一种改良的质粒DNA的快速提取方法技术方法
作者：刘贤华 白晓军胡川闽 王军平 粟永萍
单位：刘贤华白晓军胡川闽 王军平 粟永萍 第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所 重庆，400038
关键词：质粒DNA；快速；提取；酶切
An improved method for rapid isolation of plasmid DNAAn improved method for rapid isolation of plasmid DNA
提 要 目的：建立一种确实有效的更实用的小量质粒DNA的提取方法。方法：将一含有目的质粒的大肠杆菌扩增后采用改良后的方法提取质粒DNA，然后采用紫外分光光度计测定含量，并且进行酶切。结果：每毫升原细菌培养物质粒DNA的产量明显增高，且酶切效果极好。结论：改良后的质粒DNA提取法具有速度快、收获量多、纯度高、经济又方便等优点，适合于应用与推广。
, 百拇医药
中图法分类号 R394
质粒DNA的提取是分子生物学研究中的基本技术，有关质粒DNA的提取已有不少方法。本文所介绍的是经我所反复实践，现已常规应用的基于碱裂解法[1]的一种改良的质粒DNA的快速提取方法。它主要有4个优点：①速度极快；②质粒DNA的收获量多，纯度高，可直接用于酶切、克隆等；③所配试剂可长时间保存，随时可进行质粒DNA的提取；④不需用特殊试剂，很大程度上节约了经费。
1 材料和方法
试剂及配制：①Ⅰ号液:8%蔗糖+50 mmol/L EDTA+2% Tritonx-100；②Ⅱ号液:0.2 mol/L NaOH；③Ⅲ号液:3 mol/L NaAC pH4.8；④Ⅳ号液:1 mol/L Tris；⑤平衡酚；⑥70%酒精；⑦24∶1的氯仿∶异戊醇；⑧异丙醇。
操作步骤：①从琼脂平板上挑取一含有目的质粒的大肠杆菌单菌落接种到标准LB培养基(每1 ml培养基含氨苄青100 mg)中生长12 h左右。②收集细菌，5 000 r/min离心5min(3 ml菌液，分2次离心)，弃上清。③沉淀中加Ⅰ号液150μl，充分弹匀，使细菌分散良好。④加Ⅱ号液300 μl，颠倒数次，使之混成稠糊状。⑤加Ⅲ号液150 μl，轻柔混匀。⑥加Ⅳ号液150 μl，轻柔混匀后，12 000 r/min离心10 min，取上清，弃沉淀。⑦加RNase酶(10 mg/ml)1 μl,55°C水浴5 min。⑧等体积酚与氯仿∶异戊醇1∶1抽提，12 000 r/min离心10 min。⑨吸上层水相，加0.5 ml异丙醇沉淀质粒，12 000 r/min离心15 min，弃上清。1070%冻乙醇洗沉淀，12 000 r/min离心10 min。11弃乙醇，自然干燥。12将质粒DNA溶于20 μl灭菌双蒸水中，紫外分光光度计测定含量后进行酶切。
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2 结果
经紫外分光光度计测定，每毫升原细菌培养物质粒DNA的产量为4～6 μg。
酶切结果见图1。
图1 质粒的提取、酶切和目的片段的电泳结果
a：PCR Marker b：酶切质粒 c：质粒
3 讨论
小量质粒DNA的快速提取方法实际上是一种碱裂解法。其基本原理是：Ⅰ号液破坏细菌膜，Ⅱ号液变性蛋白质和少量质粒，Ⅲ号液和Ⅳ号液是使质粒DNA复性而得以与染色体DNA分离。所以在加Ⅰ号液后一定要充分弹匀，使细菌沉淀在Ⅰ号液中完全分散才能得到更高产率的质粒DNA。加Ⅱ号液后，混匀动作要轻柔，以免机械剪切已变性的质粒DNA和染色体基因组DNA。据文献[1，2]报道小量质粒DNA的制备也需Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ号液，但各号液体的组成成份较多，配制过程繁琐，所以在本方法中作者按照他们的基本原理，综合采用试剂，优化试剂的配制，简化了质粒的提取过程。
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加RNase酶水浴时，温度和时间一定要足够，否则，所提到的质粒DNA中会混有小分子RNA的污染。
在离心收集细菌时培养基要尽量去除干净，另外，在酚∶氯仿抽提后吸取上清液时，注意不要将水相下层的蛋白质等杂质吸入，不注意以上两点，在进行酶切时便会发现质粒DNA不能被限制酶所切割。
在偶然的情况下，会出现无质粒DNA的现象，这极可能是由于质粒已同乙醇一起被弃去，所以在进行70%冻乙醇洗沉淀时一定要小心操作。
据Itoh[3]和Ng[4]的有关文献报道，采用特制的滤过膜或滤过柱也可以达到快速提取质粒的目的。但是膜和柱子的造价太高，试剂保存时间也受一定限制。而本方法中所配制的液体除酚和70%乙醇需冷藏以外，其它试剂均在室温保存，且保存时间可长达1年左右，这使得质粒DNA的提取变得方便且迅速，整个质粒提取过程约需1.5 h即可。而且，所提取的质粒DNA数量和质量都很理想，可直接用于酶切、克隆等，也不需使用特殊试剂，很大程度上节约了经费。若想制备更多量的质粒时，只需成比例地加大细菌量与试剂加入量即可收获大量的质粒DNA。
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*国家自然科学基金资助项目，No.39770237
**刘贤华，女，26岁，实验师
***山西省太原市结核病医院 太原，030053
参考文献
1 [美]丁萨姆布鲁克，金冬雁.分子克隆实验指南.北京：科学出版社，1996.16～26
2 卢圣栋 主编.现代分子生物学实验技术.北京：高等教育出版社，1993.107～111
3 Itoh M, Carninci P, Nagaoka S,et al. Simple and rapid preparation of plasmid template by a filtration method using microtiter filter plates. Nucleic Acids Res,1997，25(6):1315
4 Ng W L, Schummer M, Cirisano F D，et al. High-throughput plasmid mini preparations facilitated by micro-mixing. Nucleic Acid Res,1996，24(24):5045
收稿：1998-06-18；修回：1998-11-24, http://www.100md.com
单位：刘贤华白晓军胡川闽 王军平 粟永萍 第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所 重庆，400038
关键词：质粒DNA；快速；提取；酶切
An improved method for rapid isolation of plasmid DNAAn improved method for rapid isolation of plasmid DNA
提 要 目的：建立一种确实有效的更实用的小量质粒DNA的提取方法。方法：将一含有目的质粒的大肠杆菌扩增后采用改良后的方法提取质粒DNA，然后采用紫外分光光度计测定含量，并且进行酶切。结果：每毫升原细菌培养物质粒DNA的产量明显增高，且酶切效果极好。结论：改良后的质粒DNA提取法具有速度快、收获量多、纯度高、经济又方便等优点，适合于应用与推广。
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中图法分类号 R394
质粒DNA的提取是分子生物学研究中的基本技术，有关质粒DNA的提取已有不少方法。本文所介绍的是经我所反复实践，现已常规应用的基于碱裂解法[1]的一种改良的质粒DNA的快速提取方法。它主要有4个优点：①速度极快；②质粒DNA的收获量多，纯度高，可直接用于酶切、克隆等；③所配试剂可长时间保存，随时可进行质粒DNA的提取；④不需用特殊试剂，很大程度上节约了经费。
1 材料和方法
试剂及配制：①Ⅰ号液:8%蔗糖+50 mmol/L EDTA+2% Tritonx-100；②Ⅱ号液:0.2 mol/L NaOH；③Ⅲ号液:3 mol/L NaAC pH4.8；④Ⅳ号液:1 mol/L Tris；⑤平衡酚；⑥70%酒精；⑦24∶1的氯仿∶异戊醇；⑧异丙醇。
操作步骤：①从琼脂平板上挑取一含有目的质粒的大肠杆菌单菌落接种到标准LB培养基(每1 ml培养基含氨苄青100 mg)中生长12 h左右。②收集细菌，5 000 r/min离心5min(3 ml菌液，分2次离心)，弃上清。③沉淀中加Ⅰ号液150μl，充分弹匀，使细菌分散良好。④加Ⅱ号液300 μl，颠倒数次，使之混成稠糊状。⑤加Ⅲ号液150 μl，轻柔混匀。⑥加Ⅳ号液150 μl，轻柔混匀后，12 000 r/min离心10 min，取上清，弃沉淀。⑦加RNase酶(10 mg/ml)1 μl,55°C水浴5 min。⑧等体积酚与氯仿∶异戊醇1∶1抽提，12 000 r/min离心10 min。⑨吸上层水相，加0.5 ml异丙醇沉淀质粒，12 000 r/min离心15 min，弃上清。1070%冻乙醇洗沉淀，12 000 r/min离心10 min。11弃乙醇，自然干燥。12将质粒DNA溶于20 μl灭菌双蒸水中，紫外分光光度计测定含量后进行酶切。
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2 结果
经紫外分光光度计测定，每毫升原细菌培养物质粒DNA的产量为4～6 μg。
酶切结果见图1。
图1 质粒的提取、酶切和目的片段的电泳结果
a：PCR Marker b：酶切质粒 c：质粒
3 讨论
小量质粒DNA的快速提取方法实际上是一种碱裂解法。其基本原理是：Ⅰ号液破坏细菌膜，Ⅱ号液变性蛋白质和少量质粒，Ⅲ号液和Ⅳ号液是使质粒DNA复性而得以与染色体DNA分离。所以在加Ⅰ号液后一定要充分弹匀，使细菌沉淀在Ⅰ号液中完全分散才能得到更高产率的质粒DNA。加Ⅱ号液后，混匀动作要轻柔，以免机械剪切已变性的质粒DNA和染色体基因组DNA。据文献[1，2]报道小量质粒DNA的制备也需Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ号液，但各号液体的组成成份较多，配制过程繁琐，所以在本方法中作者按照他们的基本原理，综合采用试剂，优化试剂的配制，简化了质粒的提取过程。
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加RNase酶水浴时，温度和时间一定要足够，否则，所提到的质粒DNA中会混有小分子RNA的污染。
在离心收集细菌时培养基要尽量去除干净，另外，在酚∶氯仿抽提后吸取上清液时，注意不要将水相下层的蛋白质等杂质吸入，不注意以上两点，在进行酶切时便会发现质粒DNA不能被限制酶所切割。
在偶然的情况下，会出现无质粒DNA的现象，这极可能是由于质粒已同乙醇一起被弃去，所以在进行70%冻乙醇洗沉淀时一定要小心操作。
据Itoh[3]和Ng[4]的有关文献报道，采用特制的滤过膜或滤过柱也可以达到快速提取质粒的目的。但是膜和柱子的造价太高，试剂保存时间也受一定限制。而本方法中所配制的液体除酚和70%乙醇需冷藏以外，其它试剂均在室温保存，且保存时间可长达1年左右，这使得质粒DNA的提取变得方便且迅速，整个质粒提取过程约需1.5 h即可。而且，所提取的质粒DNA数量和质量都很理想，可直接用于酶切、克隆等，也不需使用特殊试剂，很大程度上节约了经费。若想制备更多量的质粒时，只需成比例地加大细菌量与试剂加入量即可收获大量的质粒DNA。
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*国家自然科学基金资助项目，No.39770237
**刘贤华，女，26岁，实验师
***山西省太原市结核病医院 太原，030053
参考文献
1 [美]丁萨姆布鲁克，金冬雁.分子克隆实验指南.北京：科学出版社，1996.16～26
2 卢圣栋 主编.现代分子生物学实验技术.北京：高等教育出版社，1993.107～111
3 Itoh M, Carninci P, Nagaoka S,et al. Simple and rapid preparation of plasmid template by a filtration method using microtiter filter plates. Nucleic Acids Res,1997，25(6):1315
4 Ng W L, Schummer M, Cirisano F D，et al. High-throughput plasmid mini preparations facilitated by micro-mixing. Nucleic Acid Res,1996，24(24):5045
收稿：1998-06-18；修回：1998-11-24, http://www.100md.com