RNA的提取 采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法。
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1.5 血清中RNA的提取
取待检血清100 μl加300 μl裂解液(4.2 mmol/L异硫氰酸胍；0.5%十二烷基磺酸钠；2.5 mmol/L Tris,25 mmol/L柠檬酸钠，0.1 mmol/L β-巯基乙醇)混匀，置45 min，然后加入2mmol/醋酸钠50 μl，酚500 μl和氯仿∶异戊醇(24∶1)100 μl，混匀，静置10 min，取上清，移置另一离心管中，并加入等体积的异丙醇，置-20°C过夜。然后10 000×g离心20 min，沉淀物用真空干燥备用。
1.6 GBV-C/HGV负链RNA的检测
参照Saito等[3]和Takehara等[6]介绍的方法，略有改动。具体操作过程如下：
1.6.1 逆转录反应 反应体积20 μl。将待检样品和不含酶、RNasin的反应混合液分别先在93°C变性6 min，再将此待检样品10 μl加入到含10 μl反应混合液(含10×PCR缓冲液2 μl、4种2 mmol/L dNTP 4 μl、与负链GBV-C/HGV RNA互补的有义外引物10 pM、RNasin 20U及AMV逆转录酶5U)的反应管中，盖上石蜡油，离心混匀集中。于42°C反应40 min，接着于95°C变性20 min，使逆转录酶充分灭活。
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1.6.2 第1轮PCR 反应体积40 μl。在上述逆转录反应产物管中加入反应混合液20 μl(含10×PCR缓冲液2 μl、与正链GBV-C/HGV RNA互补的反应外引物10 pM及Taq DNA聚合酶2U)，离心混匀，进入PCR循环。参数为：①94°C 1 min,50°C 1 min,72°C 2 min，循环3周；②继之94°C 30 s,50°C 40 s,70°C 40 s(每周递增1 s)，循环37周；③最后于72°C延伸6 min。
1.6.3 第2轮PCR 反应体积40 μl。由4 μl第1轮PCR产物和36μl反应混合液(含10×PCR缓冲液4 μl、每种2 mmol/L dNTP 4 μl、两条内引物各10 pM、Taq DNA聚合酶2U)组成。参数为：①94°C 1 min, 50°C 1 min, 70°C 2 min，循环3周；②继之94°C 30 s, 50°C 40 s,70°C 40 s(每周递增1 s)，循环37周；③最后于72°C延伸反应6 min结束。以上温育反应均在Bransteadl Thermolyne公司出品的自动化热循环仪上进行。
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1.6.4 GBV-C/HGV负链RNA的RT-nPCR扩增产物分析 取第2轮PCR扩增产物10μl加入含溴乙锭的2%琼脂糖凝胶中电泳。
2 结果
2.1 GBV-C/HGV负链RNA检测的特异性
为防止假阳性的出现，每次试验中均随机插入2例正常人血清或PBMC。18例正常人血清、PBMC均按实验组病人血清、PBMC一样提取RNA，然后进行RT-nPCR检测，结果未发现有非特异性扩增带出现。检测肝组织时取2例正常人肝组织同实验组病人肝组织进行RNA提取及RT-nPCR检测，结果为阴性。
2.2 检测结果见表1
2.3 重复性试验 将10例肝组织中检出GBV-C/HGV RNA的提取液，冰壶内存放迅速移置本院消化内科实验室，按原实验方案及实验条件进行RT-nPCR检测，以上温育反应均在美国PE公司480型自动化热循环仪上进行。检测结果同前，10例肝组织中GBV-C/HGV RNA阳性和2例单一感染组病人肝组织中GBV-C/HGV负链RNA阳性。
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2.4 PBMC最后一次洗涤液检测
将最后一次冲洗PBMC的RPMI 1640液体，按上述方法提取RNA、RT-nPCR检测，结果未检出GBV-C/HGV RNA。
表1 肝炎病人GBV-C/HGV负链RNA检测结果
Tab 1 Results of GBV-C/HGV RNA detection
in hepatitis patients Type of
infection
Case
Serum
PBMC
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Liver
Plus
Minus
Plus
Minus
Plus
Minus
Co-infection
13
13
0
4
0
, 百拇医药
6
0
Single-infection
8
8
0
3
0
4
2
Chronic hepatitis C
6
0
, 百拇医药
0
0
0
0
0
Total
27
21
0
7
0
10
2
3 讨论
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自从肝炎病人血清中克隆成功GBV-C及HGV以来，该病毒的定居及复制场所已成为病毒学专家们感兴趣的课题。Karayiannis等[7]于1997年初报道了在GBV-C/HGV RNA阳性病人PBMC中检测到该病毒RNA，并提出了HGV可能类似CMV或EBV，肝脏不是其特定寄居及侵袭场所，只是在某种条件下可致肝脏损害而已。继而，Madejon等[8]报道，在慢性肝病患者的血清，外周血单核细胞和肝脏内均检测到正链GBV-C/HGV RNA，但仅在肝脏检测到负链RNA。Saito等[3]从6例肝炎病人肝脏检测到HGV负链RNA，其中2例病人的血清和1例病人的外周血单核细胞也检测到HGV负链RNA。上述两篇报道的作者们认为GBV-C/HGV是在肝脏复制的嗜肝病毒。但Laskus等[9]的研究得出完全相反的结论，10例血清HGV RNA阳性慢性肝病患者中，9例HCV RNA也为阳性，6例在肝脏检测到正链HGV RNA，均未检测到负链HGV RNA。与此同时，9例均在肝脏检测到正链HCV RNA者，其中7例也检测到负链HCV RNA，提示至少在与HCV合并感染者中，肝脏不是HGV复制部位。Laskus等[10]继续报道在美国不明原因肝硬化病人中检测到6例血清HGV RNA阳性，其中5例在肝脏中检测到正链HGV RNA，6例均未检测到负链HGV RNA，再次证明肝脏不是HGV的复制场所的观点。最近，Radkowski等[11]报道9例血清GBV-C/HGV RNA阳性病人中，5例病人外周血单核细胞中检测到正链GBV-C/HGV RNA，病人PBMC中均未检测到负链GBV-C/HGV RNA，结论认为PBMC不是GBV-C/HGV的复制场所。上述3篇论文[9～11]的报道均出自美国匹兹堡医学中心同一实验室的结果，其可信程度有待证实。国内目前尚未见关于GBV-C/HGV复制研究的报道。
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由于PCR技术具有极高的灵敏度，只要肝组织中存在微量来自血液的病毒就可能出现阳性反应。Takehara等[6]应用RT-PCR技术研究9例慢性肝炎、肝硬化患者的肝组织、血清和PBMC中负链HCV RNA，发现它只存在于肝组织中，而血清、PBMC中则为阴性，说明这种技术可以避免肝组织中的HCV RNA是来自血液的污染。实践证明，检测负链HCV RNA能较准确地反映受检组织中HCV的存在与复制状况。HCV负链RNA检测的成功，给我们的研究带来启示。单纯检测肝组织中正链GBV-C/HGV RNA的方法，难以确切反映肝组织中GBV-C/HGV的存在与复制状况。从理论上讲，与正链GBV-C/HGV RNA相互补的负链RNA(复制中间体)只存在于有病毒复制的组织和细胞，检测患者肝组织中的负链GBV-C/HGV RNA可以避免肝组织来自血液循环毒粒的污染，能够准确地反映受检患者肝组织中GBV-C/HGV RNA的复制状况。
我们参照Takehara等及Saito等介绍的方法，在逆转录反应时仅加入与负链GBV-C/HGV RNA互补的有义外引物，等逆转录反应结束，将逆转录酶变性灭活后再加入反义外引物，然后进行巢式PCR扩增。结果发现2例单一GBV-C/HGV感染者肝组织中存在GBV-C/HGV负链RNA，而对照血清及正常人肝组织检测均阴性。这2例病人血清、PBMC及肝组织中GBV-C/HGV正链RNA均为阳性，但未能从血清、PBMC中检出负链RNA。如用血液污染来解释这个结果显然是不合适的。由于从单一GBV-C/HGV感染者获得肝组织标本十分困难，虽然本研究例数太少，难以得出肯定性结论，但重复性试验证实确实在单一GBV-C/HGV感染者肝组织中检出负链RNA，提示肝脏可能是GBV-C/HGV复制的场所之一，至少在单一GBV-C/HGV感染病人中如此，也说明GBV-C/HGV对肝脏是有亲和性的。
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RT-nPCR的技术要求相对较高，操作过程中要谨防污染，实验过程应随时插入至少2例阳性对照，以保证实验的特异性。本组实验在同时检测丙型肝炎病人的血清、PBMC及肝脏标本时，均未检出GBV-C/HGV RNA，加之18例正常人对照以及PBMC洗涤液的检测结果均为阴性，为本实验的特异性提供了保证。
从目前资料分析，多家报道了GBV-C/HGV RNA阳性病人PBMC中可检测到GBV-C/HGV RNA[3，7～12]。这些研究结果如象Alter[13]所言检测病人PBMC及肝脏中的GBV-C/HGV RNA均采用RT-PCR法，PCR反应阳性有可能来源于污染的血或肝细胞外的其它组织细胞，这一论断似难以令人信服，何况上述研究均进行了特异性确证实验。至于GBV-C/HGV感染者PBMC中有GBV-C/HGV RNA存在究竟有何意义，尚值得进一步探讨。
*聂青和，男，37岁，副主任医师，博士，现在第四军医大学附属唐都医院传染科 西安，710038
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参考文献
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2 Lanford R E, Sureau C, Jacob J R,et al. Demonstration of in vitro infection of chimpanzee hepatocytes with hepatitis C virus using strand-specific RT/PCR. Virology,1994,202(2):606
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3 Saito S, Tanaka K, Kondo M, et al. Plus-and minus-stranded hepatitis G virus RNA in liver tissue and in peripheral blood mononuclear cells. Biochem Biophys Res Commun,1997,237(2):288
4 Chomzynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem,1987,162(1):156
5 Yoffe B, Noonan C A, Melnick J L, et al. Hepatitis B virus DNA in mononuclear cells and analysis of cell subsets for the presence of replicative intermediates of viral DNA. J Infect Dis,1986,153(3):471
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6 Takehara T, Hayashi N, Mita E, et al. Detection of the minus strand of hepatitis C virus RNA by reverse transcription and polymerase chain reaction:Implications of hepatitis C virus replication in infected tissue. Hepatology,1992,15:387
7 Karayiannis P, Hadziyannis S J, Kim J, et al. Hepatitis G virus infection: Clinical characteristics and response to interferon. J Viral Hepatitis,1997,4(1):37
8 Medejon A, Fogeda M, Bartolome J, et al. GB virus C RNA in serum, liver, and peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic hepatitis B, C and D. Gastroenterology,1997,113(2):573
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9 Laskus T, Radkowski M, Wang L F, et al. Lack of evidence for hepatitis G virus replication in the livers of patients coinfected with hepatitis C and G viruses. J Virol,1997,71(10):7804
10 Laskus T, Wang L F, Radkowski M, et al. Hepatitis G virus infection in American patients with cryptogenic cirrhosis: No evidence for liver replication. J Infect Dis,1997,176(6):1491
11 Radkowski M, Wang L F, Vargas H, et al. Lack of evidence for GB virus C/hepatitis G virus replication in peripheral blood mononuclear cells. J Hepatol,1998,28(2):179
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12 Sheng L, Soumillon A, Peerlinck K, et al. Hepatitis G virus RNA in serum and peripheral blood mononuclear cells and its relation to HCV-RNA in patients with lotting disorders. Thromb Haemost,1997,77(5):868
13 Alter H J. G-pers, where′d you get those papers? A reassessment of the literature on the hepatitis G virus. Transfusion,1997,37(6):569
收稿：1998-06-01；修回：1998-12-29, 百拇医药