血管内皮生长因子在恶性骨肿瘤中的表达及其与转移的关系
作者：殷国勇 张学军 陶松年 董天华
单位：殷国勇 陶松年 南京医科大学第一附属医院骨科，邮政编码：210029；张学军 中科院上海细胞生物学研究所；董天华 苏州医学院第一附属医院骨科
关键词：免疫组化 恶性骨肿瘤 血管内皮生长因子
江苏医药990707 摘要 应用免疫组化方法对21例恶性骨肿瘤进行血管内皮细胞生长因子(VEGF)的免疫检测和血管计数。发现在10例有转移的恶性骨肿瘤中有7例为阳性，且多为强表达；11例无转移的恶性骨肿瘤中有4例为阳性，且多为弱表达(P<0.05)。在5例强表达者中，有4例发生转移；而在3例弱表达者中只有1例发生转移。肿瘤的血管计数表明：转移组肿瘤微血管数高于无转移组(P<0.05)。VEGF蛋白阳性组肿瘤血管数高于VEGF蛋白阴性组(P<0.01)。
Aligier在1945年就提出了肿瘤“血管新生”(neovas cularisation)的概念。原发性肿瘤和转移性肿瘤生长的首要条件是血管形成，对于实体瘤而言，当细胞数达到106时若无新生血管形成则其直径很少超过1～2mm[1]。肿瘤的血管形成与多种生长因子的刺激有关，其中血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)在肿瘤的血管形成中起至关重要的作用。我们对1993年～1998年所收集的恶性骨肿瘤样本，采用免疫组化方法，结合肿瘤血管数量的测定，以了解VEGF在肿瘤发生和转移过程中的价值以及对预后的影响。
, 百拇医药
材料与方法
一、材料来源：21例经病理诊断确诊的恶性骨肿瘤，其中男16例，女5例；年龄最小8岁，最大43岁，平均22岁。成骨肉瘤14例，软骨肉瘤4例，恶性纤维组织细胞瘤3例。原发部位：股骨下段13例，胫骨上段6例，胫骨下段1例，股骨上段1例，10例发生转移。部分标本经4%的多聚甲醛固定4～6小时，常规石蜡包埋，另取部分放于液氮保存。
二、VEGF免疫组化染色：5μm石蜡切片经SABC法显示VEGF。SABC试剂盒购于武汉博士德生物工程公司。兔抗人VEGF165由中国科学院药物研究所郑世曦博士后提供，其工作浓度为1∶60。用已知的VEGF阳性的肾组织作为对照。用1%H2O2-甲醇溶液封闭内源性的过氧化物酶。0.1%胰蛋白酶(含1%CaCl2)消化，正常的羊血清(1∶50)封闭，加兔抗人VEGF抗体置4℃，24小时；加二抗生物素化的羊抗兔抗体(1∶80)，37℃，1小时；滴加SABC(1∶80)，37℃，1小时；滴加0.005%H2O2-0.05%DAB(Sigma)室温4分钟；流水充分冲洗，苏木素复染细胞核；盐酸酒精适度分化；常规脱水，透明封片。结果判定：阳性结果为棕黄色颗粒，分布于胞浆，按其颜色深浅分别记为+、
和
。阴性对照：以PBS代替二抗，其余步骤同上。
, 百拇医药
三、肿瘤血管染色及计数：(1)5μm石蜡切片经SABC法显示血管、淋巴管及肿瘤的内皮细胞中的Ⅷ因子相关抗原。兔抗人抗体系Sigma公司产品，工作浓度为1∶200，具体过程同上，但不用苏木素染色脱核和盐酸酒精适度分化，常规脱水、透明和封片。(2)肿瘤血管计数按参考文献进行[2]。①阳性结果判定：凡是在肿瘤组织中与邻近微血管和肿瘤细胞分界清楚并被染成棕黄色的单个内皮细胞集成细胞群均认为是新生的肿瘤血管；②计数方法：在放大40倍的视野中，随机选择5个新生血管密集区，在400倍视野下计数并取平均数即为新生血管数。
结 果
一、VEGF免疫组化结果：在10例有转移的恶性骨肿瘤中有7例阳性(6例是成骨肉瘤，1例是软骨肉瘤)，阳性颗粒主要是分布在癌细胞的胞浆内，染色强。11例无转移的标本中，有4例为阳性，染色浅；按癌细胞的染色强度分为+、
和
，结果见附表。
, 百拇医药
附表 VEGF蛋白在恶性骨肿瘤中的表达 分组
例数
染色强度
-
+
有转移
10
3
, 百拇医药
1
2
4
无转移
11
7
2
1
1
经χ2检验P<0.05。在3例VEGF蛋白弱表达者中，有1例发生转移(33.3%)。3例VEGF蛋白中度表达者中有2例发生转移(66.6%)。而在5例VEGF蛋白强表达者中有4例发生转移(80.0%)。
二、肿瘤微血管计数及其与VEGF蛋白表达的关系：10例有转移的恶性骨肿瘤组织中，肿瘤微血管数为14.79±5.10。11例无转移的恶性骨肿瘤组织中，肿瘤的微血管数为10.11±4.08(P<0.05)。VEGF蛋白阳性组肿瘤血管数为15.71±5.90，阴性组肿瘤血管计数为9.63±2.96，两组有显著差异(P<0.01)。讨 论
, 百拇医药
肿瘤内血管内皮细胞的增殖是正常组织的30～40倍。肿瘤的血管形成过程极为复杂，其中VEGF发挥了极其重要的作用。人类的VEGF蛋白有四种异构物，分别由121、165、189、205个氨基酸组成，其中含165个氨基酸的蛋白质在组织中的含量最高，分布最广。VEGF能与组织中的血管内皮细胞表面的酪氨酸激酶受体紧密结合，通过内皮细胞的内囊泡发挥作用，形成一些有利于大分子物质通过的小窗[3]。VEGF还促进不同来源的内皮细胞分裂增殖，以利于血管构建，同时还促进内皮细胞的迁移[4]。
VEGF和肿瘤转移的关系也很密切，曾认为它可作为衡量胃癌转移与预后的一个独立指标[5]。作者以VEGF蛋白水平对人类恶性骨肿瘤进行研究，结果与文献报道相一致。恶性骨肿瘤中VEGF蛋白的表达与肿瘤的血管数量的关系，表明VEGF蛋白阳性组肿瘤血管数显著高于VEGF蛋白阴性组，证实了VEGF在恶性骨肿瘤中能促进血管形成。本实验还证实VEGF的表达和恶性骨肿瘤的转移密切相关。这是通过VEGF能促进内皮细胞的增殖而实现的，原位杂交显示原癌基因C-etsl存在于血管形成开始时的血管内皮细胞，C-etsl编码的蛋白质能特异性地连结于DNA的特定部位，而这些部位和尿源型纤维蛋白酶原激动剂(μPA)相关。μPA的前体Pro-μPA和细胞表面的μPA受体特异性地结合产生成熟的μPA，能激活细胞表面的纤溶酶原使其转化成纤溶酶，随后纤溶酶就降解肿瘤细胞外基质，同时它还激活Ⅳ型胶原酶使之降解基底膜的主要成份Ⅳ型胶原，从而促进肿瘤细胞的转移[6]。
, 百拇医药
目前针对VEGF及其受体的抗血管治疗已经从实验走向临床。苏拉明(Suramin)可选择性地与亲肝素的血管生长因子结合，抑制了它与受体的结合，从而抑制VEGF诱导的血管内皮细胞的增殖和迁移。用VEGF及其受体的单克隆抗体，也成功地阻滞了肿瘤的血管形成，达到了抑制肿瘤生长与转移的目的。
因此，VEGF是衡量肿瘤生长和转移的指标，也可能是控制肿瘤生长和转移的突破口。
参考文献
?[1] Folkman J, et al. J Natl Cancer Inst 1989；82：4.
?[2] Dvork HF, et al. Cancer Res 1995；55：1029.
?[3] Nagy JA,et al. Biochim Biophys Acta 1989；948：305.
?[4] Peper MS, et al. Biochim Biophys Res Commun 1991；181：902.
?[5] Maeda K, et al. Cancer 1996；77：858.
?[6] Moscateli D, et al. J Cell Biolog 1981；91：210.
(1998年9月15日收稿 1999年2月13日修回), 百拇医药
单位：殷国勇 陶松年 南京医科大学第一附属医院骨科，邮政编码：210029；张学军 中科院上海细胞生物学研究所；董天华 苏州医学院第一附属医院骨科
关键词：免疫组化 恶性骨肿瘤 血管内皮生长因子
江苏医药990707 摘要 应用免疫组化方法对21例恶性骨肿瘤进行血管内皮细胞生长因子(VEGF)的免疫检测和血管计数。发现在10例有转移的恶性骨肿瘤中有7例为阳性，且多为强表达；11例无转移的恶性骨肿瘤中有4例为阳性，且多为弱表达(P<0.05)。在5例强表达者中，有4例发生转移；而在3例弱表达者中只有1例发生转移。肿瘤的血管计数表明：转移组肿瘤微血管数高于无转移组(P<0.05)。VEGF蛋白阳性组肿瘤血管数高于VEGF蛋白阴性组(P<0.01)。
Aligier在1945年就提出了肿瘤“血管新生”(neovas cularisation)的概念。原发性肿瘤和转移性肿瘤生长的首要条件是血管形成，对于实体瘤而言，当细胞数达到106时若无新生血管形成则其直径很少超过1～2mm[1]。肿瘤的血管形成与多种生长因子的刺激有关，其中血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)在肿瘤的血管形成中起至关重要的作用。我们对1993年～1998年所收集的恶性骨肿瘤样本，采用免疫组化方法，结合肿瘤血管数量的测定，以了解VEGF在肿瘤发生和转移过程中的价值以及对预后的影响。
, 百拇医药
材料与方法
一、材料来源：21例经病理诊断确诊的恶性骨肿瘤，其中男16例，女5例；年龄最小8岁，最大43岁，平均22岁。成骨肉瘤14例，软骨肉瘤4例，恶性纤维组织细胞瘤3例。原发部位：股骨下段13例，胫骨上段6例，胫骨下段1例，股骨上段1例，10例发生转移。部分标本经4%的多聚甲醛固定4～6小时，常规石蜡包埋，另取部分放于液氮保存。
二、VEGF免疫组化染色：5μm石蜡切片经SABC法显示VEGF。SABC试剂盒购于武汉博士德生物工程公司。兔抗人VEGF165由中国科学院药物研究所郑世曦博士后提供，其工作浓度为1∶60。用已知的VEGF阳性的肾组织作为对照。用1%H2O2-甲醇溶液封闭内源性的过氧化物酶。0.1%胰蛋白酶(含1%CaCl2)消化，正常的羊血清(1∶50)封闭，加兔抗人VEGF抗体置4℃，24小时；加二抗生物素化的羊抗兔抗体(1∶80)，37℃，1小时；滴加SABC(1∶80)，37℃，1小时；滴加0.005%H2O2-0.05%DAB(Sigma)室温4分钟；流水充分冲洗，苏木素复染细胞核；盐酸酒精适度分化；常规脱水，透明封片。结果判定：阳性结果为棕黄色颗粒，分布于胞浆，按其颜色深浅分别记为+、
和。阴性对照：以PBS代替二抗，其余步骤同上。, 百拇医药
三、肿瘤血管染色及计数：(1)5μm石蜡切片经SABC法显示血管、淋巴管及肿瘤的内皮细胞中的Ⅷ因子相关抗原。兔抗人抗体系Sigma公司产品，工作浓度为1∶200，具体过程同上，但不用苏木素染色脱核和盐酸酒精适度分化，常规脱水、透明和封片。(2)肿瘤血管计数按参考文献进行[2]。①阳性结果判定：凡是在肿瘤组织中与邻近微血管和肿瘤细胞分界清楚并被染成棕黄色的单个内皮细胞集成细胞群均认为是新生的肿瘤血管；②计数方法：在放大40倍的视野中，随机选择5个新生血管密集区，在400倍视野下计数并取平均数即为新生血管数。
结 果
一、VEGF免疫组化结果：在10例有转移的恶性骨肿瘤中有7例阳性(6例是成骨肉瘤，1例是软骨肉瘤)，阳性颗粒主要是分布在癌细胞的胞浆内，染色强。11例无转移的标本中，有4例为阳性，染色浅；按癌细胞的染色强度分为+、
和，结果见附表。, 百拇医药
附表 VEGF蛋白在恶性骨肿瘤中的表达 分组
例数
染色强度
-
+
有转移
10
3
, 百拇医药
1
2
4
无转移
11
7
2
1
1
经χ2检验P<0.05。在3例VEGF蛋白弱表达者中，有1例发生转移(33.3%)。3例VEGF蛋白中度表达者中有2例发生转移(66.6%)。而在5例VEGF蛋白强表达者中有4例发生转移(80.0%)。
二、肿瘤微血管计数及其与VEGF蛋白表达的关系：10例有转移的恶性骨肿瘤组织中，肿瘤微血管数为14.79±5.10。11例无转移的恶性骨肿瘤组织中，肿瘤的微血管数为10.11±4.08(P<0.05)。VEGF蛋白阳性组肿瘤血管数为15.71±5.90，阴性组肿瘤血管计数为9.63±2.96，两组有显著差异(P<0.01)。讨 论
, 百拇医药
肿瘤内血管内皮细胞的增殖是正常组织的30～40倍。肿瘤的血管形成过程极为复杂，其中VEGF发挥了极其重要的作用。人类的VEGF蛋白有四种异构物，分别由121、165、189、205个氨基酸组成，其中含165个氨基酸的蛋白质在组织中的含量最高，分布最广。VEGF能与组织中的血管内皮细胞表面的酪氨酸激酶受体紧密结合，通过内皮细胞的内囊泡发挥作用，形成一些有利于大分子物质通过的小窗[3]。VEGF还促进不同来源的内皮细胞分裂增殖，以利于血管构建，同时还促进内皮细胞的迁移[4]。
VEGF和肿瘤转移的关系也很密切，曾认为它可作为衡量胃癌转移与预后的一个独立指标[5]。作者以VEGF蛋白水平对人类恶性骨肿瘤进行研究，结果与文献报道相一致。恶性骨肿瘤中VEGF蛋白的表达与肿瘤的血管数量的关系，表明VEGF蛋白阳性组肿瘤血管数显著高于VEGF蛋白阴性组，证实了VEGF在恶性骨肿瘤中能促进血管形成。本实验还证实VEGF的表达和恶性骨肿瘤的转移密切相关。这是通过VEGF能促进内皮细胞的增殖而实现的，原位杂交显示原癌基因C-etsl存在于血管形成开始时的血管内皮细胞，C-etsl编码的蛋白质能特异性地连结于DNA的特定部位，而这些部位和尿源型纤维蛋白酶原激动剂(μPA)相关。μPA的前体Pro-μPA和细胞表面的μPA受体特异性地结合产生成熟的μPA，能激活细胞表面的纤溶酶原使其转化成纤溶酶，随后纤溶酶就降解肿瘤细胞外基质，同时它还激活Ⅳ型胶原酶使之降解基底膜的主要成份Ⅳ型胶原，从而促进肿瘤细胞的转移[6]。
, 百拇医药
目前针对VEGF及其受体的抗血管治疗已经从实验走向临床。苏拉明(Suramin)可选择性地与亲肝素的血管生长因子结合，抑制了它与受体的结合，从而抑制VEGF诱导的血管内皮细胞的增殖和迁移。用VEGF及其受体的单克隆抗体，也成功地阻滞了肿瘤的血管形成，达到了抑制肿瘤生长与转移的目的。
因此，VEGF是衡量肿瘤生长和转移的指标，也可能是控制肿瘤生长和转移的突破口。
参考文献
?[1] Folkman J, et al. J Natl Cancer Inst 1989；82：4.
?[2] Dvork HF, et al. Cancer Res 1995；55：1029.
?[3] Nagy JA,et al. Biochim Biophys Acta 1989；948：305.
?[4] Peper MS, et al. Biochim Biophys Res Commun 1991；181：902.
?[5] Maeda K, et al. Cancer 1996；77：858.
?[6] Moscateli D, et al. J Cell Biolog 1981；91：210.
(1998年9月15日收稿 1999年2月13日修回), 百拇医药