灵芝体外抗肿瘤成分的提取与分离△
作者：杨新林 赵东旭 王利波 朱鹤孙 徐建兰
单位：杨新林 赵东旭 王利波 朱鹤孙 北京理工大学材料科学研究中心 100081 徐建兰 中国无锡三联高科技开发公司
关键词：
灵芝体外抗肿瘤成分的提取与分离 灵芝作为一种重要的传统滋补中药，现代医学对其有效化学成分的分析、药理及临床应用研究已经取得了较大进展[1～3]。动物实验表明，灵芝多糖可明显提高机体免疫功能，从而抑制S-180肉瘤、Lewis肺癌和结肠癌等多种肿瘤生长[4，5]。最近，我们发现灵芝孢子醇提物能够抑制体外培养的人子宫癌HeLa细胞的生长[6]，灵芝子实体醇提物亦有相似的作用(待发表资料)，表明灵芝中含有体外抗肿瘤成分。笔者报道这些抗肿瘤成分的提取及初步分离。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 材料：灵芝子实体由北京同仁堂饮片厂生产，干燥捣碎成粉。破壁灵芝孢子粉由中国无锡三联高科技开发公司提供。用乙醇提取3次，减压浓缩成浸膏备用。
1.2 不同溶剂的提取效果：取灵芝子实体粉和破壁孢子粉各2份，分别用乙醇和氯仿浸泡提取，减压蒸干后都用乙醇溶解，然后进行细胞毒性检测。
1.3 温度影响：取子实体浸膏分成两组。一组用纯乙醇溶解，另一组用50%乙醇水溶液溶解并离心去除沉淀。分别置于70℃～100℃保温1 h后，减压蒸干，用乙醇溶解，进行细胞毒性检测。
1.4 活性成分的初步分离：子实体浸膏分成4组，3组分别用二甲亚砜、石油醚和氯仿溶提，所得溶解与不溶部分都用乙醇再次溶解。第4组先用氯仿溶提，溶解部分再用饱和NaHCO3萃取4次，萃取液于0℃用6 mol/L HCl调至pH 3～4，得沉淀；用时收集氯仿层蒸干，两者再溶于乙醇。以上各液进行细胞毒性检测。
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1.5 硅胶柱层析分析：经过上述初步分离的样品采用柱层析进一步分离。以GF254型硅胶(山东省烟台市化学工业研究所生产)作柱填料，氯仿-甲醇为洗脱系统。氯仿-甲醇的洗脱比例为100∶0、98∶2、95∶5、80∶20以及0∶100，各为300 mL，每100 mL收集1份。各收集部分经减压蒸干后分别用乙醇溶解，然后进行活性检测。
1.6 体外抗肿瘤活性检测：各种提取液的体外抗肿瘤活性检测方法参考作者以前论文[6]。指数生长期的HeLa细胞用含15%小牛血清的DMEM培养基(SIGMA)接种于96孔培养板上，每孔约105个细胞，24 h后换用含提取液的无血清培养基继续培养，以乙醇为对照。每隔24 h在倒置显微镜下观察细胞生长状况，连续观察72 h。以各液对HeLa细胞的毒害程度作为衡量其体外抗肿瘤活性大小的指标。
2 结果与讨论
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2.1 不同溶剂对灵芝子实体及孢子中体外抗肿瘤活性的提取效果：乙醇和氯仿是提取中草药有效成分时常用的2种不同极性的有机溶剂。我们比较了它们用于提取灵芝中体外抗肿瘤活性的效果。结果表明，无论是灵芝子实体还是孢子，其乙醇溶提液中的活性均高于氯仿溶提液。同时，孢子醇提液的活性高于子实体。
2.2 温度对灵芝体外抗肿瘤活性的影响：实验中减压浓缩采用的温度一般为40℃～50℃。为了确定体外抗肿瘤活性成分在该温度以上的稳定性，我们检测了70℃～100℃对活性的影响。由于乙醇的沸点低于80℃，我们将灵芝子实体乙醇浸膏分别溶于纯乙醇和50%乙醇水溶液，二者分别保温至80℃和100℃。结果表明，在该温度范围内，活性并未损失，表明对温度非常稳定。
2.3 灵芝子实体醇提液的初步分离：灵芝子实体乙醇浸膏分别用石油醚和氯仿溶提，活性成分存在于石油醚的不溶部分和氯仿可溶部分。后者又经饱和NaHCO3萃取，萃取液(主要含有灵芝酸A、B等酸性杂质[8])活性极低，活性成分存在萃取后的残液中。
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2.4 灵芝中抗肿瘤成分的硅胶柱层析分析：先用氯仿与甲醇进行两步洗脱，发现氯仿洗脱下来的组分不具有活性，甲醇洗脱组分中含有高的活性。在此基础上，用不同浓度比的氯仿-甲醇洗脱并分步收集，结果表明，在本实验采用的硅胶柱层析及洗脱系统中，活性成分集中在氯仿-甲醇比为98∶2～80∶20部分，而且成分不止一种，极性有强弱之分。目前我们正在将各活性组分进一步纯化，得到纯化合物进行结构测定与分析，为相关抗肿瘤药物的分子设计提供有用的参考。
参考文献
1 章灵华，等.西北药学杂志，1993，8(1)：31
2 韩玉复，等.中药材，1995，18(5)：266
3 王芳生，等.药学学报，1996，31(3)：200
4 Sone Y, et al. Agric Bio Chem，1985，49(9)：2641
5 闵三弟，等.食用菌学报，1996，3(1)：21
6 Yang Xinlin, et al. J Beijing Institute of Technology, 1997，6(4)：336
7 Kubota T, et al. Helv Chim Acta, 1982,65(2)：611
收稿日期：1998-08-20, 百拇医药
单位：杨新林 赵东旭 王利波 朱鹤孙 北京理工大学材料科学研究中心 100081 徐建兰 中国无锡三联高科技开发公司
关键词：
灵芝体外抗肿瘤成分的提取与分离 灵芝作为一种重要的传统滋补中药，现代医学对其有效化学成分的分析、药理及临床应用研究已经取得了较大进展[1～3]。动物实验表明，灵芝多糖可明显提高机体免疫功能，从而抑制S-180肉瘤、Lewis肺癌和结肠癌等多种肿瘤生长[4，5]。最近，我们发现灵芝孢子醇提物能够抑制体外培养的人子宫癌HeLa细胞的生长[6]，灵芝子实体醇提物亦有相似的作用(待发表资料)，表明灵芝中含有体外抗肿瘤成分。笔者报道这些抗肿瘤成分的提取及初步分离。
1 材料与方法
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1.1 材料：灵芝子实体由北京同仁堂饮片厂生产，干燥捣碎成粉。破壁灵芝孢子粉由中国无锡三联高科技开发公司提供。用乙醇提取3次，减压浓缩成浸膏备用。
1.2 不同溶剂的提取效果：取灵芝子实体粉和破壁孢子粉各2份，分别用乙醇和氯仿浸泡提取，减压蒸干后都用乙醇溶解，然后进行细胞毒性检测。
1.3 温度影响：取子实体浸膏分成两组。一组用纯乙醇溶解，另一组用50%乙醇水溶液溶解并离心去除沉淀。分别置于70℃～100℃保温1 h后，减压蒸干，用乙醇溶解，进行细胞毒性检测。
1.4 活性成分的初步分离：子实体浸膏分成4组，3组分别用二甲亚砜、石油醚和氯仿溶提，所得溶解与不溶部分都用乙醇再次溶解。第4组先用氯仿溶提，溶解部分再用饱和NaHCO3萃取4次，萃取液于0℃用6 mol/L HCl调至pH 3～4，得沉淀；用时收集氯仿层蒸干，两者再溶于乙醇。以上各液进行细胞毒性检测。
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1.5 硅胶柱层析分析：经过上述初步分离的样品采用柱层析进一步分离。以GF254型硅胶(山东省烟台市化学工业研究所生产)作柱填料，氯仿-甲醇为洗脱系统。氯仿-甲醇的洗脱比例为100∶0、98∶2、95∶5、80∶20以及0∶100，各为300 mL，每100 mL收集1份。各收集部分经减压蒸干后分别用乙醇溶解，然后进行活性检测。
1.6 体外抗肿瘤活性检测：各种提取液的体外抗肿瘤活性检测方法参考作者以前论文[6]。指数生长期的HeLa细胞用含15%小牛血清的DMEM培养基(SIGMA)接种于96孔培养板上，每孔约105个细胞，24 h后换用含提取液的无血清培养基继续培养，以乙醇为对照。每隔24 h在倒置显微镜下观察细胞生长状况，连续观察72 h。以各液对HeLa细胞的毒害程度作为衡量其体外抗肿瘤活性大小的指标。
2 结果与讨论
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2.1 不同溶剂对灵芝子实体及孢子中体外抗肿瘤活性的提取效果：乙醇和氯仿是提取中草药有效成分时常用的2种不同极性的有机溶剂。我们比较了它们用于提取灵芝中体外抗肿瘤活性的效果。结果表明，无论是灵芝子实体还是孢子，其乙醇溶提液中的活性均高于氯仿溶提液。同时，孢子醇提液的活性高于子实体。
2.2 温度对灵芝体外抗肿瘤活性的影响：实验中减压浓缩采用的温度一般为40℃～50℃。为了确定体外抗肿瘤活性成分在该温度以上的稳定性，我们检测了70℃～100℃对活性的影响。由于乙醇的沸点低于80℃，我们将灵芝子实体乙醇浸膏分别溶于纯乙醇和50%乙醇水溶液，二者分别保温至80℃和100℃。结果表明，在该温度范围内，活性并未损失，表明对温度非常稳定。
2.3 灵芝子实体醇提液的初步分离：灵芝子实体乙醇浸膏分别用石油醚和氯仿溶提，活性成分存在于石油醚的不溶部分和氯仿可溶部分。后者又经饱和NaHCO3萃取，萃取液(主要含有灵芝酸A、B等酸性杂质[8])活性极低，活性成分存在萃取后的残液中。
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2.4 灵芝中抗肿瘤成分的硅胶柱层析分析：先用氯仿与甲醇进行两步洗脱，发现氯仿洗脱下来的组分不具有活性，甲醇洗脱组分中含有高的活性。在此基础上，用不同浓度比的氯仿-甲醇洗脱并分步收集，结果表明，在本实验采用的硅胶柱层析及洗脱系统中，活性成分集中在氯仿-甲醇比为98∶2～80∶20部分，而且成分不止一种，极性有强弱之分。目前我们正在将各活性组分进一步纯化，得到纯化合物进行结构测定与分析，为相关抗肿瘤药物的分子设计提供有用的参考。
参考文献
1 章灵华，等.西北药学杂志，1993，8(1)：31
2 韩玉复，等.中药材，1995，18(5)：266
3 王芳生，等.药学学报，1996，31(3)：200
4 Sone Y, et al. Agric Bio Chem，1985，49(9)：2641
5 闵三弟，等.食用菌学报，1996，3(1)：21
6 Yang Xinlin, et al. J Beijing Institute of Technology, 1997，6(4)：336
7 Kubota T, et al. Helv Chim Acta, 1982,65(2)：611
收稿日期：1998-08-20, 百拇医药