胸腺内预注射异基因脾细胞使移植心肺存活延长的实验研究
作者：邱小强 顾泗荣 沈振亚
单位：邱小强 苏州医学院附属儿童医院胸外科，邮政编码：215003；顾泗荣 苏州医学院附属第二医院胸外科；沈振亚 苏州医学院附属第一医院胸外科
关键词：大鼠 心脏移植 免疫耐受 胸腺 脾细胞
江苏医药990704 摘要 采用改良Fox-Lee术式建立大鼠异位心脏、肺叶联合移植模型。受体SD大鼠胸腺内预注射供体Wistar大鼠脾细胞5×107联合一次性腹腔注射抗淋巴细胞血清1ml，3周后接受移植，成功诱导免疫耐受，移植心肺不需免疫抑制剂而长期存活(MST＝78.00±22.66d)；对照组和空白对照组移植心肺均被排斥。其机制有待进一步深入研究。
器官移植是治疗晚期器官功能衰竭的有效方法，免疫排斥是器官移植最主要障碍。我们于1996年9月～1997年9月建立大鼠异位心脏带肺叶联合移植模型，探讨胸腺内移植供体脾细胞联合抗淋巴细胞血清ALS治疗能否诱导受体对移植心脏和肺叶的特异性免疫耐受。
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材料和方法
一、动物 受体为健康雄性SD大鼠，供体雄性Wistar大鼠，体重170～220g，随机配对，第三品系为雄性F311大鼠。
二、脾细胞的制备 供体大鼠在无菌条件下切除脾脏，剪碎制成脾细胞悬液，蒸馏水低渗去除红细胞，台盼蓝染色测定细胞活性，以RP1640液调定细胞含量为每毫升5×108，4℃冰箱保存。
三、受体大鼠移植手术前处理 参照Goss等[1～3]报道的方法受体大鼠胸腺内预注射脾细胞。采用胸骨正中部分切开术，麻醉后，切开胸部正中皮肤、部分胸骨，暴露胸腺，将含脾细胞的RP1640液0.1ml通过32号针头注入胸腺内。手术成功的大鼠，术后4小时腹腔注射兔抗鼠淋巴细胞血清1ml。
四、腹腔异位心脏肺叶联合移植术 本实验采用改良Fox-Lee[4，5]术式行心脏肺叶联合移植术。戊巴比妥钠麻醉，清洁手术。麻醉后，整块切取供体心肺组织；修剪移植心肺，切去左肺，大鼠右肺分三叶，并连带一尾状叶，分别结扎切除右上叶、右中叶、尾状叶，保留右肺下叶与心脏进行联合移植。准备受体移植区：经腹正中长切口进入腹腔，显露腹主动脉肾下段，斜上两只小血管夹，行腹主动脉造口，使其与供心升主动脉端口相匹配。在10倍手术显微镜下行供心肺叶联合移植术；用8～0无损伤线将供心胸主动脉与受体腹主动脉切口行单一端侧吻合。供心的循环方式为Fox[5]循环：血液从受体动脉→供心主动脉→冠状动脉→心肌→冠状静脉→右心房→右心室→肺动脉→肺泡→肺静脉→左心房→左心室→移植心收缩时，血液经主动脉射回受体动脉。术后24小时植心心跳规则有力，为移植手术成功进入实验分组。
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五、实验分组
A组：Wistar大鼠心脏肺叶移植给正常SD大鼠，术前不作处理，为空白对照组。
B组：Wistar→SD大鼠心脏肺叶移植，术前3周受体SD大鼠胸腺内注射供体Wistar大鼠脾细胞5×107，联合一次腹腔注射ALS 1ml。
C组：Wistar→SD大鼠心脏肺叶移植，术前3周受体处理同B组，但脾细胞来源于第三品系F311大鼠。以上各组移植术后均未使用免疫抑制剂。
结 果
一、一般情况 A组、C组大鼠移植后3～4天后出现反应迟钝，活动减少，毛发蓬乱无光泽，体重变化不明显。B组大鼠术后第二天起逐步恢复常态，反应灵敏，毛发整齐有光泽，进食良好，体重增加。
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二、存活情况 通过腹壁触诊了解供心存活情况，供心跳动规则有力为存活良好；供心停止跳动或大鼠死亡为排斥反应终点。见附表。
附表 移植心肺叶存活的情况 组别
术前治疗
供体
受体
存活天数(
±s)
A组
无
Wistar
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SD
6，7，8，8，9
(7.60±1.14)
B组
ALS+IT
Wistar SC
Wistar
SD
52，65，76，85，112
(78.00±22.66)
C组
ALS+IT
, 百拇医药
F311 SC
Wistar
SD
7，8，9，9，10
(8.60±1.14)
B组分别和A组、C组行t检验，P<0.01，有显著差异。
C组和A组行t检验，P>0.05，无差异。
三、组织病理学观察 供心、肺叶标本作常规病理检查。A组、C组心肌细胞间质及血管周围有大量淋巴细胞浸润、出血或水肿或坏死，肺组织见淋巴细胞浸润、出血、坏死，存在明显排斥反应。B组供心心肌细胞间质及血管周围未见淋巴细胞浸润，无出血、坏死、纤维化，肺组织仅见少许出血。A组、C组心肌标本透视电镜日立H-600下观察到心肌细胞结构明显破坏、肌丝模糊不清，有断裂溶解现象，周围线粒体肿胀，空泡形成，并见单核细胞浸润。
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四、统计学处 理计算各组存活时间的均数和方差，各组均数间进行t检验，比较其差异性。讨 论
器官移植是治疗器官功能衰竭的唯一有效的方法，免疫排斥是困扰器官移植的主要障碍。近20年来，免疫抑制剂的发明应用，提高了临床器官移植的成功率[6]，但长期使用有许多副作用[7]。1990年Posselt[8]在实验中将Lewis大鼠的胰岛移植到WF大鼠的不同部位，移植前14天受体腹腔注射ALS 1ml，结果发现ALS能延长移植胰岛的存活。ALS治疗后胸腺部位接受移植的受体大鼠长期存活(>200天)，移植胰岛功能良好，并且再次在肾被膜下移植同品系供体胰岛后未发生排斥反应。Posselt认为通过胸腺内移植联合一次性ALS治疗能诱导对供体的免疫耐受。此后Remuzzi等[9～11]报道了通过胸腺内预注射异基因细胞联合短期免疫治疗，在大鼠肾、心、肝、小肠等单一器官移植模型中成功诱导免疫耐受。本实验首次将胸腺内预注射异基因脾细胞联合一次性ALS治疗用于大鼠心脏肺叶联合移植模型。实验中发现经该方案处理的B组大鼠移植后长期存活，对照组A组移植后发生排斥，而胸腺内注射第三品系大鼠脾细胞的C组移植后也发生排斥现象。本实验证实了胸腺是新的免疫特惠器官的发现，通过胸腺途径能诱导免疫耐受，具有供体特异性，但无器官特异性，心脏和肺叶均不被排斥。胸腺内预注射异基因诱导特异性免疫耐受现象的机制尚未完全明了，对其机制的研究和阐明将促进临床器官移植的发展。有学者推测可能包括克隆清除、克隆受抑或无能状态和免疫抑制细胞的产生等[1，2，8，9，12]。
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ALS能溶解外周血中的成熟T淋巴和B淋巴细胞，延长移植物存活时间[13]。胸腺是培育形成各类不同特性T细胞的免疫器官。由于存在血―胸腺屏障，抗原异物不能进入胸腺内，胸腺内的异物抗原也不能外渗到血循环中，成熟T细胞很少到胸腺内，使进入胸腺内的异基因脾细胞能逃避免疫监视而长期存活。根据克隆选择学说，移植物抗原激活的同种特异性免疫克隆的扩增将导致移植排斥反应。异基因细胞进入胸腺后改变了胸腺内微环境，干扰干细胞的分化发育，使针对该种基因的免疫细胞克隆清除而无法扩增，但是仍保留其他免疫活性细胞克隆，新一代成熟T细胞视异基因抗原为自身抗原，由此产生免疫耐受，并具有抗原特异性即供体特异性，但无器官特异性。
参考文献
[1] Goss JA, et al. Transplant Proc 1992；24：2879.
[2] Kline G, et al. J Heart Lung Transplant 1993；12：388.
, http://www.100md.com
[3] Shen Z, et al. J Thorac Cardiovasc Surg 1994；107：
1472.
[4] Lee S, et al. Transplantation 1982;33：438.
[5] Fox U, et al. J Microsurg 1980；1：377.
[6] Bach FH, et al. N Engl J Med 1987；318：492.
[7] Walker RG, et al. Kidney Transplantation. Philadel-
phia: Saunders, 1988;319.
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[8] Posselt AM, et al. Science 1990；249：1293.
[9] Remuzzi G, et al. Lancet 1991；337：750.
[10] Odorico JS, et al. Surgery 1992；112：370.
[11] Kamada N. Semin Liver Dis 1992；12：1.
[12] Nakafusa Y, et al. Transplant Proc 1995；27(1)：128.
[13] 林飞卿，等.医学基础免疫学.上海：上海医科大学出版社，1990；189.
(1998年7月29日收稿 同年11月4日修回), http://www.100md.com
单位：邱小强 苏州医学院附属儿童医院胸外科，邮政编码：215003；顾泗荣 苏州医学院附属第二医院胸外科；沈振亚 苏州医学院附属第一医院胸外科
关键词：大鼠 心脏移植 免疫耐受 胸腺 脾细胞
江苏医药990704 摘要 采用改良Fox-Lee术式建立大鼠异位心脏、肺叶联合移植模型。受体SD大鼠胸腺内预注射供体Wistar大鼠脾细胞5×107联合一次性腹腔注射抗淋巴细胞血清1ml，3周后接受移植，成功诱导免疫耐受，移植心肺不需免疫抑制剂而长期存活(MST＝78.00±22.66d)；对照组和空白对照组移植心肺均被排斥。其机制有待进一步深入研究。
器官移植是治疗晚期器官功能衰竭的有效方法，免疫排斥是器官移植最主要障碍。我们于1996年9月～1997年9月建立大鼠异位心脏带肺叶联合移植模型，探讨胸腺内移植供体脾细胞联合抗淋巴细胞血清ALS治疗能否诱导受体对移植心脏和肺叶的特异性免疫耐受。
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材料和方法
一、动物 受体为健康雄性SD大鼠，供体雄性Wistar大鼠，体重170～220g，随机配对，第三品系为雄性F311大鼠。
二、脾细胞的制备 供体大鼠在无菌条件下切除脾脏，剪碎制成脾细胞悬液，蒸馏水低渗去除红细胞，台盼蓝染色测定细胞活性，以RP1640液调定细胞含量为每毫升5×108，4℃冰箱保存。
三、受体大鼠移植手术前处理 参照Goss等[1～3]报道的方法受体大鼠胸腺内预注射脾细胞。采用胸骨正中部分切开术，麻醉后，切开胸部正中皮肤、部分胸骨，暴露胸腺，将含脾细胞的RP1640液0.1ml通过32号针头注入胸腺内。手术成功的大鼠，术后4小时腹腔注射兔抗鼠淋巴细胞血清1ml。
四、腹腔异位心脏肺叶联合移植术 本实验采用改良Fox-Lee[4，5]术式行心脏肺叶联合移植术。戊巴比妥钠麻醉，清洁手术。麻醉后，整块切取供体心肺组织；修剪移植心肺，切去左肺，大鼠右肺分三叶，并连带一尾状叶，分别结扎切除右上叶、右中叶、尾状叶，保留右肺下叶与心脏进行联合移植。准备受体移植区：经腹正中长切口进入腹腔，显露腹主动脉肾下段，斜上两只小血管夹，行腹主动脉造口，使其与供心升主动脉端口相匹配。在10倍手术显微镜下行供心肺叶联合移植术；用8～0无损伤线将供心胸主动脉与受体腹主动脉切口行单一端侧吻合。供心的循环方式为Fox[5]循环：血液从受体动脉→供心主动脉→冠状动脉→心肌→冠状静脉→右心房→右心室→肺动脉→肺泡→肺静脉→左心房→左心室→移植心收缩时，血液经主动脉射回受体动脉。术后24小时植心心跳规则有力，为移植手术成功进入实验分组。
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五、实验分组
A组：Wistar大鼠心脏肺叶移植给正常SD大鼠，术前不作处理，为空白对照组。
B组：Wistar→SD大鼠心脏肺叶移植，术前3周受体SD大鼠胸腺内注射供体Wistar大鼠脾细胞5×107，联合一次腹腔注射ALS 1ml。
C组：Wistar→SD大鼠心脏肺叶移植，术前3周受体处理同B组，但脾细胞来源于第三品系F311大鼠。以上各组移植术后均未使用免疫抑制剂。
结 果
一、一般情况 A组、C组大鼠移植后3～4天后出现反应迟钝，活动减少，毛发蓬乱无光泽，体重变化不明显。B组大鼠术后第二天起逐步恢复常态，反应灵敏，毛发整齐有光泽，进食良好，体重增加。
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二、存活情况 通过腹壁触诊了解供心存活情况，供心跳动规则有力为存活良好；供心停止跳动或大鼠死亡为排斥反应终点。见附表。
附表 移植心肺叶存活的情况 组别
术前治疗
供体
受体
存活天数(
±s)A组
无
Wistar
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SD
6，7，8，8，9
(7.60±1.14)
B组
ALS+IT
Wistar SC
Wistar
SD
52，65，76，85，112
(78.00±22.66)
C组
ALS+IT
, 百拇医药
F311 SC
Wistar
SD
7，8，9，9，10
(8.60±1.14)
B组分别和A组、C组行t检验，P<0.01，有显著差异。
C组和A组行t检验，P>0.05，无差异。
三、组织病理学观察 供心、肺叶标本作常规病理检查。A组、C组心肌细胞间质及血管周围有大量淋巴细胞浸润、出血或水肿或坏死，肺组织见淋巴细胞浸润、出血、坏死，存在明显排斥反应。B组供心心肌细胞间质及血管周围未见淋巴细胞浸润，无出血、坏死、纤维化，肺组织仅见少许出血。A组、C组心肌标本透视电镜日立H-600下观察到心肌细胞结构明显破坏、肌丝模糊不清，有断裂溶解现象，周围线粒体肿胀，空泡形成，并见单核细胞浸润。
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四、统计学处 理计算各组存活时间的均数和方差，各组均数间进行t检验，比较其差异性。讨 论
器官移植是治疗器官功能衰竭的唯一有效的方法，免疫排斥是困扰器官移植的主要障碍。近20年来，免疫抑制剂的发明应用，提高了临床器官移植的成功率[6]，但长期使用有许多副作用[7]。1990年Posselt[8]在实验中将Lewis大鼠的胰岛移植到WF大鼠的不同部位，移植前14天受体腹腔注射ALS 1ml，结果发现ALS能延长移植胰岛的存活。ALS治疗后胸腺部位接受移植的受体大鼠长期存活(>200天)，移植胰岛功能良好，并且再次在肾被膜下移植同品系供体胰岛后未发生排斥反应。Posselt认为通过胸腺内移植联合一次性ALS治疗能诱导对供体的免疫耐受。此后Remuzzi等[9～11]报道了通过胸腺内预注射异基因细胞联合短期免疫治疗，在大鼠肾、心、肝、小肠等单一器官移植模型中成功诱导免疫耐受。本实验首次将胸腺内预注射异基因脾细胞联合一次性ALS治疗用于大鼠心脏肺叶联合移植模型。实验中发现经该方案处理的B组大鼠移植后长期存活，对照组A组移植后发生排斥，而胸腺内注射第三品系大鼠脾细胞的C组移植后也发生排斥现象。本实验证实了胸腺是新的免疫特惠器官的发现，通过胸腺途径能诱导免疫耐受，具有供体特异性，但无器官特异性，心脏和肺叶均不被排斥。胸腺内预注射异基因诱导特异性免疫耐受现象的机制尚未完全明了，对其机制的研究和阐明将促进临床器官移植的发展。有学者推测可能包括克隆清除、克隆受抑或无能状态和免疫抑制细胞的产生等[1，2，8，9，12]。
, http://www.100md.com
ALS能溶解外周血中的成熟T淋巴和B淋巴细胞，延长移植物存活时间[13]。胸腺是培育形成各类不同特性T细胞的免疫器官。由于存在血―胸腺屏障，抗原异物不能进入胸腺内，胸腺内的异物抗原也不能外渗到血循环中，成熟T细胞很少到胸腺内，使进入胸腺内的异基因脾细胞能逃避免疫监视而长期存活。根据克隆选择学说，移植物抗原激活的同种特异性免疫克隆的扩增将导致移植排斥反应。异基因细胞进入胸腺后改变了胸腺内微环境，干扰干细胞的分化发育，使针对该种基因的免疫细胞克隆清除而无法扩增，但是仍保留其他免疫活性细胞克隆，新一代成熟T细胞视异基因抗原为自身抗原，由此产生免疫耐受，并具有抗原特异性即供体特异性，但无器官特异性。
参考文献
[1] Goss JA, et al. Transplant Proc 1992；24：2879.
[2] Kline G, et al. J Heart Lung Transplant 1993；12：388.
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[3] Shen Z, et al. J Thorac Cardiovasc Surg 1994；107：
1472.
[4] Lee S, et al. Transplantation 1982;33：438.
[5] Fox U, et al. J Microsurg 1980；1：377.
[6] Bach FH, et al. N Engl J Med 1987；318：492.
[7] Walker RG, et al. Kidney Transplantation. Philadel-
phia: Saunders, 1988;319.
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[8] Posselt AM, et al. Science 1990；249：1293.
[9] Remuzzi G, et al. Lancet 1991；337：750.
[10] Odorico JS, et al. Surgery 1992；112：370.
[11] Kamada N. Semin Liver Dis 1992；12：1.
[12] Nakafusa Y, et al. Transplant Proc 1995；27(1)：128.
[13] 林飞卿，等.医学基础免疫学.上海：上海医科大学出版社，1990；189.
(1998年7月29日收稿 同年11月4日修回), http://www.100md.com